曹慧慧，張瑞卿，石榮偉，郭曉峰，李俊蓮

（山西中醫(yī)學(xué)院，山西太原 030024）

肺癌是當(dāng)前世界各地最常見的惡性腫瘤之一，是一種嚴重威脅人類健康和生命的疾病，是全世界惡性腫瘤致死的首要因素［1］。肺癌臨床表現(xiàn)復(fù)雜，難以早期發(fā)現(xiàn)，對其綜合治療的機會變?。?］。制備一種便于推廣、成模速度快、成瘤率高的肺癌模型，有助于進一步了解肺癌的發(fā)病機理、轉(zhuǎn)移過程，尋找早期肺癌診斷的特異性指標，更有針對性地篩選治療肺癌的藥物。至今已有不少國內(nèi)外專家進行此項研究［3］，>其中裸鼠的移植成功率較高，但價格昂貴，且飼養(yǎng)條件苛刻，不便于推廣。本實驗擬采用昆明種小鼠皮下注射Lewis肺癌細胞建立肺癌模型，通過觀察其一般狀況、成瘤率以及成癌率，探討昆明種小鼠皮下注射Lewis肺癌細胞能否建立一種理想的肺癌動物模型。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 昆明種小鼠32只，清潔級，雌雄各半，5～6w齡，體重18g～20g，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗中心提供。

1.1.2 細胞 小鼠Lewis肺癌細胞株（LLC），購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細胞資源中心。

1.1.3 試劑與儀器 低速臺式離心機（型號：80-2C），二氧化碳培養(yǎng)箱（型號：ENCO2），高壓蒸汽滅菌器（型號：LMQ-R-3260B），DHG系列電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司），胎牛血清（浙江天杭生物科技有限公司，批號：131019），胰蛋白酶-EDTA消化液（北京 Solarbio 公司，批號：20131118），DMEM/HIGH GLUCOSE（1X）（HyClone公司，批號：NYJ0960）。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 小鼠Lewis肺癌細胞置于含有10%胎牛血清、100U/mL青霉素及100mg/L鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液中，并培養(yǎng)于5%CO2，37℃飽和濕度的培養(yǎng)箱，每3～4d進行1次傳代。傳代時取對數(shù)期生長的細胞（80%confluence）經(jīng)磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗1次，0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化后，加培養(yǎng)液中止消化并離心，棄上清液，加DMEM，吹打均勻，制成單細胞懸液，并將懸液均勻地分裝在2個培養(yǎng)瓶中，使之鋪滿培養(yǎng)液瓶底面，并在放入培養(yǎng)箱時將培養(yǎng)瓶瓶蓋擰開一圈半。

1.2.2 細胞收集 取處于對數(shù)期的細胞消化離心后棄上清液，加培養(yǎng)液并將數(shù)管細胞合入一離心管中，吹打均勻，制成單細胞懸液。

1.2.3 細胞計數(shù)與存活測試 取一滴細胞懸液與一滴臺盼藍混合均勻，用移液槍取少許置于細胞計數(shù)板上。存活測試之步驟為dye exclusion，利用染料會滲入死細胞中呈藍色，而活細胞因細胞膜完整，染料無法滲入則不會呈藍色。于低倍鏡下計數(shù)對角的兩個大方格內(nèi)活細胞總數(shù)，計算細胞濃度。細胞數(shù)量須達到1×107/mL，方能給小鼠接種。

1.2.4 細胞懸液制備 收集的細胞離心后去上清液，定量加入DMEM，輕輕吹打均勻。

1.2.5 造模方法 32只雌雄各半的昆明種小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1w，雌雄各隨機分為模型組與空白組2組，每組8只雌鼠、8只雄鼠。實驗第1天用1mL注射器于模型組每只昆明種小鼠右下腋皮下接種0.2mL（活細胞濃度1×107/mL）細胞懸液，同時于空白組小鼠相同部位注射同等劑量的生理鹽水。

1.2.6 觀測指標

1.2.6.1 一般狀況 每日觀察小鼠的精神、活動、毛色、大便等情況，每天上午8時～9時記錄每組小鼠24h進食量，并分別于第7、14、21、28天上午記錄每只小鼠體重。

1.2.6.2 成瘤率 于第7、14、21、28天觀察小鼠注射部位右腋皮下是否成瘤，按下列公式計算成瘤率。

1.2.6.3 成癌率 于第28天將小鼠摘眼球處死，將小鼠的肺組織與瘤體分離出來，保存在4%的甲醛中，并制成病理組織切片于顯微鏡下觀察。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 一般情況

精神、皮毛及活動情況：第1周被接種的模型組小鼠尚無明顯改變。第2周模型組小鼠精神漸差，活動減少，皮毛尚可。第3周、第4周模型組小鼠精神不振，活動欠佳，皮毛暗淡無光澤，大便減少。同時，空白組小鼠在4w內(nèi)精神活動正常，皮毛光澤。飲食及體重情況見表1、表2。

2.2 成瘤率

對成瘤小鼠進行瘤體分離，觀察到瘤體周圍血管豐富，并與周圍皮膚粘連，無明顯界限，不易分離。模型組小鼠第1周無瘤塊生成，第2周有7只小鼠右腋下出現(xiàn)瘤塊，第3周瘤塊增大，成瘤小鼠增至11只，第4周瘤塊增大，無新增成瘤小鼠。成瘤率為68.75%（11/16）。

2.3 肺癌形成率

將空白組與模型組小鼠的肺組織切片進行HE染色，并在光鏡下觀察。空白組小鼠肺部切片未見癌細胞。模型組小鼠中未成瘤小鼠未見癌組織，11只成瘤小鼠中均可見到癌細胞，模型組肺癌形成率為68.75%（11/16）。癌組織在光鏡下觀察：細胞核裂解，細胞體積變大，細胞形狀不規(guī)則，排列紊亂。結(jié)果見圖1。

圖1 昆明種小鼠肺癌組織病理結(jié)果（HE染色）

3 討論

實驗采用Lewis肺癌細胞致昆明種小鼠形成肺癌，體外培養(yǎng)Lewis肺癌細胞，將其植于昆明種小鼠右腋皮下，觀察其成癌率，結(jié)果昆明種小鼠腋下Lewis移植成瘤率為68.75%，肺癌形成率為68.75%。選擇腋下，因為腋部皮下移植不影響小鼠活動，易于觀察腫瘤的生長［4］；且腋下淋巴血管豐富，Lewis肺癌細胞易于轉(zhuǎn)移。選擇5～6w齡的小鼠，是因為研究發(fā)現(xiàn)在成年鼠體內(nèi)生成的腫瘤有自行消退現(xiàn)象，而在年幼的小鼠體內(nèi)接種腫瘤細胞會相對容易生成瘤塊［5］。成功率不高的原因可能與下列因素有關(guān)：在制備細胞懸液過程中，沒有注意輕柔吹打，減少細胞死亡量；給小鼠接種細胞時，沒有保障接種的數(shù)量。

表1 注射后小鼠進食量 （g，±s）

表1 注射后小鼠進食量 （g，±s）

注：與空白組比較，1）P＜0.05

組別 第1周 第2周 第3周 第4周雌雄雌雄雌雄雌雄空白組 11.19±1.23 11.45±1.06 13.43±1.05 13.67±1.42 15.91±0.94 16.08±1.83 15.52±1.05 16.51±1.98模型組 10.99±1.25 11.06±1.07 12.03±1.521） 12.62±1.231） 11.73±1.391） 12.77±1.391） 10.89±1.241） 13.34±1.141）

表2 各組動物不同時間點的體重 （g，±s）

表2 各組動物不同時間點的體重 （g，±s）

注：與空白組比較，1）P＜0.05

組別 注射前注射后第1周 第2周 第3周 第4周雌雄雌雄雌雄雌雄雌雄空白組 18.57±0.85 18.75±0.68 21.10±2.06 22.10±2.07 22.93±2.28 23.81±2.04 25.25±2.06 27.31±1.96 28.34±1.96 30.07±2.60模型組 18.66±0.68 18.71±0.66 20.00±1.101） 20.04±1.441） 20.87±1.431） 21.03±1.331） 22.58±1.661） 23.10±1.531） 23.49±1.771） 24.04±1.721）

綜上，使用昆明種小鼠注射Lewis肺癌細胞能夠成功制備肺癌模型，昆明種小鼠易于獲得、價格低，生存環(huán)境與人體相似，可作為肺癌實驗動物進行使用。但實驗周期長，成癌率有待提高，建模的具體操作仍需進一步完善。

［1］Bugiantella W，Cavazzoni E，Graziosi L，et al.Small bowel metastasis from lung cancer：a possible cause of acute abdomen.Case report and literature review［J］.G Chir，2011，32（3）：120-122.

［2］Benfield J R，Hammond W G.Bronchial and pulmonary carcinogenesis at focal sites in dogs and hamsters［J］.Cancer Res，1992，52（9）：2687-2693.

［3］余琛琳，崔淑芳.肺癌動物模型的制備與應(yīng)用［J］.中國動物實驗學(xué)報，2008，16（6）：470-474.

［4］田雪.建立移植型肺癌動物模型的最新方法和進展［J］.重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2007，32（12）：1337-1338.

［5］李春燕，王穎，劉浩，等.C57BL/6近交系小鼠Lewis肺癌動物模型：建設(shè)性描述肺癌損害程度的指標［J］.中國臨床康復(fù)，2003，26（7）：3582-3583.