王 策

(南陽(yáng)醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，河南 南陽(yáng)473000)

心肌缺血再灌注損傷是臨床心血管科常見(jiàn)病理現(xiàn)象，常發(fā)生于溶栓治療、冠狀動(dòng)脈介入治療、冠狀動(dòng)脈支架植入、冠狀動(dòng)脈搭橋術(shù)等疾病過(guò)程中。心肌缺血再灌注發(fā)生后會(huì)產(chǎn)生缺氧復(fù)氧再損傷。蘿卜硫素(Sulforaphane)，又稱(chēng)“萊菔硫烷”，在西蘭花、芥藍(lán)、北方圓紅蘿卜等十字花科植物中含量較豐富，是常見(jiàn)的抗氧化劑。現(xiàn)代藥理研究表明蘿卜硫素具有良好的抗氧化、抗腫瘤作用［1］。曲震理［2］報(bào)道了蘿卜硫素具有良好的抗體外培養(yǎng)心肌細(xì)胞凋亡的作用。關(guān)于蘿卜硫素對(duì)在體大鼠心肌缺血再灌注氧化損傷的影響，國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)少見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)建立大鼠心肌缺血再灌注模型，以心肌酶學(xué)、心肌細(xì)胞凋亡及凋亡基因表達(dá)為觀(guān)察指標(biāo)，研究蘿卜硫素對(duì)心肌缺血再灌注損傷的影響，以期為心肌缺血再灌注損傷干預(yù)開(kāi)辟新的途徑。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 27 只SDF 級(jí)雄性SD 大鼠購(gòu)自河南省動(dòng)物試驗(yàn)中心，6 ～7 周齡，重量0.225 ～0.260 kg，證書(shū)編號(hào)SCXC(豫)2012 -0003。

1.2 藥物和試劑 蘿卜硫素(購(gòu)自上海百士凱科技公司，純度＞95%);TUNEL 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(綠色熒光)、抗熒光淬滅封片液(購(gòu)自北京中杉科技有限公司);Bcl-2、Bax 試劑盒(購(gòu)自大連寶生物工程有限公司)等。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 BL -420E + 生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司);OLYMPUS 熒光顯微鏡(日本OLYMPUS 公司);7020 全自動(dòng)生化分析儀(日本日立公司)等。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組及造模 27 只SD 大鼠以普通飼料分籠喂養(yǎng)，適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d 后，隨機(jī)分為假手術(shù)組、對(duì)照組、蘿卜硫素組，每組9 只。在冠狀動(dòng)脈左室支結(jié)扎前2 h，蘿卜硫素組自尾靜脈注射蘿卜硫素(5 mg/kg)，假手術(shù)組和對(duì)照組術(shù)前2 h 自尾靜脈注射等量生理鹽水。參照文獻(xiàn)方法制作大鼠心肌缺血再灌注模型［3］。稱(chēng)重，以5%水合氯醛(200 mg/kg)進(jìn)行腹腔麻醉后仰臥位固定于小動(dòng)物解剖臺(tái)上，常規(guī)氣管插管及開(kāi)胸，完全暴露心臟，以5 -0 號(hào)手術(shù)線(xiàn)結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左室支，結(jié)扎后心肌顏色先變白而后變紫紺提示結(jié)扎成功。假手術(shù)組冠狀動(dòng)脈左室支只穿線(xiàn)不結(jié)扎，其余2 組行缺血再灌注。結(jié)扎20 min后松解結(jié)扎線(xiàn)，再灌注1 h。再灌注1 h 后采血并處死大鼠，迅速取出心臟。血液以3 000 r/min 離心10 min 取血清，分離血清用于檢測(cè)LDH、CK-MB、SOD活性及MDA 含量;同時(shí)取部分心肌組織常規(guī)固定、包埋和制片，用于檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡和Bcl -2、Bax表達(dá)。

1.5 檢測(cè)指標(biāo) ①心肌抗氧化指標(biāo)檢測(cè) 用7020全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)LDH、CK-MB、SOD 活性及MDA 含量。②心肌凋亡細(xì)胞檢測(cè) 操作步驟按照TUNEL 試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，DAB 顯色，用熒光顯微鏡觀(guān)察:未凋亡心肌細(xì)胞發(fā)出藍(lán)色熒光，凋亡心肌細(xì)胞核發(fā)出綠色熒光。在200 倍視野下，隨機(jī)選擇缺血區(qū)5 個(gè)無(wú)重疊視野，計(jì)數(shù)陽(yáng)性凋亡細(xì)胞，計(jì)算心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)，AI =陽(yáng)性凋亡細(xì)胞/總細(xì)胞數(shù)×100%。③心肌組織Bcl-2、Bax 表達(dá)檢測(cè) 按照Bcl-2、Bax 試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 測(cè)量數(shù)據(jù)用SPSS 13.0 軟件包處理，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x ±s)表示，采用t檢驗(yàn)，P ＜0.05 表示有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 抗氧化指標(biāo)檢測(cè) 與假手術(shù)組比較，對(duì)照組大鼠血清LDH、CK-MB 及MDA 含量顯著升高，SOD活性顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05);相比對(duì)照組，蘿卜硫素干預(yù)可以顯著降低血清中LDH、CK-MB 活性及MDA 含量(P ＜0.05)，顯著升高血清中SOD 活性(P ＜0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠血清抗氧化指標(biāo)及心肌凋亡指數(shù)比較(n=9， ±s)

表1 各組大鼠血清抗氧化指標(biāo)及心肌凋亡指數(shù)比較(n=9， ±s)

注:與假手術(shù)組比，1)P ＜0.05;與對(duì)照組比，2)P ＜0.05。

組別 SOD(U/mL) LDH(U/mL) CK-MB(U/mL) MDA(c/nmol·mL -1)AI/%假手術(shù)組 146.35 ±7.16 2.15 ±1.02 0.76 ±0.28 2.26 ±0.82 2.35 ±0.96對(duì)照組 87.21 ±3.861) 7.71 ±1.261) 6.28 ±1.191) 4.81 ±0.151) 20.05 ±1.161)蘿卜硫素組 118.19 ±6.612) 5.38 ±1.172) 2.27 ±1.212) 3.15 ±1.082) 15.76 ±2.152)

2.2 心肌細(xì)胞凋亡檢測(cè) 心肌組織切片經(jīng)熒光染色處理后，在熒光顯微鏡下可看到正常心肌細(xì)胞核呈藍(lán)色熒光，著色淺而均勻;凋亡細(xì)胞核固縮，或碎為不規(guī)則狀，呈現(xiàn)綠色明亮的強(qiáng)熒光反應(yīng)。見(jiàn)圖1。假手術(shù)組可見(jiàn)有少量散在的綠色熒光染色細(xì)胞核，對(duì)照組綠色熒光染色細(xì)胞數(shù)量明顯增多，蘿卜硫素干預(yù)組綠色熒光染色細(xì)胞較對(duì)照組明顯減少，提示大鼠經(jīng)蘿卜硫素干預(yù)后心肌凋亡細(xì)胞明顯減少。與假手術(shù)組比較，對(duì)照組大鼠凋亡指數(shù)顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05);與對(duì)照組比，蘿卜硫素干預(yù)組凋亡指數(shù)顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)，見(jiàn)表1。

圖1 各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡熒光染色結(jié)果×200 白色箭頭所示為凋亡細(xì)胞。

2.3 心肌Bcl -2、Bax 表達(dá)檢測(cè) 與假手術(shù)組比，對(duì)照組Bcl-2 表達(dá)下降，Bax 表達(dá)上升，Bcl-2/Bax比值下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05);與對(duì)照組比較，蘿卜硫素干預(yù)組Bcl -2 表達(dá)上升，Bax 表達(dá)下降，Bcl -2/Bax 比值上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)表2

表2 各組大鼠心肌凋亡蛋白Bcl-2、Bax mRNA表達(dá)比較(n=9， ±s)

表2 各組大鼠心肌凋亡蛋白Bcl-2、Bax mRNA表達(dá)比較(n=9， ±s)

注:與假手術(shù)組比，1)P ＜0.05;與對(duì)照組比，2)P ＜0.05。

組別Bcl-2mRNA BaxmRNA Bcl-2/Bax假手術(shù)組1.58 ±0.02 0.45 ±0.03 3.41 ±0.02對(duì)照組 0.69 ±0.051) 0.93 ±0.051) 0.67 ±0.061)蘿卜硫素組 0.87 ±0.022) 0.76 ±0.032) 1.21 ±0.042)

3 討論

缺血再灌注損傷的發(fā)生機(jī)制尚未清楚。國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者［4-5］認(rèn)為再灌注損傷伴隨出現(xiàn)炎癥反應(yīng)，由于細(xì)胞浸潤(rùn)，釋放炎癥因子，最終導(dǎo)致血管的內(nèi)皮細(xì)胞損傷，并伴隨鈣超載等。心肌發(fā)生缺血再灌注損傷時(shí)，氧自由基和內(nèi)源性氧自由基清除酶之間失去平衡，前者大量出現(xiàn)，攻擊細(xì)胞，引發(fā)脂質(zhì)超氧化反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞損傷，隨之使MDA 釋放，血清含量增加，因此MDA 含量可以體現(xiàn)超氧化反應(yīng)的程度，也是對(duì)細(xì)胞受損程度的一種間接體現(xiàn)。該研究顯示，對(duì)照組血清MDA 含量明顯增加(P ＜0.05)，說(shuō)明再灌注導(dǎo)致細(xì)胞損傷。同時(shí)蘿卜硫素干預(yù)組血清MDA、LDH 及CK - MB 活性 均 顯 著降 低(P ＜0.05)，血清中SOD 活性顯著升高(P ＜0.05)，提示蘿卜硫素預(yù)處理具有明顯的抗脂質(zhì)氧化作用。

缺血再灌注后心肌損傷主要表現(xiàn)形式是細(xì)胞凋亡。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，蘿卜硫素組可降低心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)(P ＜0.05)，上調(diào)凋亡基因Bcl -2 的表達(dá)，降低Bax 的表達(dá)，使Bcl-2/Bax 比值上升，提示蘿卜硫素提前干預(yù)對(duì)缺血再灌注所致大鼠心肌細(xì)胞凋亡具有保護(hù)作用，與伊雪［6］等的結(jié)果一致。

綜上所述，蘿卜硫素能通過(guò)抗脂質(zhì)過(guò)氧作用減少心肌細(xì)胞凋亡，對(duì)心肌缺血再灌注損傷產(chǎn)生保護(hù)作用。

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［2］曲震理.蘿卜硫素對(duì)阿霉素所致體外培養(yǎng)心肌細(xì)胞凋亡的影響［J］.社區(qū)醫(yī)學(xué)雜志，2014，12(2):47 -48.

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