曾 智，王 濤

廣州醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 心血管內(nèi)科（廣州 510120）

動脈粥樣硬化是冠心病、腦卒中等心腦血管疾病的主要病理基礎(chǔ)，嚴(yán)重威脅人類生命健康。吸煙是公認(rèn)的動脈粥樣硬化發(fā)展的獨立危險因素，可導(dǎo)致內(nèi)皮功能紊亂、炎癥反應(yīng)增加、血脂代謝異常和血管內(nèi)血栓形成，易誘發(fā)急性心血管事件［1］。近年來研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮細(xì)胞早衰是動脈粥樣硬化等心血管病變的重要風(fēng)險因子，細(xì)胞早衰與線粒體功能密切相關(guān)。白藜蘆醇屬于酚類植物抗毒素，具有調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、改善血管內(nèi)皮功能和抑制血管炎癥反應(yīng)等作用［2］。此外，白藜蘆醇還能調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，但目前研究較少。因此本研究通過設(shè)計對照實驗，探討白藜蘆醇對吸煙誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞早衰的干預(yù)作用，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株HuVEes，購自Caseade Biologies公司；濃度為1×10－3mol/L的白藜蘆醇，購自Sigma公司；香煙煙霧提取物（CSE），分別配成1%、5%和10%的CSE培養(yǎng)基；DMEM培養(yǎng)基、PBS緩沖溶液、雙抗（青霉素100U/mL、鏈霉素100μg/m）、胎牛血清和胰蛋白酶購自Gibco公司；端粒酶活性檢測試劑盒（ELISA）、活性氧（ROS）檢測試劑盒和線粒體分離試劑盒購自碧云天生物科技公司；β－半乳糖苷酶染色試劑盒購自南京建成生物技術(shù)公司；流式細(xì)胞儀購自美國BD公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與分組給藥

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)液中，加入10%胎牛血清，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)，每2～3d更換培養(yǎng)液，5～6d細(xì)胞達(dá)80%～90%融合時傳代。本實驗使用第3代細(xì)胞。人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞以2×105/mL密度接種至6孔板（3mL/孔），實驗分為正常對照組（N組）、CSE組（C組）和白藜蘆醇組20μM（R組），其中后兩組根據(jù)CSE培養(yǎng)基濃度不同分為6個小組：C1（1%）、R1（1%）、C2（5%）、R2（5%）、C3（10%）和 R3（10%）。每組培養(yǎng)48h，于12、24和48h作對照研究。實驗中各組的每個孔均設(shè)4個復(fù)孔，重復(fù)3次實驗。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 不同時間點各組細(xì)胞增殖情況 以 MTT比色法測定各組內(nèi)皮細(xì)胞增殖率。在培養(yǎng)基中加入MTT溶液（5mg/mL）20μL，培養(yǎng)4h，用槍頭吸棄培養(yǎng)基，在每孔中加入150μL DMSO，置于37℃搖床輕搖20min，使DMSO溶解，用酶標(biāo)儀讀取其OD570。按照公式計算細(xì)胞增殖抑制率：細(xì)胞增殖抑制率＝（對照組吸光度－實驗組吸光度）/對照組吸光度×100%。

1.3.2 β－半乳糖苷酶染色 將內(nèi)皮細(xì)胞接種于6孔板中，分組干預(yù)后，吸除細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS清洗，0.5%戊二醛固定細(xì)胞3～5min。PBS洗3次，各孔加入1mL新配置的X－gal染液，37℃無CO2條件下孵育12～16h，熒光顯微鏡下每組標(biāo)本隨機選取視野，至少觀察1 000個細(xì)胞，細(xì)胞質(zhì)藍(lán)染者為衰老細(xì)胞，計算陽性細(xì)胞占觀察細(xì)胞總數(shù)的百分比。

1.3.3 端粒酶活性 應(yīng)用PCR－ELISA法檢測：以0.25%胰蛋白酶消化、收集2×106個細(xì)胞，余步驟按試劑盒說明書操作，酶標(biāo)儀讀數(shù)并計算端粒酶的相對活性。

1.3.4 線粒體細(xì)胞色素C氧化酶活性 使用標(biāo)準(zhǔn)曲線測定：取0.18mmoL/L Cyt C標(biāo)準(zhǔn)液3mL稀釋至30mL，分別取稀釋液2、4、6、8和10mL放于試管中，加蒸餾水至15mL，每管加少許連二亞硫酸鈉，520nm處測定光密度；以水作為空白對照，以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，光密度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線作為定量依據(jù)；取所得的線粒體懸液超聲破碎儀破碎3次以破壞線粒體膜，取線粒體懸液1.5mL，加入少許連二亞硫酸鈉搖勻，520nm處測定光密度，根據(jù)所得標(biāo)準(zhǔn)曲線計算其濃度。

1.3.5 內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)ROS水平 細(xì)胞干預(yù)后胰酶消化，使細(xì)胞密度為2×106/mL。用無血清培養(yǎng)液按照1∶1 000稀釋DCFH－DA，使終濃度為10mol/L。細(xì)胞收集后懸浮于稀釋好的DCFH－DA中，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20min。用無血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次，流式細(xì)胞儀檢測至少10 000個細(xì)胞的平均熒光強度。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 18.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。計數(shù)資料用秩和檢驗，計量資料用方差分析或t檢驗，相關(guān)性研究采用單因素回歸分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞的增殖情況

細(xì)胞生長速度隨CSE濃度升高而降低（P＜0.05），白藜蘆醇各組在不同濃度CSE作用下，細(xì)胞增殖速度差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），且不同時間點白藜蘆醇各組細(xì)胞增殖速度優(yōu)于CSE組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。白藜蘆醇在12、24和48h均能改善CSE誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞增殖抑制，說明白藜蘆醇可干預(yù)CSE導(dǎo)致的內(nèi)皮細(xì)胞早衰（圖1）。

2.2 β－半乳糖苷酶染色檢測結(jié)果

不同時間點CSE組的β－半乳糖苷酶染色陽性細(xì)胞數(shù)隨濃度升高而增多（P＜0.05），而白藜蘆醇各組在不同濃度CSE作用下，β－半乳糖苷酶染色陽性細(xì)胞數(shù)低于CSE組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。白藜蘆醇在12、24和48h均能改善CSE誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞衰老，降低β－半乳糖苷酶染色陽性細(xì)胞率（表1）。

圖1 不同時間各組MTT增殖檢測結(jié)果圖

表1 β－半乳糖苷酶染色檢測結(jié)果

2.3 端粒酶活性檢測結(jié)果

不同時間點CSE組的端粒酶活性率隨CSE濃度升高而降低（P＜0.05），而白藜蘆醇各組在不同濃度CSE作用下，端粒酶活性率高于CSE組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。白藜蘆醇在12、24和48 h均能改善CSE誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞端粒酶活性的降低（表2）。

表2 端粒酶活性檢測結(jié)果（%）

2.4 線粒體細(xì)胞色素C氧化酶活性檢測結(jié)果

不同時間點CSE組的細(xì)胞色素C氧化酶活性隨CSE濃度升高而降低（P＜0.05），而白藜蘆醇各組在不同濃度CSE作用下，細(xì)胞色素C氧化酶活性高于CSE組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。白藜蘆醇在12、24和48h均能改善CSE誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞色素C氧化酶活性的降低（表3）。

表3 線粒體細(xì)胞色素C氧化酶活性檢測結(jié)果

2.5 ROS檢測結(jié)果

不同時間點CSE組的細(xì)胞ROS水平隨CSE濃度升高而升高（P＜0.05），而白藜蘆醇各組在不同濃度CSE作用下，細(xì)胞ROS水平低于CSE組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。白藜蘆醇在12、24和48h均能改善CSE誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞ROS水平的升高（表4）。

表4 ROS檢測結(jié)果

3 討論

吸煙對人體心血管系統(tǒng)危害嚴(yán)重，它通過損害血管內(nèi)皮細(xì)胞、減少NO生物合成、誘導(dǎo)黏附分子表達(dá)異常、促進炎癥反應(yīng)以及血脂代謝紊亂等，獨立增加動脈粥樣硬化風(fēng)險，甚至引發(fā)腦卒中等急性臨床事件［3］。吸煙與動脈粥樣硬化的關(guān)系雖有眾多研究報道，但其精確機制目前尚未闡明［4］。

細(xì)胞衰老（cellular senescence）是細(xì)胞停止增殖而處于細(xì)胞周期阻滯的一種狀態(tài)，與周圍組織衰老密切相關(guān)。內(nèi)皮細(xì)胞生理活動的維持依賴正常的線粒體結(jié)構(gòu)和功能。血管內(nèi)皮細(xì)胞生長、增殖、凋亡、衰老及死亡等細(xì)胞過程均參與了動脈粥樣硬化的發(fā)生與病理演變。近年有研究［5］指出，內(nèi)皮細(xì)胞早衰是動脈粥樣硬化等心血管病變的重要風(fēng)險因子，而細(xì)胞早衰與線粒體功能密切相關(guān)。其中，β－半乳糖苷酶染色是公認(rèn)的鑒定內(nèi)皮細(xì)胞衰老的生物學(xué)標(biāo)志；線粒體細(xì)胞色素C氧化酶活性、端粒酶活性、細(xì)胞內(nèi)ATP水平和細(xì)胞內(nèi)ROS水平是目前常用的反映線粒體功能的指標(biāo)［6］。內(nèi)皮細(xì)胞衰老是血管整體老化的重要病理改變之一，也是血管老化與心血管疾病之間的重要交互環(huán)節(jié)［7］。因此，內(nèi)皮細(xì)胞早衰一直是血管老化研究的重點領(lǐng)域，深入探討其發(fā)生機制，尋找有效干預(yù)措施，對心腦血管疾病的防治具有重要意義。

白藜蘆醇是一種天然活性成分，虎杖、花生和桑椹等植物中含有此種成分，它能以游離態(tài)和糖苷結(jié)合態(tài)兩種形式存在，具有抗氧化效能，其中反式異構(gòu)體的生物活性強于順式，是一種重要的植物抗毒素。近年來，白藜蘆醇的潛在抗衰老及心血管保護作用備受關(guān)注［8－9］。白藜蘆醇具有調(diào)節(jié)血脂、抑制血小板凝集、抗血栓形成、保護血管內(nèi)皮及平滑機細(xì)胞、舒張血管、抑制血管炎癥反應(yīng)和抗氧化應(yīng)激等作用。近期研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇還具有顯著的調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的作用［10］，但目前對白藜蘆醇抗內(nèi)皮細(xì)胞衰老的作用機制研究較少。

本研究通過設(shè)計對照實驗，探討白藜蘆醇對吸煙誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞早衰的干預(yù)作用。結(jié)果表明：白藜蘆醇在12、24和48h均能改善不同濃度CSE誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞增殖抑制，說明白藜蘆醇可干預(yù)CSE導(dǎo)致的內(nèi)皮細(xì)胞早衰。同時白藜蘆醇在12、24和48h均能改善CSE誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞端粒酶活性和細(xì)胞色素C氧化酶活性的降低，并能降低β－半乳糖苷酶染色陽性細(xì)胞率和細(xì)胞內(nèi)ROS水平。表明白藜蘆醇可改善吸煙誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞線粒體功能紊亂、減緩內(nèi)皮細(xì)胞衰老，從而降低發(fā)生心血管病變的風(fēng)險。

綜上所述，白藜蘆醇以內(nèi)皮細(xì)胞線粒體功能為標(biāo)靶，抑制吸煙引起的血管內(nèi)皮細(xì)胞線粒體功能異常及細(xì)胞早衰，有效預(yù)防動脈粥樣硬化的發(fā)生，有望為動脈粥樣硬化引起的心血管疾病的臨床防治提供新的方向與循證醫(yī)學(xué)證據(jù)，具有一定的應(yīng)用前景和臨床價值。

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