楊 雅，劉 霞

涼山州第二人民醫(yī)院（西昌 615000）

心肌缺血是由心臟血液灌注減少導(dǎo)致心臟供氧不足的一種病理狀態(tài)，其常見(jiàn)誘因?yàn)楣跔顒?dòng)脈阻塞、血液黏度增高、超氧陰離子和氧自由基引起的過(guò)氧化損傷等［1］。 木補(bǔ)即異葉澤蘭（Eupatorium heterophyllumDC.）［2］，多年生草本，甘苦微溫之品，澤蘭屬，主產(chǎn)于涼山州地區(qū)?！峨p柏彝醫(yī)書(shū)》及現(xiàn)代《云南中草藥》記載，木補(bǔ)為一種常用的活血化瘀中草藥，毒副作用小。資料［3］顯示，澤蘭的主要化學(xué)成分為迷迭香酸、熊果酸、齊墩果酸、胡蘿卜苷、原兒茶酸、乙酰熊果酸、咖啡酸和香茶菜素等酚酸類(lèi)，具有擴(kuò)張微血管、改善微循環(huán)、增加紅細(xì)胞流動(dòng)性、拮抗血栓形成以及降低血液黏度等藥理作用，因而其可能成為一種新的治療心肌缺血的民族特色藥物。本研究通過(guò)觀(guān)察心肌缺血大鼠ST段改變及血清網(wǎng)膜素－1（Omentin－1）和血漿轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（TGF－β1）相關(guān)指標(biāo)的變化，探討彝藥木補(bǔ)對(duì)心肌缺血大鼠的治療作用，并采用 Western－blot法對(duì)心臟內(nèi)JNK1/2和iNOS蛋白的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，旨在揭示彝藥木補(bǔ)治療心肌缺血大鼠的可能機(jī)制，以期為心肌缺血的防治提供新的中草藥依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)SD大鼠30只，雌雄兼用，月齡3個(gè)月，體質(zhì)量250～300g，購(gòu)自四川大學(xué)華西醫(yī)學(xué)中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)：SCXK（川）2014～6。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物及主要試劑儀器

彝藥木補(bǔ)購(gòu)自涼山州中藥材有限責(zé)任公司；戊巴比妥鈉購(gòu)自上海江萊生物科技有限公司；垂體后葉素（Pit）購(gòu)自美國(guó)Promega公司；大鼠 Omentin－1 ELISA Kit購(gòu)自 R＆D公司；大鼠 TGF－β1ELISA Kit購(gòu)自美國(guó)GBD公司；牛血清白蛋白購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；p－JNK1/2 兔源一抗購(gòu)自美國(guó)NovusBiologicals公司；iNOS兔源一抗購(gòu)自美國(guó)santacruz公司；辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG購(gòu)自北京博爾西科技有限公司；ELx酶標(biāo)儀由美國(guó)Bio－Tek Instruments Inc公司生產(chǎn)；心電圖機(jī)由SCHILLER AG公司生產(chǎn)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀由德國(guó)Heidolph生產(chǎn)；電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀由上?？∈松锟萍加邢薰咎峁?；高速冷凍離心機(jī)由北京泰澤瑞達(dá)科技有限公司提供。

1.3 彝藥木補(bǔ)水煎劑的制備

準(zhǔn)確稱(chēng)取彝藥木補(bǔ)100g，雙蒸水浸泡，文火煎煮，多層紗布過(guò)濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮成1g生藥/mL，除菌后4℃保存。

1.4 分組給藥

將30只SD大鼠隨機(jī)分成正常對(duì)照組、心肌缺血模型組、木補(bǔ)低劑量組［0.8g生藥/（kg·d）］、木補(bǔ)中劑量組［2g生藥/（kg·d）］和木補(bǔ)高劑量組［4 g生藥/（kg·d）］。各給藥組大鼠灌服不同濃度的木補(bǔ)水煎劑，連續(xù)給藥6d，正常對(duì)照組及心肌缺血組灌服等量生理鹽水。

1.5 心肌缺血模型制備

各組大鼠干預(yù)處理6d后，腹腔注射2%的戊巴比妥鈉（0.2mL/100g）麻醉。固定并記錄各組大鼠注射Pit前的心電圖，10min后除正常對(duì)照外其余各組大鼠尾靜脈注射Pit（1.5U/kg），正常對(duì)照組注射等量生理鹽水。記錄注射Pit后10min時(shí)各組大鼠的心電圖變化情況，計(jì)算注射Pit后10 min時(shí)各組心電圖ST段的上移幅度均值。

1.6 ELISA法檢測(cè)Omentin－1、TGF－β1的變化

各組大鼠于注射Pit后20min心臟采血，用于ELISA檢測(cè)。做3次生物學(xué)重復(fù)。

1.7 Western－blot法檢測(cè)iNOS和p－JNK1/2的表達(dá)

各組大鼠注射Pit后20min，取大鼠心臟。提取心臟總蛋白并定量后，進(jìn)行SDS－PAGE電泳，電印跡轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)膜，5%蛋白封閉液搖床封閉2h，4℃過(guò)夜孵育一抗（稀釋度1∶1 000），TBST洗膜6次；HRP標(biāo)記的二抗（稀釋度1∶5 000）搖床孵育45 min，TBST洗膜6次，ECL法顯色、曝光，暗室洗片，并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。做3次生物學(xué)重復(fù)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，用t檢驗(yàn)比較組間數(shù)據(jù)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同劑量木補(bǔ)對(duì)心肌缺血大鼠模型心電圖的影響

心肌缺血模型組大鼠注射Pit后10min，ST段上移幅度為（0.67±0.03）mV，正常對(duì)照組ST段無(wú)變化，兩組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。低、中、高劑量木補(bǔ)連續(xù)灌服大鼠6d后，與心肌缺血模型組比較，中、高劑量木補(bǔ)均能顯著降低心肌缺血大鼠ST段上移幅度（P＜0.05）（表1）。

表1 不同劑量木補(bǔ)對(duì)心肌缺血大鼠ST段上移幅度的影響（mV）

2.2 不同劑量木補(bǔ)對(duì)心肌缺血大鼠Omentin－1、TGF－β1的影響

各組大鼠注射Pit后10min，心肌缺血模型組Omentin－1和TGF－β1分泌量分別為30.81ng·L－1和143.41ng·L－1，正常對(duì)照組 Omentin－1和 TGF－β1分泌量分別為67.13ng·L－1和71.74ng·L－1，兩組比較，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。低、中、高劑量木補(bǔ)連續(xù)灌服大鼠6d后，與心肌缺血模型組進(jìn)行比較，高劑量木補(bǔ)能升高心肌缺血大鼠血清Omentin－1水平（P＜0.05）；中、高劑量木補(bǔ)能夠顯著降低心肌缺血大鼠血漿TGF－β1（P＜0.05）（圖1）。

圖1 不同劑量木補(bǔ)對(duì)心肌缺血大鼠Omentin－1、TGF－β1的影響

2.3 不同劑量木補(bǔ)對(duì)心肌缺血大鼠iNOS和p－JNK1/2蛋白表達(dá)的影響

各組大鼠注射Pit后10min，心肌缺血模型組大鼠JNK1/2磷酸化水平提高，iNOS表達(dá)水平降低，與正常對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）；低、中、高劑量木補(bǔ)連續(xù)灌服大鼠6d后，與心肌缺血模型組比較，高劑量木補(bǔ)能顯著降低心肌缺血大鼠心臟JNK1/2的磷酸化水平（P＜0.05），也能顯著升高心肌缺血大鼠iNOS表達(dá)量（P＜0.05）（圖2）。

圖2 不同劑量木補(bǔ)對(duì)心肌缺血大鼠p－JNK1/2、iNOS蛋白表達(dá)的影響

3 討論

近年來(lái)臨床實(shí)踐［4］發(fā)現(xiàn)，中草藥可通過(guò)抑制化學(xué)趨化因子產(chǎn)生、調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子水平、提高血液NO分泌量以及促進(jìn)相關(guān)脂肪因子表達(dá)等方式治療心肌缺血。彝藥木補(bǔ)的化學(xué)成分主要為酚酸類(lèi)及三萜酸類(lèi)化合物，能活血化瘀、擴(kuò)張血管活性，對(duì)心血管疾病可能有較好的治愈作用?；诖耍狙芯客ㄟ^(guò)建立大鼠心肌缺血模型，以大鼠心電圖ST段改變及血液活性因子為研究指標(biāo)，闡明彝藥木補(bǔ)的抗心肌缺血功效。冠狀動(dòng)脈阻塞引起的心臟供血不足是導(dǎo)致ST段抬高的主要誘因，并可進(jìn)一步演化為心肌損傷、心肌微循環(huán)障礙、心律失常以及心肌舒縮障礙等病理特征，其中ST段抬高是心肌缺血患者血液灌注異常的主要臨床表現(xiàn)［5］，因此及時(shí)監(jiān)測(cè)其心電圖ST段變化情況，合理降低其ST段上移幅度，可有效控制和治療疾病。本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，尾靜脈注射Pit，模型組大鼠ST段抬高幅度顯著高于正常對(duì)照組，表明心肌缺血模型制備成功。給予中、高劑量彝藥木補(bǔ)預(yù)處理6d后，能顯著降低心肌缺血大鼠心電圖ST段抬高幅度，提示彝藥木補(bǔ)可改善心肌缺血大鼠心電圖體征，并控制其病程的惡化。為揭示彝藥木補(bǔ)降低心肌缺血大鼠心電圖ST段抬高幅度的可能機(jī)制，本研究擬以血清Omentin－1和血漿TGF－β1作為研究對(duì)象，分別對(duì)心肌缺血大鼠 Omentin－1/iNOS系統(tǒng)和 TGF－β1/JNK1/2通路進(jìn)行探討。

Omentin即脂肪因子，是一種分泌蛋白，有Omentin－1和 Omentin－2兩種亞型，其中 Omentin－1可與血管內(nèi)皮相應(yīng)受體結(jié)合，激活體內(nèi)iNOS蛋白活性，從而促進(jìn)血管內(nèi)NO產(chǎn)生，能改善血管內(nèi)皮細(xì)胞功能、抑制血管鈣化形成、促進(jìn)血管再生、恢復(fù)毛細(xì)血管密度活性，從而廣泛參與對(duì)心血管疾病的調(diào)控過(guò)程［6］。Zhong等［7］研究表明，冠狀動(dòng)脈疾病患者Omentin－1水平較健康組低，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，高劑量木補(bǔ)可顯著提高心肌缺血大鼠Omentin－1分泌量、iNOS蛋白表達(dá)量，提示彝藥木補(bǔ)可通過(guò)調(diào)節(jié)心肌缺血大鼠Omentin－1分泌水平，進(jìn)而刺激心臟iNOS蛋白表達(dá)，從而增加血液中NO的釋放量，清除超氧陰離子和過(guò)氧自由基，抑制NADPH氧化酶活性，減少氧化損傷，以改善心肌缺血癥狀。

TGF－β1是一種由血管內(nèi)皮細(xì)胞、心肌細(xì)胞等分泌的具有廣泛生物學(xué)功能的生長(zhǎng)因子，是調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡的重要因素［8］，它可能與心肌缺血等心血管疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。TGF－β1活化后可與細(xì)胞膜表面的二聚體受體結(jié)合，激活ⅳ型受體，磷酸化R－Smads分子C末端的絲氨酸殘基，傳導(dǎo)胞外信號(hào)，持續(xù)激活體內(nèi)JNK活性，從而調(diào)控若干下游靶分子，不斷擴(kuò)大信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，促進(jìn)心肌缺血損傷［9］。進(jìn)一步對(duì) TGF－β1介導(dǎo)的JNK1/2信號(hào)通路是否參與心肌缺血損傷進(jìn)行探討，研究［10］表明，TGF－β1水平與心肌缺血等冠狀動(dòng)脈疾病有關(guān)，可作為預(yù)測(cè)心肌缺血的重要臨床指標(biāo)。同時(shí)Strand等［11］發(fā)現(xiàn)，體內(nèi)JNK1/2的磷酸化對(duì) TGF－β1的分泌具有正調(diào)控作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，彝藥木補(bǔ)預(yù)處理大鼠后，血漿TGF－β1分泌水平和體內(nèi)JNK1/2的磷酸化程度均顯著降低，并呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性，表明彝藥木補(bǔ)可通過(guò)抑制JNK1/2的磷酸化調(diào)節(jié)TGF－β1的分泌量，從而改善心肌缺血癥狀。

綜上所述，Pit介導(dǎo)的大鼠心電圖ST段抬高幅度的增加，可能與 Omentin－1和 TGF－β1的表達(dá)水平有關(guān)。彝藥木補(bǔ)可通過(guò)調(diào)節(jié)心肌缺血大鼠體內(nèi)iNOS和JNK1/2蛋白活性，控制血清細(xì)胞因子的分泌，從而促進(jìn)心肌缺血轉(zhuǎn)歸，但對(duì)彝藥木補(bǔ)改善心肌缺血作用的具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

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