吳方毅任妮麗

白介素－8與表皮生長因子對黑素瘤A375細(xì)胞增殖的影響

吳方毅1任妮麗2?

目的: 明確IL－8與表皮生長因子(EGF)對黑素瘤細(xì)胞增殖的影響。方法: 將黑素瘤細(xì)胞A375分為9組:EGF組；EGF＋AG1478組；AG1478組；IL－8組；IL－8I組；IL－8＋I(xiàn)L－8I組；EGF＋I(xiàn)L－8組；EGF＋I(xiàn)L－8＋AG1478＋I(xiàn)L－8I組及對照組。采用MTT法檢測各組細(xì)胞增殖情況；免疫印跡法檢測EGFR、蛋白激酶B、絲裂原活化蛋白激酶、磷酸化蛋白激酶B、磷酸化絲裂原活化蛋白激酶、磷酸化表皮生長因子受體的表達(dá)；實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測EGFR與IL－8R mRNA水平的表達(dá)。結(jié)果: EGF組黑素瘤細(xì)胞增殖、上述蛋白的表達(dá)和mRNA水平顯著高于對照組、EGF＋AG1478組和AG1478組。IL－8組顯著高于對照組、IL－8I組和IL－8＋I(xiàn)L－8I組(均P＜0.05)，EGF＋AG1478組顯著高于EGF組和IL－8組(P＜0.05)。結(jié)論: IL－8與EGF均能促進(jìn)人黑素瘤細(xì)胞的增殖，它們之間可能具有相互協(xié)同作用，這種協(xié)同作用可能與AKT和MAPK等共同通路作用有關(guān)。

IL－8； 表皮生長因子； 黑素瘤細(xì)胞； A375

皮膚黑素瘤是增殖最快的腫瘤之一，如果出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，其中位生存期顯著下降至6～9個月。1黑素瘤中IL－8水平與患者整體生存率顯著相關(guān)。2－4研究表明，IL－8被證實有誘導(dǎo)血管生成和黑素瘤細(xì)胞運動的能力。4由于血管生成、運動和細(xì)胞增殖是腫瘤轉(zhuǎn)移過程中的重要步驟，所以IL－8的表達(dá)與黑素瘤的轉(zhuǎn)移潛能直接相關(guān)。5IL－8促進(jìn)黑素瘤細(xì)胞增殖和進(jìn)展，IL－8更具有促進(jìn)黑素瘤細(xì)胞侵襲的能力。6表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor EGFR)是170 KD具有酪氨酸激酶(TK)活性的膜受體，可被表皮樣生長因子(如EGF、TGF－α等)磷酸化激活，經(jīng)Ras－Raf－MAPK或PI3K－PPL1－AKT等多條信號通路傳遞信號至核內(nèi)，調(diào)節(jié)表達(dá)EGFR腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程，7在黑素瘤中其表達(dá)程度與病情進(jìn)展、預(yù)后呈正相關(guān)。8－10IL－8與EGFR信號通路均作用于AKT及MAPK信號途徑，11，12IL－8在其他腫瘤如口腔黏膜腫瘤中對于EGFR相關(guān)治療的耐藥機(jī)制扮演重要角色，13，14但是在黑素瘤中IL－8與EGFR的相互作用目

前還尚無相關(guān)研究。因此，本文主要目的即是研究IL－8與EGF在黑素瘤細(xì)胞增殖中的作用、以及是否存在相互作用及其可能的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 人黑素瘤A375細(xì)胞株購于ABGENT公司(貨號:CL1006)；培養(yǎng)于RPMI 1640培養(yǎng)液中以備實驗。

1.1.2 試劑 IL－8購于vicmed(貨號:V01340)；IL－8阻斷劑(IL－8I)購于Bachem(貨號:H－2268.0005)；EGF購于PIERCE(貨號:RP10914)；EGFR阻斷劑AG1478購于Biovision(貨號:1800－25)，EGFR購于Saierbio(貨號:SRP05035)、AKT購于genetex(貨號: GTX10660)、MAPK購于 ProSci(貨號:50－207)、PAKT購于 Bioworld(貨號:AP0056)、p－MAPK購于Beyotime(貨號:AM065)、p－EGFR購于Grbio(貨號: Gr－617k)。

1.1.3 試劑和設(shè)備 TRizol(15596－018，Invitrogen)，cDNA第一鏈合成試劑盒(K1622，F(xiàn)ermentas)，引物合成(金斯瑞)，SYBR Green/FlouresceinqPCR Master Mix(2X)(K0242，F(xiàn)ermentas)，分光光度計(型號752，上海舜宇恒科學(xué)儀器有限公司)，水平電泳儀(型號JY300，北京君意東方電泳設(shè)備有限公司)，紫外分析儀(型號 JY02S，北京君意東方電泳設(shè)備有限公司)，實時熒光定量 PCR儀(illumine Eco)，DL2000 (D501A，TAKARA)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) A375細(xì)胞培養(yǎng)于RPMI 1640培養(yǎng)液中(含10%胎牛血清，PBS)，0.25%胰酶加0.02% EDTA消化傳代處理。

1.2.2 細(xì)胞分組刺激處理 A375細(xì)胞培養(yǎng)于RPMI 1640培養(yǎng)液中(含10%胎牛血清，PBS)，0.25%胰酶加0.02%EDTA消化傳代處理，分9組處理如下:A組，A375(無處理組)；B組，EGF；C組，EGF＋AG1478；D組，AG1478；E組，IL－8；F組，IL－8I；G組，IL－8＋I(xiàn)L－8I；H組，EGF＋I(xiàn)L－8；I組，EGF＋I(xiàn)L－8＋AG1478＋I(xiàn)L－8I。

1.2.3 MTT法檢測細(xì)胞增殖 取對數(shù)生長期的A375細(xì)胞經(jīng)0.25%胰酶消化后，用完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×105個/mL，分別接種于兩塊96孔培養(yǎng)板的居中90孔，然后更換McCoy's5A無血清培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)24 h，設(shè)置A－I組，每組設(shè)置9個復(fù)孔(具體試劑如1.2.2所示；濃度為EGF 50 ng/mL，AG1478 20μmol/ L，IL－8 100 pg/mL，IL－8I 50μmol/L)，并設(shè)置空白對照組，培養(yǎng)96 h后進(jìn)行檢測，檢測前4 h加MTT(5 mg/m L)20μL，棄上清液加DMSO 100μL，避光震蕩20 min，全自動酶標(biāo)儀檢測570 nm處吸光度(A570)的值。細(xì)胞生長率(%)＝(實驗組吸光度－空白組吸光度)/(對照組吸光度－空白組吸光度)×100%。

1.2.4 Western檢測AKT、MAPK、EGFR、p－AKT、p－MAPK、p－EGFR 運用Western－blot方法檢測各組EGFR信號通路關(guān)鍵信號分子AKT、MAPK、EGFR、p－AKT、p－MAPK、p－EGFR的表達(dá)。取適量A375細(xì)胞裂解液勻漿組織，測蛋白濃度后，各組樣品取50μg總蛋白上樣電泳，PAGE膠電泳(EGFR，8%；p－EGFR，10%；AKT，8%；p－AKT，10%；MAPK，12%；p－MAPK，8%)。轉(zhuǎn)膜:EGFR(200 mA)，60 min；p－EGFR(200 mA)，60 min；AKT(200 mA)，40 min；p－AKT (200 mA)，90 min；MAPK(200mA)，60min；p－MAPK (300 mA)，75 min。用免疫印記法15檢測。相應(yīng)的一抗:EGFR，1∶1000；p－EGFR，1∶800；AKT，1∶400；p－AKT，1∶1000；MAPK，1∶200；p－MAPK，1∶800。Band-Scan掃描分析各條帶灰度值，結(jié)果取被檢條帶與內(nèi)參條帶的灰度值之比。

1.2.5 實時熒光定量PCR(qT－PCR)檢測EGFR和IL－8R的mRNA水平表達(dá) 在上述結(jié)果基礎(chǔ)上，為了進(jìn)一步研究IL－8與EGF在A375細(xì)胞中可能存在的相互作用，我們采用實時熒光定量PCR檢測IL－8 R/ EGFRmRNA在各組細(xì)胞中的表達(dá)。RNA提取以及逆轉(zhuǎn)錄收集經(jīng)過各組處理的細(xì)胞，加入1 mL Trizol，提取總的RNA，逆轉(zhuǎn)錄。16

1.2.6 統(tǒng)計學(xué)方法 統(tǒng)計學(xué)分析采用軟件 SPSS 19.0。使用單因素方差分析IL－8和EGF對A375細(xì)胞增殖的影響，用卡方檢驗。分析AKT、MAPK、EGFR、p－AKT、p－MAPK、p－EGFR在各組細(xì)胞中表達(dá)的差異。EGFR和IL－8R之間進(jìn)行表達(dá)相關(guān)性分析。如P＜0.05，則認(rèn)為差異有顯著性統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 A375細(xì)胞增殖檢測結(jié)果分析 48 h統(tǒng)計結(jié)果: E組細(xì)胞生長率顯著高于 A、F、G組(115.6%，108.3%，110.7%，均P＜0.05)，A組細(xì)胞生長率顯著低于F組(36.9%，P＜0.05)(圖1)；B組顯著高于A、C、D組(121.5%，109.7%，112.4%，P＜0.05)，A組細(xì)胞生長率顯著低于D(24.3%，P＜0.05)(圖2)。表明IL－8與EGF單獨作用時48 h內(nèi)不影響A375細(xì)胞的增殖，5 h以后IL－8與EGF均能顯著促進(jìn)A375細(xì)胞增殖。IL－8與EGF聯(lián)合作用時48 h內(nèi)即可促進(jìn)A375細(xì)胞增殖，在50 h促進(jìn)作用更加明顯(圖3，均P＜0.01)。這些結(jié)果說明IL－8與EGF均可以單獨促進(jìn)A375細(xì)胞增殖，并且兩者對A375細(xì)胞增殖具有協(xié)同作用。

2.2 AKT、MAPK、EGFR、p－AKT、p－MAPK、p－EGFR在各組細(xì)胞中的表達(dá) (由于IL－8R及其磷酸化抗體難以得到，所以本實驗僅檢測了EGFR及其磷酸化的表達(dá))。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，EGFR及其磷酸化形式在其相

應(yīng)配體組顯著高于配體組以及配體＋抑制劑組(p－，磷酸化)(P＜0.05，圖4)，AKT、MAPK也分別顯示出相類似的表達(dá)趨勢。結(jié)合以上細(xì)胞增殖結(jié)果，表明IL－8與EGF可能協(xié)同促進(jìn)A375細(xì)胞增殖，兩者的協(xié)同作用可能與共同通路AKT以及MAPK相關(guān)。

2.3 IL－8R/EGFR mRNA在各組細(xì)胞中的表達(dá) 結(jié)果表明，IL－8R/EGFR mRNA分別在其相應(yīng)配體組顯著高于對照組、抑制劑組、配體＋抑制劑組(P＜0.05)，IL－8＋EGF組顯著高于IL－8組、EGF組、A375＋EGF＋I(xiàn)L－8＋AG1478＋I(xiàn)L－8I組和對照組(P＜0.05)，(圖5)。

圖1 IL－8影響A375細(xì)胞增殖

圖2 EGF影響A375細(xì)胞增殖

圖3 IL－8聯(lián)合EGF影響A375細(xì)胞增殖

圖4 IL－8與EGF關(guān)鍵信號分子在A375細(xì)胞增殖過程中的表達(dá)

圖5 IL－8R/EGFRmRNA在各組細(xì)胞中的表達(dá)(△t＝實驗組含量－內(nèi)參含量；△△t為平均值)

3 討論

IL－8是第一個被報道的誘導(dǎo)黑素瘤細(xì)胞趨化和趨觸性轉(zhuǎn)移(haptotactic transfer)的趨化因子。17IL－8在黑素瘤中是持續(xù)表達(dá)的，是黑素瘤中的自分泌/旁分泌生長因子，同時還是侵襲和血管生成相關(guān)因子，轉(zhuǎn)移性高的黑素瘤細(xì)胞表達(dá)更高水平的IL－8。18IL－8

受體抑制劑是一種潛在的治療黑素瘤的方法。19在本項目中，IL－8能夠獨立促進(jìn)A375細(xì)胞增殖，與之前的文獻(xiàn)報道一致。同時，本項目中盡管因抗體因素沒有研究IL－8受體及其磷酸化形式在A375細(xì)胞增殖中的表達(dá)情況，但是本實驗在mRNA水平仍然發(fā)現(xiàn)了其表達(dá)趨勢與細(xì)胞增殖情況相一致。

Bonaccorsi等20研究發(fā)現(xiàn)EGF通過激活EGFR和抗凋亡AKT信號通路提高對腫瘤的侵襲能力，而高濃度EGF僅能誘導(dǎo)一個早期的、瞬間的MAPK活性進(jìn)而抑制細(xì)胞的生長。21Udart等8研究表明EGFR信號通路與黑素瘤的演變過程高度相關(guān)。人黑素瘤細(xì)胞受自分泌和旁分泌的EGF雙重影響。在本實驗中，EGF能獨立促進(jìn)A375細(xì)胞增殖，并在蛋白水平和mRNA水平顯示出一致的表達(dá)趨勢，也說明EGF能促進(jìn)A375細(xì)胞的生長，體現(xiàn)出EGF可能對黑素瘤的促進(jìn)作用。

眾多報道發(fā)現(xiàn)EGFR與IL－8過度分泌有關(guān)，如HB－EGF結(jié)合EGFR后可以促使人支氣管上皮細(xì)胞分泌IL－8，22MMP－12可以通過EGFR通道增加IL－8的分泌。23在肺癌中，EGF能有效結(jié)合EGFR并且激活其下游信號通路，導(dǎo)致IL－8的過度分泌。24

在本實驗中，IL－8與EGF不僅能獨立促進(jìn)黑素瘤A375細(xì)胞的生長和進(jìn)展，而且兩者共同存在時A375細(xì)胞的生長和進(jìn)展更加明顯，表現(xiàn)出了一定程度的協(xié)同作用。這與既往其它腫瘤細(xì)胞中IL－8與EGF的相互作用基本一致，但是在A375細(xì)胞中IL－8與EGF相互作用可能與AKT、MAPK等信號通路有關(guān)，其具體詳細(xì)的信號串聯(lián)路徑是否與其它腫瘤中的相互作用相一致還有待進(jìn)一步深入的研究。

綜上所述，本項目發(fā)現(xiàn)IL－8與EGF能分別獨立促進(jìn)A375細(xì)胞的增殖，且兩者在促進(jìn)A375增殖過程中可能具有協(xié)同作用，兩者信號通路重要的信號分子及其共同通路的信號分子均有相一致的表達(dá)趨勢，表明IL－8與EGF相互協(xié)同促進(jìn)A375生長增殖中可能與EGFR、AKT、MAPK等重要的信號分子相關(guān)，這為人黑素瘤的雙信號通路聯(lián)合靶向治療提供了可能的選擇。

1 Tarhini AA，Agarwala SS.Cutaneousmelanoma:available therapy formetastatic disease.Dermatol Ther，2006，19(1):19－25.

2 Hoejberg LL，Bastholt J，Johansen S，et al.Serum interleukin－6 as a prognostic biomarker in patients with metastatic melanoma.Melanoma Res，2012，22(4):287－293.

3 Hanafusa H，Ninomiya－Tsuji J，Masuyama N，et al.Involvement of the p38 m itogen－activated protein kinase pathway in transforming growth factor－beta－induced gene expression.JBiol Chem，1999，274(38):27161－27167.

4Marion R，Coeffier MM，Gargala G，et al.Glutamine and CXC chemokines IL－8，Mig，IP－10 and I－TAC in human intestinal epithelial cells.Clin Nutr，2004，23(4):579－585.

5 Hehlgans T，Mannel DN.Recombinant，soluble LIGHT(HVEM ligand)induces increased IL－8 secretion and growth arrest in A375melanoma cells.J Interferon Cytokine Res，2001，21(5): 333－338.

6 Kushiro K，Chu RA，Verma A，et al.Adipocytes promote B16BL6 melanoma cell invasion and the epithelial－to－Mesenchymal transition.Cancer Microenviron，2012，5(1):73－82.

7Ciardiello F，Tortora G.A novel approach in the treatment of cancer:targeting the epidermal growth factor receptor.Clin Cancer Res，2001，7(10):2958－2970.

8UdartM，Utikal J，Krahn GM，etal.Chromosome 7 aneusomy. A marker formetastaticmelanoma?Expression of the epidermal growth factor receptor gene and chromosome 7 aneusomy in nevi，primary malignantmelanomas and metastases.Neoplasia，2001，3 (3):245－254.

9Egger B，Buchler MW，Lakshmanan J，et al.Mice harboring a defective epidermal growth factor receptor(waved－2)have an increased susceptibility to acute dextran sulfate－induced colitis. Scand JGastroenterol，2000，35(11):1181－1187.

10 Troyer KL，Luetteke NC，Saxon ML，etal.Growth retardation，duodenal lesions，and aberrant ileum architecture in triple null mice lacking EGF，amphiregulin，and TGF－alpha.Gastroenterology，2001，121(1):68－78.

11 Jijon HB，Buret A，Hirota CL，et al.The EGF receptor and HER2 participate in TNF－alpha－dependent MAPK activation and IL－8 secretion in intestinal epithelial cells.Mediators Inflamm，2012，2012:207398.

12 Linnskog R，Jonsson G，Axelsson L，et al.Interleukin－6 drives melanoma cell motility through p38alpha－MAPK－dependent up－regulation of WNT5A expression.Mol Oncol，2014，30(03):310－314.

13 Li L，Han R，Xiao H，et al.Metformin sensitizes EGFR－TKI－resistant human lung cancer cells in vitro and in vivo through inhibition of IL－6 signaling and EMT reversal.Clin Cancer Res，2014，20(10):2714－2726.

14 Refsnes M，Skuland T，Schwarze PE，et al.Fluoride－induced IL－8 release in human epithelial lung cells:relationship to EGF－receptor－，SRC－and MAP－kinase activation.Toxicol App l Pharmacol，2008，227(1):56－67.

15 You Y，Zhang J，Li Y，et al.CADM 1/TSLC1 inhibitsmelanoma cell line A375 invasion through the suppression of matrix metalloproteinases.MolMed Rep，2014，10(5):2621－2626.

16Wu GQ，Liu NN，Xue XL，et al.Multiplex real－time PCR for RRM1，XRCC1，TUBB3 and TS mRNA for prediction of response of non－small cell lung cancer to chemoradiotherapy.A-sian Pac JCancer Prev，2014，15(10):4153－4158.

17Yoshimura T，Matsushima K，Oppenheim JJ，et al.Neutrophil chemotactic factor produced by lipopolysaccharide(LPS)－stimulated human blood mononuclear leukocytes:partial char-

acterization and separation from interleukin 1(IL 1).J Immunol，1987，139(3):788－793.

18李瑤，呂德官，陳臨溪.IL－8及其受體藥物與疾病的研究進(jìn)展.中國藥理學(xué)通報，2014，30(03):310－314.

19 Evans MS，Madhunapantula SV，Robertson GP，et al.Current and future trials of targeted therapies in cutaneous melanoma. Adv Exp Med Biol，2013，779:223－255.

20 Bonaccorsi L，Marchiani S，Muratori M，et al.Gefitinib ('IRESSA'，ZD1839)inhibits EGF－induced invasion in prostate cancer cells by suppressing PI3 K/AKT activation.JCancer Res Clin Oncol，2004，130(10):604－614.

21O－charoenrat P，Rhys－Evans PH，Modjtahedi H，et al.The role of c－erbB receptors and ligands in head and neck squamous cell carcinoma.Oral Oncol，2002，38(7):627－640.

22McGovern T，RisseA PA，Tsuchiya K，etal.LTD(4)induces HB－EGF－dependent CXCL8 release through EGFR activation in human bronchial epithelial cells.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2010，299(6):L808－815.

23 Le Quement C，Guénon I，Gillon JY，et al.MMP－12 induces IL－8/CXCL8 secretion through EGFR and ERK1/2 activation in epithelial cells.Am JPhysiol Lung Cell Mol Physiol，2008，294(6):L1076－1084.

24 Zhang Y，Wang L，Zhang M，etal.Potentialmechanism of interleukin－8 production from lung cancer cells:an involvement of EGF－EGFR－PI3K－Akt－Erk pathway.JCell Physiol，2012，227(1):35－43.

(收稿:2014－11－07 修回:2014－12－29)

·臨床研究·

表1 兩組療效比較

2.2 不良反應(yīng) 治療組服藥后有1例出現(xiàn)月經(jīng)錯后，2例出現(xiàn)皮膚紅斑，脫屑；對照組2例出現(xiàn)皮膚燒灼，刺痛感，均未作特殊處理自行消失。

3 討論

隨著人們生活水平的提高，黃褐斑已成為困擾眾多女性美觀的一大難題。本病病因尚未完全明了，目前認(rèn)為累積的紫外線照射，雌孕激素水平，性格急躁，焦慮，緊張，失眠，化妝品使用不當(dāng)都會引起。治療尚無特別滿意的方法，包括IPL，點陣激光、美白針注射，外用淡斑藥物等，部分患者可取得一定的效果，但同時具有不同程度不良反應(yīng)，色沉、脫屑、復(fù)發(fā)。組合外用藥千白氫醌乳膏通過抑制酪氨酸轉(zhuǎn)化為3，4－二苯丙氨酸(多巴)酶氧化作用和抑制其他的黑素細(xì)胞代謝過程而產(chǎn)生可塑性的皮膚退色。2維A酸直接影響黑素生成，降低皮膚異常色素沉著。通過表皮更新促使黑素的快速丟失，糖皮質(zhì)激素有助于皮膚色素減退，抑制黑素細(xì)胞酪氨酸酶的活性，致使黑素生成障礙，單獨外用時不理想，長期應(yīng)用副作用較多，但當(dāng)與維A酸乳膏，氫醌聯(lián)合應(yīng)用時，它們對皮膚色素沉著的抑制作用疊加，治療效果明顯改善，同時糖皮質(zhì)激素能夠?qū)γ庖哂幸种谱饔?，對上述兩種藥物所產(chǎn)生的皮膚副作用有明顯的抵抗作用，減少治療過程中的不良反應(yīng)。3，4維生素C、E具有抗氧化作用。中醫(yī)認(rèn)為，黃褐斑由肝郁氣滯，血行不暢，瘀血阻于面部浮絡(luò)所致。舒肝顆粒，當(dāng)歸、白芍養(yǎng)肝血，理肝氣，香附，柴胡疏肝解郁理氣，丹皮，桅子，薄荷，清熱涼血，散瘀除煩，白術(shù)、甘草入中焦和脾胃。諸藥合用共奏，疏肝理氣，散瘀消斑之功。綜上所述:組合外用藥聯(lián)合舒肝顆粒治療面部黃褐斑療效確切，是治療黃褐斑好的方法之一。

參考文獻(xiàn)

1中國中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會皮膚性病專業(yè)委員會色素病學(xué)組.黃褐斑的臨床診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)(2003年修訂稿).中華皮膚科雜志，2004，37(7):440.

2劉叢林，席建元.祛斑湯聯(lián)合干白氫醌乳膏治療黃褐斑30例療效觀察.中醫(yī)藥導(dǎo)報，2011，17(9):45.

3張合立，籍紅，王文格.糠酸莫米松乳膏聯(lián)合維A酸乳膏治療黃褐斑療效分析.中國美容醫(yī)學(xué)，2012，21(7):1177－1178.

4談君林，孫紅，沈秋霞.中藥聯(lián)合迪維霜治療黃褐斑療效觀察.中國麻風(fēng)皮膚病雜志，2012，28(10):700.

(收稿:2014－05－06)

Effects of IL－8 and EGF on the proliferation of themelanoma A375 cells

WU Fang-yi，REN Ni-li.Department ofDermatology，Shiyan People’s Hospital Affiliated to Hubei University ofMedicine，Shiyan，442000

Objective:To determine the effects of IL－8 and epidermal growth factor(EGF)on the proliferation ofmelanoma cell.M ethods:The human melanoma cells A375 were divided into 9 groups:control group，EGF group，EGF combined AG1478 group，AG1478 group，IL－8 group，IL－8I group，IL－8 combined IL－8I group，EGF combined IL－8 group and EGF combined IL－8，AG1478 and IL－8Igroup.The proliferation ofmelanoma cellwas detected by MTT.The level of EGFR，protein kinase B(Akt)，m itogen activated protein kinase(MAPK)，phosphorylated protein kinase B(P－Akt)，phosphorylated m itogen activated protein kinase(p－MAPK)and phosphorylated epidermal growth factor receptor(p－EGFR)were detected by western blot.The expression of EGFR and IL－8RmRNA levelswere detected by qT－PCR.Results:The cell proliferation，the levels of proteins above and EGFR，and IL－8RmRNA levels in EGF groupwerehigher than that in control group，EGF combined AG1478 group and AG1478 group(P＜0.05).Those in IL－8 group were higher than that in control group，IL－8Igroup，IL－8 combined IL－8Igroup.Those in EGF combined IL－8 group was higher than that in IL－8 group and EGF group(P＜0.05).Conclusion:IL－8 and EGF can promote the proliferation ofmelanoma cells.Theremay be a synergistic effect between IL－8 and EGF，whichmay be related to the Akt and MAPK pathway.

IL－8；EGF；melanoma cell；A375

1湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院皮膚科，十堰，442000 2湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院醫(yī)務(wù)科，十堰，442000?通信作者