朱 敏，李 英，馬希濤

(河南省人民醫(yī)院 呼吸與危重癥科，鄭州450003)

結核性胸膜炎是一種最常見的胸膜疾病，在各種不同病因的胸腔積液中占30% ～60%，也是肺外結核病常見表現(xiàn)形式［1］。該病臨床表現(xiàn)多樣，僅依據(jù)病史、查體、影像學檢查、實驗室化驗資料和療效觀察，很難準確診斷，易誤診和漏診引起嚴重后果。診斷的金標準是胸腔積液結核分枝桿菌(mycobacterium tuberculosis pleural effusion，MTB)涂片抗酸染色陽性或培養(yǎng)陽性，但陽性率較低，且培養(yǎng)對實驗室要求高及培養(yǎng)時間較長;另外有胸膜活檢病理學檢測陽性，但其具有創(chuàng)傷性，臨床應用不普及［2］。近年來結核感染T 細胞斑點試驗(T -SPOT.TB)在診斷結核病中的作用越來越受到人們的重視，有研究報道T-SPOT.TB 對診斷結核具有較高的敏感性及特異性，優(yōu)于常規(guī)的檢查方法。本研究將胸腔積液T-SPOT.TB 檢測和傳統(tǒng)的腺苷脫氧酶(adenosine deaminase，ADA)檢測作對照，比較其對結核性胸膜炎診斷價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2013年9月—2015年3月在河南省人民醫(yī)院住院的胸腔積液患者82 名，其中男52 例，女30 例;年齡16 ～82(43.9 ±16.5)歲。剔除診斷不明確及臨床資料不完整的10例，余下72 例分為:①結核性胸膜炎組(結核組):38 例，其中男26 例，女12 例，年齡(42.1 ±17.3)歲，均經(jīng)細菌學或病理學證實。②非結核性胸膜炎組(對照組):34 例，其中男20 例，女14例，年齡(45.8 ±15.6)歲，包括:惡性胸腔積液22 例，類肺炎胸腔積液9 例，肺栓塞1 例，結締組織病2 例。入選病例排除人免疫缺陷病毒感染，無免疫抑制劑使用史。

1.2 方法 ①T -SPOT.TB 檢測:采集肝素抗凝胸腔積液50 mL，于2 h 內(nèi)用T - SPOT.TB 試劑盒(英國Oxford Immunotech 公司生產(chǎn))的說明書進行以下步驟:將胸腔積液離心后取沉渣，用淋巴細胞分離液分離胸腔積液單個核細胞，與結核特異性抗原相對分子質(zhì)量為6 000 的早期分泌抗原靶(early secretory antigenic target - 6，ESAT -6)和相對分子質(zhì)量為10 000 的培養(yǎng)濾液蛋白(culture filtrate protein 10，CFP -10)在抗γ -干擾素抗體預包被的板中共同孵育，37 ℃放置16 ～20 h。經(jīng)堿性磷酸酶偶聯(lián)的二抗和底物顯色后用酶聯(lián)免疫斑點試驗(ELISPOT)對斑點進行計數(shù)，并按照說明書的判斷標準進行結果判定?？瞻讓φ湛變?nèi)斑點數(shù)＜10，且陽性對照孔內(nèi)斑點數(shù)＞20 時視為實驗有效。當空白對照孔內(nèi)斑點數(shù)0 ～5 個，任一實驗孔斑點數(shù)減去空白對照后≥6，結果判為陽性;當空白對照孔內(nèi)斑點數(shù)6 ～10 個，任一實驗孔斑點數(shù)大于空白對照的2 倍，結果判為陽性。T -SPOT.TB 的實驗結果用每106 SEMC 中斑點形成細胞(spot forming cells，SFCs)的數(shù)目來描述，即SFCs/106SEMC。當ESAT-6 或CFP -10 有一項陽性，即判定為陽性。根據(jù)兩組T -SPOT.TB 檢測形成的斑點形成細胞(SFC)數(shù)建立受試者工作特征曲線(ROC)，根據(jù)Youden 指數(shù)確定T -SPOT.TB 診斷結核性胸膜炎的最佳臨界值。②ADA 測定:應用10 mL 抗凝玻璃管收集胸腔積液10 mL，離心后取上清液利用過氧化物酶法測定ADA，試劑為北京利德曼生化股份有限公司生產(chǎn)，嚴格按說明書操作。ADA≥45 U/L 判斷為陽性。根據(jù)兩組ADA 檢測值建立受試者工作特征曲線(ROC)，根據(jù)Youden 指數(shù)確定ADA 診斷結核性胸膜炎的最佳臨界值。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，正態(tài)分布數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差表示;非正態(tài)分布數(shù)據(jù)用中位數(shù)(四分位間距)表示，兩組間SFC 數(shù)比較用Mann Whitney U 檢驗;兩種檢測方法的敏感度和特異度比較采用Pearson χ2檢驗，P ＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組間不同抗原T -SPOT.TB 形成SFC 數(shù)量比較 SFC 數(shù)量均呈非正態(tài)分布，分別以ESAT-6 和CFP -10 作為抗原，結核組SFC 數(shù)量均顯著高于對照組，P ＜0.001 差異有統(tǒng)計學意義。見表1。

表1 兩組患者胸腔積液中不同抗原T-SPOT.TB形成SFC 數(shù)量的比較

2.2 胸腔積液中T -SPOT.TB 檢測結果 結核性胸膜炎組38 例中36 例為陽性，非結核性胸膜炎組34 例中3 例陽性。胸腔積液中T - SPOT.TB 在結核性胸膜炎診斷的敏感度為94.7%，特異度為91.2%，Youden 指數(shù)為85.9%，陽性預測值為92.3%，陰性預測值為93.9%。見表2。

2.3 胸腔積液中ADA 檢測結果 結核性胸膜炎組38 例，平均(46.3 ±7.3 )U/L ，其中30 例為陽性。非結核性胸膜炎組34 例，平均(23.5 ±7.9)U/L ，其中1 例陽性。胸腔積液中ADA 在結核性胸膜炎診斷的敏感度為78.9%，特異度為97.0%，Youden指數(shù)為76.0%，陽性預測值為96.8%，陰性預測值為80.5%。見表3。

表2 兩組患者胸腔積液中T—SPOT.TB 檢測結果比較

表3 兩組患者胸腔積液ADA 檢測結果比較

2.4 胸腔積液中T-SPOT.TB 與ADA 檢測的診斷效能 T-SPOT.TB 檢測結核性胸膜炎的敏感度與ADA 比較，差異有統(tǒng)計學意義(χ2= 4.145，P =0.042)，T-SPOT.TB 檢測結核性胸膜炎的敏感特異度與ADA 比較，差異無統(tǒng)計學意義(P =0.614)。T-SPOT.TB 檢測用于診斷結核性胸膜炎的ROC曲線下面積為0.930，95%可信區(qū)間0.86 ～0.99，當Youden 指數(shù)達到最大時，確定T-SPOT.TB 診斷結核性胸膜炎最佳臨界值為38 SFCs/106SEMC，此時診斷的敏感度為95.3%，特異度為98.7%。ADA檢測用于診斷結核性胸膜炎的ROC 曲線下面積為0.973，95%可信區(qū)間0.79 ～0.97，當Youden 指數(shù)達到最大時，確定ADA 診斷結核性胸膜炎最佳臨界值為32.5U/L，此時診斷的敏感度為94.7%，特異度為88.2%。

3 討論

結核性胸膜炎是由淋巴細胞介導為主，多種細胞及細胞因子參與的綜合病理性免疫反應。當機體感染MTB，無論是潛伏感染還是活動性結核病，均可產(chǎn)生致敏淋巴細胞，當應用外源性特異性抗原刺激外周血單個核細胞后迅速產(chǎn)生效應T 細胞，分泌γ-干擾素。ELISPOT 是近年來發(fā)展的敏感性最好的檢測抗原特異性T 淋巴細胞的技術之一。T -SPOT.TB 應用ELISPOT 技術檢測經(jīng)ESAT -6 及CFP-10 抗原刺激后分泌γ-干擾素的特異性T 細胞數(shù)量來診斷結核感染的方法。由于ESAT -6 及CFP-10 這兩種蛋白由MTB 的RD1 基因序列合成，而該基因序列僅存在于致病性MTB 之中，卡介苗和環(huán)境中的非典型分枝桿菌不含有該基因，故將ESAT-6 及CFP -10 這兩種抗原作為刺激物來進行試驗，保證了T -SPOT.TB 的高度特異性［3］。但由于外周血T-SPOT.TB 檢測不能區(qū)分潛伏感染還是活動性結核病，使診斷的特異性受到限制。然而，MTB 感染局部具有隔室化效應，感染部位的致敏T淋巴細胞增多，并顯著高于外周血。因此胸腔積液的致敏T 淋巴細胞可能受潛伏感染的機會較外周血低。在結核低流行的英國，Wilkinson KA 等首次研究［4］證實了胸水ELISPOT 檢測到分泌γ-干擾素的致敏T 淋巴細胞的可行性。而我國協(xié)和醫(yī)院張麗帆教授于2014年報道［5］胸腔積液分泌γ -干擾素的致敏T 淋巴細胞是外周血4.6 倍，以56SFCs/106 SEMC 為界能夠?qū)⒃\斷結核性胸膜炎的敏感性及特異性均提高30%。近期另一項研究結果顯示，胸腔積液T-SPOT.TB 檢測的敏感度和特異度可以達到95.7% 和100%，顯著高于ADA(55.5% 和86.3%)［6］。與本研究診斷的胸腔積液T - SPOT.TB 診斷界值相似。

ADA 是核酸分解代謝酶類，廣泛存在于人體各組織中，胸腺、脾和其他淋巴組織中含量較高，紅細胞和T 淋巴細胞內(nèi)ADA 含量最豐富。當發(fā)生結核性胸膜炎時，宿主啟動細胞免疫，胸膜的淋巴細胞明顯增多，活性增強，故ADA 在胸腔積液中含量明顯增高［7］。但在一些細菌感染和風濕性疾病引起的胸腔積液中ADA 活性也有所升高，診斷的特異度降低。尉艷霞等研究表明，ADA 診斷結核性胸膜炎最佳臨界值為28.7U/L，其診斷的敏感度為75.5%，特異度為95.2%［8］。而與本研究32.5U/L 相比，本研究診斷敏感度升高至94.7%，特異度略低。

綜上所述，對于結核性胸膜炎，胸腔積液T -SPOT.TB 具有較好的敏感度，優(yōu)于傳統(tǒng)的胸腔積液ADA 檢測，但特異度與ADA 相似。如果胸腔積液TSPOT.TB 聯(lián)合ADA 同時檢測，雖然敏感性下降，但特異度進一步升高，可以有效避免誤診。T -SPOT.TB 能否作為準確診斷結核性胸膜炎的檢測手段，還需大規(guī)模的臨床試驗證實。

［1］馬 塢.提高我國結核性胸膜炎的診治水平［J］.中國抗癆雜志，2009，31(1):1 -2.

［2］劉 菲，張霞，杜鳳嬌，等.γ -干擾素釋放試驗檢測胸腔積液對診斷結核性胸膜炎的初步探討［J］.中國結核和呼吸雜志，2014，37(5):323 -327.

［3］張麗帆，劉曉清.γ 干擾素釋放分析T-SPOT.TB 診斷結核感染臨床應用進展［J］.中國醫(yī)學科學院學報，2009，31(4):506-510.

［4］Wilkinson KA，Wilkinson RJ，Pathan A，et a1.Ex vivo characterization of early secretory antigenic target 6 -specific T cells at sites of active disease in pleural tuberculosis［J］.Clin Infect Dis，2005，40(1):184 -187.

［5］Zhang L，Zhang Y，Shi X，et al..Utility of T - cell interferon -γrelease assays for diagnosing tuberculous serositis:a prospective study in Beijing.China［J］.Plos One，2014，9(1):e85030.

［6］Liao M，Yang Q，Zhang J，et al.Gamma interferon immunospot assay of pleural effusion mononuclear cells for diagnosis of tuberculous pleurisy［J］.Clin Vaccine Immunol，2014，21:347 -353.

［7］Lamsal M，Gantam N，Bhatta N，et aL Diagnostic utility of adenosine deamianse(ADA)activity in pleural fluid and serLnll of tuberculous and noll.tubereulous respiratory disease patients［J］.Southeast Asian J Trop Med Public Health，2007，38:363 -369.

［8］尉艷霞，童朝暉，龔 娟，等.腺苷脫氨酶診斷結核性胸膜炎價值的再評價［J］.中華結核和呼吸雜志，2010，33(4):273-275.