杜文喜，謝 健，夏臣杰，黃杰烽，陳俊杰，段淑芳

（1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，浙江杭州 310006； 2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江杭州 310053；3.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，浙江杭州 310005）

淫羊藿苷（Icariin，ICA）是淫羊藿屬（Epimedium）植物淫羊藿莖葉中提取的總黃酮主要有效成分［1］。研究顯示，淫羊藿苷持續(xù)用藥對(duì)脊柱損傷（椎板摘除）的老鼠具有顯著性治療作用［2］。纖維環(huán)破裂、髓核膨出等引起的椎間盤(pán)退變是目前臨床脊柱患者的主要病因，而ICA是否可以延緩椎間盤(pán)退變目前尚不明了。體外培養(yǎng)纖維環(huán)細(xì)胞至3～4代開(kāi)始出現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)改變、增殖減少、細(xì)胞外基質(zhì)合成不足、細(xì)胞周期異常等退變現(xiàn)象［3-4］，有學(xué)者認(rèn)為此時(shí)的細(xì)胞可用于模擬體內(nèi)椎間盤(pán)退變模型［5］。本研究通過(guò)對(duì)椎間盤(pán)纖維環(huán)細(xì)胞體外模型持續(xù)干預(yù)，旨在評(píng)價(jià)ICA對(duì)退變期細(xì)胞的作用效果，為ICA應(yīng)用于臨床防治椎間盤(pán)退變疾病提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

新西蘭雌性大白兔10只（清潔級(jí)，體質(zhì)量2～3kg），浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2 試劑與儀器

0.25%胰蛋白酶-EDTA（Gbico）、Ⅱ型膠原酶、MTT、甲苯胺藍(lán)染液（Solarbio）、DMEM、F12培養(yǎng)液、PBS（吉諾）、胎牛血清（FBS，四季青）、DMSO（Sigma）、淫羊藿苷（ICA，中國(guó)食品藥品檢定研究院，110737-200415）、細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（碧云天）、Trizol（Invitrogen）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Promega）、培養(yǎng)箱（Thermo）、潔凈工作臺(tái)（Airtech）、倒置相差顯微鏡（Olympus）、臺(tái)式離心機(jī)、電熱恒溫水浴鍋（上海）、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板（NEST）、酶標(biāo)儀（Bio-tek）、流式細(xì)胞儀（Epics Altra）、RT-PCR 儀（Takara）等。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 纖維環(huán)細(xì)胞的分離培養(yǎng)

無(wú)菌條件下分離新西蘭大白兔椎間盤(pán)纖維環(huán)組織，置于培養(yǎng)皿中。DMEM/F12（1∶1）混合液洗 2遍后剪成1mm3的小塊，按0.1%胰蛋白酶-EDTA、0.1%Ⅱ型膠原酶37℃水浴順序消化30min、4h。消化完畢后離心（1500rpm，5min），棄上清，加入含 15%FBS的DMEM/F12（1∶1）培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液。培養(yǎng)箱（37℃、5%CO2）培養(yǎng)，2～3d換液 1次。細(xì)胞鋪滿(mǎn)單層后胰酶消化法傳第1代，細(xì)胞計(jì)數(shù)并將密度調(diào)整為105個(gè)/mL。

2.2 分組及傳代培養(yǎng)

取一部分第1代細(xì)胞作為P0組鋪板后待測(cè)；剩余細(xì)胞分為空白組（15%FBS培養(yǎng)液培養(yǎng)）與ICA組（含ICA的15%FBS培養(yǎng)液培養(yǎng)，ICA濃度10-5M），這部分細(xì)胞傳至第3代鋪板后待測(cè)。傳代過(guò)程中細(xì)胞密度均調(diào)整至105個(gè)/mL。

2.3 指標(biāo)檢測(cè)

2.3.1 甲苯胺藍(lán)染色 細(xì)胞接種48h后，貼壁細(xì)胞PBS洗2次，4%多聚甲醛4℃固定1h，蒸餾水清洗20min后2%甲苯胺藍(lán)染液浸染2h，吸去多余染液后倒置相差顯微鏡下觀察、拍照。

2.3.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖 將細(xì)胞接種于96孔板，12個(gè)復(fù)孔，每孔200μL細(xì)胞懸液。48h后向96孔板中加入20μL MTT溶液，細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育4h。小心吸除上清后滴加DMSO溶液150μL，微量振蕩器上震蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。酶標(biāo)儀490nm波長(zhǎng)測(cè)定各孔吸光度值為m，吸凈孔內(nèi)溶液再測(cè)1次為n，實(shí)際吸光度（OD值）為（m-n）。

2.3.3 RT-PCR檢測(cè)蛋白多糖（AGG）表達(dá) 細(xì)胞接種72h后，根據(jù)Invitrogen公司Trizol操作說(shuō)明書(shū)提取椎間盤(pán)纖維環(huán)細(xì)胞總RNA。然后根據(jù)Promega公司M-MLV操作說(shuō)明書(shū)將RNA逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，最后進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)。擴(kuò)增引物如表1，GAPDH為內(nèi)參照基因。最后以相對(duì)CT值（目的基因CT值/內(nèi)參基因CT值）表示結(jié)果。

表1 RT-PCR擴(kuò)增引物序列

2.3.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期 細(xì)胞接種72h后按照細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒處理，然后流式細(xì)胞儀488nm波長(zhǎng)檢測(cè)紅色熒光并進(jìn)行分析。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 甲苯胺藍(lán)染色

原代椎間盤(pán)纖維環(huán)細(xì)胞22h后開(kāi)始貼壁，4d后完全貼壁，細(xì)胞呈類(lèi)圓形見(jiàn)細(xì)小突觸或呈梭形，12d后細(xì)胞貼滿(mǎn)瓶底。甲苯胺藍(lán)染色呈易染性，細(xì)胞核呈紫色，細(xì)胞質(zhì)呈淡藍(lán)色或深藍(lán)色。如圖1所示，鏡下可見(jiàn)細(xì)胞分布均勻，空白組細(xì)胞分布最稀疏，而ICA組細(xì)胞分布密集程度接近于P0組。

圖1 椎間盤(pán)纖維環(huán)細(xì)胞甲苯胺藍(lán)染色

3.2 細(xì)胞增殖情況

經(jīng) MTT 法檢測(cè)，P0組吸光度值為（0.68±0.064），空白組吸光度值為（0.55±0.037），ICA組吸光度值為（0.64±0.028），P0組與空白組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；P0組與ICA組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。說(shuō)明隨著細(xì)胞傳代，細(xì)胞活力逐漸下降、增殖能力減弱，而ICA能夠維持椎間盤(pán)纖維環(huán)細(xì)胞增殖能力，使其接近于原代細(xì)胞。

3.3 AGG表達(dá)差異

經(jīng)RT-PCR檢測(cè)椎間盤(pán)纖維環(huán)細(xì)胞AGG表達(dá)相對(duì)CT值P0組、空白組及ICA組分別為（1.238±0.018），（1.196±0.007），（1.220±0.006）。與空白組比較，其余兩組相對(duì)CT值均顯著升高（P<0.05）；P0組與ICA組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。說(shuō)明隨著細(xì)胞傳代，椎間盤(pán)纖維環(huán)細(xì)胞分泌AGG的能力逐漸減弱，而ICA持續(xù)用藥可以使纖維環(huán)細(xì)胞的分泌能力基本與原代細(xì)胞一致。

3.4 細(xì)胞周期分布

細(xì)胞周期分布見(jiàn)圖2。

圖2 椎間盤(pán)纖維環(huán)細(xì)胞流式細(xì)胞儀測(cè)試圖

箭頭區(qū)域代表S期細(xì)胞，可見(jiàn)空白組S期細(xì)胞所占比例最少。椎間盤(pán)纖維環(huán)細(xì)胞S期細(xì)胞分布百分比P0組、空白組及ICA組分別為（8.591±0.124）%，（4.566±0.173）%，（7.187±0.699）%。與空白組比較，P0組及ICA組S期細(xì)胞分布百分比均明顯增加（P<0.05）；P0組與ICA組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。說(shuō)明ICA能夠使纖維環(huán)細(xì)胞保持接近于原代細(xì)胞的細(xì)胞分裂能力，使其不至于過(guò)早凋亡。

4 討論

纖維環(huán)是椎間盤(pán)的重要組成，水含量占60%～70%，膠原蛋白占干重的60%，蛋白多糖占干重的20%［6］。其中膠原蛋白與蛋白多糖是纖維環(huán)最主要的細(xì)胞外基質(zhì)，是衡量纖維環(huán)細(xì)胞生物活性的重要指標(biāo)。椎間盤(pán)纖維環(huán)中蛋白多糖含量的下降或成分的改變，均影響其中的膠原纖維穩(wěn)定和纖維板層間的滑動(dòng)，引起纖維環(huán)退變［7］。纖維環(huán)細(xì)胞為一種軟骨細(xì)胞［3］，缺乏特異性標(biāo)志物，目前僅局限于細(xì)胞表型、特異親和力染料、多種抗原檢測(cè)對(duì)該種細(xì)胞進(jìn)行鑒定［8］。本實(shí)驗(yàn)纖維環(huán)細(xì)胞呈多角形或梭形，甲苯胺藍(lán)染色具有易染性，與文獻(xiàn)所述一致［9］。

通過(guò)微創(chuàng)手術(shù)損傷纖維環(huán)建立椎間盤(pán)退變模型［10］，操作復(fù)雜，實(shí)驗(yàn)周期較長(zhǎng)。周江濤等［11］采用該種方法需8w后才能造模成功而進(jìn)入細(xì)胞實(shí)驗(yàn)階段。本實(shí)驗(yàn)采用持續(xù)培養(yǎng)法造成椎間盤(pán)纖維環(huán)細(xì)胞自然退變，空白組與P0組比較可見(jiàn)細(xì)胞增殖減慢、S期細(xì)胞比例減少、AGG分泌不足，基本符合退變纖維環(huán)細(xì)胞的生物學(xué)特性。而且，持續(xù)培養(yǎng)法簡(jiǎn)便易行，是纖維環(huán)細(xì)胞退變?cè)炷５牧己眠x擇。

ICA具有調(diào)節(jié)骨代謝和雙向免疫調(diào)節(jié)作用。有研究證實(shí)，ICA對(duì)體外培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞具有維持表型、促增殖作用，并且促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)成分膠原與蛋白多糖基因的表達(dá)而抑制其降解［12-13］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)第1代椎間盤(pán)纖維環(huán)細(xì)胞持續(xù)ICA給藥至第3代，結(jié)果顯示ICA具有延緩纖維環(huán)細(xì)胞退變的作用，使該細(xì)胞生長(zhǎng)增殖及細(xì)胞外基質(zhì)分泌的能力基本接近于第1代細(xì)胞。細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期檢測(cè)，ICA組較P0組有下降趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），可見(jiàn)ICA并不能完全控制或逆轉(zhuǎn)細(xì)胞退變。

藥物治療對(duì)于臨床尚未出現(xiàn)手術(shù)適應(yīng)征的椎間盤(pán)退變患者不能忽視，ICA可以是臨床醫(yī)生的一種選擇。但是ICA通過(guò)何種途徑延緩?fù)俗?？?duì)于患者，其最佳干預(yù)時(shí)間及濃度是多少？這些都是ICA臨床應(yīng)用前需要解決的關(guān)鍵問(wèn)題。

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