趙東永

(漯河市第二人民醫(yī)院 藥劑科，河南 漯河462000)

胰島素抵抗［1］是指機(jī)體對(duì)胰島素的敏感性降低，為維持機(jī)體正常運(yùn)作，需要代償性分泌更多的胰島素，以致高胰島素血癥。改善胰島素抵抗對(duì)糖尿病的治療具有至關(guān)重要的意義，研究證明糖尿病與炎癥有密切的關(guān)系。魚(yú)腥草，又名折耳根，屬雙子葉植物三白草科蕺菜，屬性微寒、味辛，為傳統(tǒng)的清熱解毒中藥，具有化痰消癰，利尿通淋的作用［2］。其抗炎作用已被大量研究證明，本課題旨在利用二者在炎癥上的結(jié)合點(diǎn)，研究魚(yú)腥草改善胰島素抵抗作用。

1 材料與儀器

1.1 動(dòng)物 ICR 孕鼠，SPF 級(jí)，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物合格證號(hào):0307899。

1.2 藥品和試劑 魚(yú)腥草購(gòu)自安徽亳州永剛飲片廠，批號(hào):201205240。L -谷氨酸鈉，鄭州康源化工產(chǎn)品有限公司，批號(hào):20131125。鹽酸吡格列酮，河南輔仁藥業(yè)有限公司，批號(hào):J 20120115。胰島素注射液，江蘇萬(wàn)邦生化醫(yī)藥有限公司，批號(hào):1209208。葡萄糖注射液:購(gòu)自武漢福星生物藥業(yè)有限公司，批號(hào):E13081604

1.3 儀器 Spectra Mr 型全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀，美國(guó)DYNEX 公司。2 -16PK 高速冷凍離心機(jī)，美國(guó)Sigma 公司。HNY-100D 臺(tái)式恒溫振蕩器，常州諾基儀器有限公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物造模 L -谷氨酸鈉肥胖型胰島素抵抗模型的建立:ICR 乳鼠從出生第2 天起，皮下注射L-谷氨酸鈉，給藥劑量為6 g·kg-1，連續(xù)注射1 周，正常喂養(yǎng)4 個(gè)月左右時(shí)，小鼠出現(xiàn)明顯的向心性肥胖特征，檢測(cè)胰島素耐量，葡萄糖耐量及甘油三酯水平，結(jié)合體重和相關(guān)炎癥指標(biāo)，篩選合格的模型用于實(shí)驗(yàn)。

2.2 分組及給藥 將動(dòng)物隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、吡格列酮對(duì)照組和魚(yú)腥草高、中、低劑量組，每組10 只。正常對(duì)照組及模型對(duì)照組每天灌胃給予蒸餾水10 mL·kg-1，吡格列酮組灌胃給予吡格列酮3 mg·kg-1，魚(yú)腥草高、中、低劑量組分別灌胃給予魚(yú)腥草8 000 mg·kg-1、4 000 mg·kg-1、1 000 mg·kg-1。每天給藥1 次，連續(xù)給藥1個(gè)月。

2.3 指標(biāo)檢測(cè) 胰島素耐量:給藥1 個(gè)月后，將動(dòng)物禁食2 h，稱重、給藥，給藥后4 h，尾靜脈取血(0 min)，然后皮下注射胰島素0.4 IU·kg-1，注射后40 min 和90 min 再次取血。

葡萄糖耐量:給藥1 個(gè)月后，將動(dòng)物禁食1 h，給藥后4 h 尾靜脈取0 時(shí)血(0 min)，然后灌胃葡萄糖，劑量為2 g·kg-1。分別于糖負(fù)荷后30 min、60 min、120 min 取血。測(cè)各時(shí)間點(diǎn)血糖水平和0 min時(shí)血中膽固醇、甘油三酯水平。

葡萄糖測(cè)定:采用葡萄糖氧化酶法。每只小鼠取血10 μl 注入裝有40 μl 肝素鈉-氯化鈉溶液的離心管中，血樣以3 000 rpm 速度，離心10 min，取上清液10 μl，加入到裝有90 μl 葡萄糖氧化酶的96 孔板中，在37 ℃孵育40 min，在505 nm 處測(cè)定OD值，依據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行血糖測(cè)定。

炎癥因子測(cè)定:ELISA 法分別測(cè)定TNF -α、白介素水平(IL -1、IL -6)，依據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 所有數(shù)據(jù)以均數(shù)(Means)±(SD)標(biāo)準(zhǔn)差表示，進(jìn)行單因素方差分析(One -Way ANVOA)及LSD-t 組間多重比較檢驗(yàn)，以P ＜0.05作為差異顯著性標(biāo)準(zhǔn)。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 魚(yú)腥草對(duì)糖尿病小鼠胰島素耐量的影響 如圖1，與正常對(duì)照組對(duì)比，模型對(duì)照組的空腹血糖明顯升高，胰島素耐量(40 min 血糖降低百分率)明顯下降，說(shuō)明模型具有明顯的胰島素抵抗。與模型對(duì)照組相比，吡格列酮組的空腹血糖明顯降低，胰島素耐量明顯提高，胰島素抵抗得到了明顯改善，魚(yú)腥草高、中、低劑量組的空腹血糖均明顯降低，高、中劑量組胰島素耐量明顯提高，低劑量組無(wú)明顯變化，表明魚(yú)腥草高、中劑量組的胰島素抵抗得到了明顯改善。

圖1 魚(yú)腥草對(duì)糖尿病小鼠胰島素耐量的影響

3.2 魚(yú)腥草對(duì)糖尿病小鼠葡萄糖耐量的影響 如圖2。給藥1 個(gè)月后，與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組的空腹血糖明顯升高，糖負(fù)荷后30 min 血糖升高率明顯增大，60 min 后血糖濃度仍然較高，表明模型組有明顯的胰島素抵抗。與模型組比較，吡格列酮組空腹血糖明顯降低，糖負(fù)荷后30 min 血糖升高率明顯降低，魚(yú)腥草高劑量組空腹血糖明顯降低，30 min 血糖升高率也明顯降低，60 min 后血糖水平接近空腹血糖水平，魚(yú)腥草中、低劑量組空腹水平降低不明顯，但30 min 后血糖升高率均明顯降低，由此可得出，魚(yú)腥草高、中、低劑量組均有改善糖尿病小鼠胰島素抵抗的作用，其中魚(yú)腥草高劑量組作用最明顯。

3.3 魚(yú)腥草對(duì)糖尿病小鼠炎癥水平的影響 如表3，與正常對(duì)照組相比，模型對(duì)照組的促炎因子IL -6、IL-8、TNF -α 均有明顯升高，抗炎因子IL -10有明顯降低，表明糖尿病模型小鼠有明顯的炎癥。與模型對(duì)照組對(duì)比，吡格列酮組的炎癥指標(biāo)沒(méi)有明顯變化，表明吡格列酮可能是通過(guò)其他途徑達(dá)到改善胰島素抵抗的作用。與模型對(duì)照組對(duì)比，魚(yú)腥草高、中劑量組的IL -6、IL -8、TNF -α 均有明顯升高，IL-10 有明顯降低，魚(yú)腥草低劑量組的IL -8 有明顯升高，其他指標(biāo)沒(méi)有明顯變化，表明魚(yú)腥草高、中劑量組有明顯的抗炎作用。

圖2 魚(yú)腥草對(duì)糖尿病小鼠葡萄糖耐量的影響(Means±SD)

4 討論

近年來(lái)，糖尿病“炎癥學(xué)說(shuō)”被越來(lái)越多的研究證實(shí)，從“抗炎”著手，控制炎癥的發(fā)生和發(fā)展可能成為2 型糖尿病和胰島素抵抗治療的新靶點(diǎn)。糖尿病的動(dòng)物模型建立方法有很多種，本課題采用藥物誘導(dǎo)方法，即新生乳鼠皮下注射L -谷氨酸鈉。此方法的依據(jù)是L-谷氨酸鈉可以破壞小鼠下丘腦弓狀核，使小鼠的自身分泌代謝系統(tǒng)發(fā)生紊亂，小鼠成長(zhǎng)過(guò)程中將逐漸表現(xiàn)出向心性肥胖特征，肥胖可引起慢性炎癥，脂肪細(xì)胞內(nèi)大量脂質(zhì)堆積，可以激活炎癥信號(hào)通路，從而導(dǎo)致胰島素抵抗，此方法符合現(xiàn)代糖尿病患者的發(fā)病機(jī)制［4-5］。本實(shí)驗(yàn)所建模型出現(xiàn)明顯的胰島素抵抗特征，炎癥水平明顯高于正常小鼠。

表1 魚(yú)腥草對(duì)糖尿病小鼠炎癥水平的影響(n=10， ±s)

表1 魚(yú)腥草對(duì)糖尿病小鼠炎癥水平的影響(n=10， ±s)

注:與正常對(duì)照組相比，1)P ＜0.05，2)P ＜0.01;與模型對(duì)照組對(duì)比，3)P ＜0.05，4)P ＜0.01。

組別炎癥因子IL-6(c/ng·L -1) IL-8(c/ng·L -1) IL-10(c/ng·L -1) TNF-α(c/ng·L -1)正常對(duì)照組 52.43 ±4.54 23.45 ±2.25 20.89 ±0.82 19.38 ±1.44模型對(duì)照組 104.35 ±11.222) 67.78 ±7.942) 10.64 ±4.591) 45.66 ±3.881)吡格列酮組 89.98 ±5.66 65.44 ±5.20 18.77 ±9.543) 40.39 ±2.09魚(yú)腥草高劑量組 59.33 ±7.044) 30.09 ±6.763) 132.11 ±20.093) 24.33 ±2.134)魚(yú)腥草中劑量組 72.77 ±10.813) 45.68 ±10.923) 98.78 ±12.234) 31.37 ±0.993)魚(yú)腥草低劑量組 90.09 ±8.31 49.55 ±6.793)35.66 ±5.58 42.79 ±5.69

魚(yú)腥草作為清熱解毒類中藥的代表藥，抗炎作用明顯。參與炎癥反應(yīng)的細(xì)胞因子主要有TNF -α、白介素水平(IL-6、IL-8、IL-10)等［6］，其中TNFα、IL-6 和IL -8 為致炎因子，IL -10 等為抗炎因子［7］。已有研究證實(shí)［8］，這些炎癥因子與糖尿病及其并發(fā)癥密切相關(guān)。IL -1 和IL -6 是能量代謝的重要調(diào)節(jié)因子，可通過(guò)控制凋亡調(diào)節(jié)脂肪代謝。TNF-α 由體內(nèi)的單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等多種細(xì)胞產(chǎn)生，介導(dǎo)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)等多方面效應(yīng)［9］。其是細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)中的一個(gè)重要組成成員，其在胰島素抵抗的病理發(fā)生發(fā)展過(guò)程中也起到重要作用［10］，但TNF-α 引起胰島素抵抗的途徑和機(jī)制還待進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)中糖尿病小鼠灌胃魚(yú)腥草1個(gè)月后，胰島素耐量和葡萄糖耐量明顯升高，胰島素抵抗得到明顯改善，致炎因子濃度明顯降低，抗炎因子濃度升高，炎癥水平明顯下降，由此推斷魚(yú)腥草改善胰島素抵抗作用可能與其抗炎作用有關(guān)。

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