孫經(jīng)武， 王艷艷， 房燦

藏紅花酸預(yù)處理對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷中炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡的影響及其機(jī)制

孫經(jīng)武， 王艷艷， 房燦

目的：探討藏紅花酸預(yù)處理對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷中炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡的影響及其機(jī)制。

方法：將30只Wistar 雄性大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組，缺血再灌注組，藏紅花酸組，每組10只，術(shù)前7天分別給予相應(yīng)處理。采用結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支的方法建立心肌缺血再灌注模型，缺血45 min后再灌注3 h。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA） 檢測(cè)大鼠血清肌酸激酶MB同工酶（CK-MB）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細(xì)胞介素-10（IL-10） 的含量，脫氧核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記法（TUNEL） 檢測(cè)心肌細(xì)胞的凋亡指數(shù)。

結(jié)果：與假手術(shù)組相比，缺血再灌注組及藏紅花酸組血清CK-MB和TNF-α含量明顯上升（P＜0.01），藏紅花酸組IL-10含量明顯上升（P＜0.01），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與缺血再灌注組相比，藏紅花酸組的血清CK-MB、TNF-α含量及心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯降低（P＜0.01），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而血清IL-10含量明顯升高（P＜0.01），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)論：藏紅花酸預(yù)處理在心肌缺血再灌注損傷中可以通過負(fù)性調(diào)節(jié)TNF-α，正性調(diào)節(jié)IL-10來減輕炎癥反應(yīng)并抑制心肌細(xì)胞的凋亡，發(fā)揮心肌保護(hù)作用。

藏紅花酸；心肌缺血再灌注損傷；炎癥；凋亡

Methods: A total of 30 male Wistar rats were randomly divided into 3 groups: Sham group, the rats received intragastric sodium carboxymethyl cellulose (CMC-Na) for 7 days followed by the operation without occlusion. I/R group, the rats received intragastric CMC-Na for 7 days followed by left anterior descending (LAD) coronary artery occlusion for 45 min with subsequent reperfusion for 3 hours. CRO group, the rats received intragastric crocetin 50 mg/ (kg.day) for 7 days followed by I/R procedure. n=7 in each group. The levels of creatine kinase-MB (CK-MB), tumor necrosis factor-α (TNF-α) and infammation cytokine interleukin-10 (IL-10) were examined by ELISA, the myocardial apoptosis index was determined by TUNEL staining.

Result: Compared with Sham group, I/R group and CRO group had increased levels of CK-MB, TNF-α, and CRO group had increased IL-10 level, all P＜0.01. Compared to I/R group, CRO group showed decreased levels of CK-MB, TNF-α and myocardial apoptosis index, while increased IL-10 level, all P＜0.01.

Conclusion: Crocetin pretreatment could down-regulate TNF-α expression, up-regulate IL-10 expression and therefore reducing the infammatory reaction in experimental rats to protect myocardial apoptosis

(Chinese Circulation Journal, 2015, 30:172.)

急性心肌梗死目前在心血管疾病中屬于高發(fā)病率和高死亡率中的一員。早期再灌注治療無論是溶栓或急診經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈（冠脈）介入治療是心肌挽救最實(shí)用和最廣泛采用的方法[1]。雖然這些治療方法已被大大改善，患者的恢復(fù)仍然不盡人意，缺血再灌注損傷是影響患者康復(fù)的最重要因素之一，因此如何減輕心肌缺血再灌注損傷顯得尤為重要。近年來，研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡是急性心肌缺血再灌注損傷中的心肌細(xì)胞死亡的重要機(jī)制之一[2，3]。此外炎癥反應(yīng)也是引起心肌缺血再灌注損傷的重要機(jī)制之一[4]。

藏紅花酸是藏紅花提取物的主要活性成分之一，既往的相關(guān)研究已經(jīng)證實(shí)其對(duì)腦、肺、腎、肝的缺血再灌注損傷有保護(hù)作用[5-7]，其機(jī)制可能涉及抑制氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等方面。但尚未有其對(duì)心肌缺血再灌注損傷相關(guān)作用的研究報(bào)告，本研究通過建立大鼠心肌缺血再灌注模型，進(jìn)一步揭示藏紅花酸在心肌缺血再灌注損傷中的保護(hù)作用機(jī)制。

1 材料與方法

動(dòng)物： 2013-04至2013-05選擇健康成年Wistar雄性大鼠30只，體重（220±20）g，由山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，在本實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性喂養(yǎng)3天后用于實(shí)驗(yàn)。

藥品與試劑:藏紅花酸購自濟(jì)南浩化實(shí)業(yè)有限責(zé)任公司，批號(hào)為20121123，為磚紅色粉末，使用前以0.5%羧甲基纖維素鈉（0.5% CMC-Na）制成0.5%的懸浮液。肌酸激酶MB同工酶（CK-MB）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）及白細(xì)胞介素-10（IL-10）酶鏈免疫收附法（ELISA）試劑盒購自廈門慧嘉生物有限公司，脫氧核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記法（TUNEL） 試劑盒購自南京凱基生物有限公司。

分組與給藥方法：將健康成年Wistar雄性大鼠30只隨機(jī)分為假手術(shù)組，缺血再灌注組，藏紅花酸組，每組l0只。按如下方案給藥：

假手術(shù)組：大鼠先灌服0.5% CMC-Na， 10 ml/（kg·d），7天后開胸，只穿線不結(jié)扎冠脈。缺血再灌注組：大鼠先灌服0.5% CMC-Na， 10 ml/（kg·d），7天后開胸結(jié)扎冠脈前降支45 min，再灌注液體180 min，建立缺血再灌注損傷模型。藏紅花酸組：造模前一周給予0.5%藏紅花酸50 mg/（kg·d）灌胃，余同缺血再灌注組。

模型建立： 采用結(jié)扎左前降支的方式建立心肌缺血再灌注損傷（MIRI）模型[8]。 Wistar大鼠術(shù)前禁食6 h。20%烏拉坦按8 ml/kg對(duì)大鼠實(shí)施腹腔注射麻醉，仰臥位固定，打開電腦及Medlab信號(hào)采集系統(tǒng)，連接心電圖記錄Ⅱ?qū)?lián)心電圖,氣管插管連接小動(dòng)物呼吸機(jī)進(jìn)行機(jī)械通氣。在胸骨左緣0.5 cm處剪開胸部皮膚，于3～4肋間，剪斷第4肋并分離肋間肌，刺破胸膜暴露心臟，剪開心包膜,將心臟擠出胸腔，于左心耳與肺動(dòng)脈圓錐交界處下約3～4 cm處穿線，結(jié)扎冠脈左前降支，同時(shí)將一根直徑2 mm的聚乙烯管置于結(jié)扎線與冠脈之間，拉緊結(jié)扎線使管壓迫冠脈引起冠脈閉塞，造成急性心肌缺血模型，觀察心電圖，以出現(xiàn)ST段顯著抬高（抬高0.1 mV）為結(jié)扎成功標(biāo)志。在缺血45 min后，取出聚乙烯管再灌注液體，以心臟表面顏色轉(zhuǎn)紅、抬高的ST段下降在1/2以上為再灌注成功標(biāo)志，再灌注180 min。假手術(shù)組的動(dòng)物手術(shù)過程與缺血再灌注組相同，但只穿線不結(jié)扎冠脈。

血清CK-MB、TNF-α和IL-10含量測(cè)定：再灌注3 h后，經(jīng)腹主動(dòng)脈穿刺抽血3 ml，離心分離出血清，按照CK-MB，TNF-α和IL-10的ELISA試劑盒說明書操作，用酶標(biāo)儀在 450 nm處測(cè)吸光度（OD）值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度和OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計(jì)算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品血清CK-MB、TNF-α和IL-10的實(shí)際濃度[9-11]。

TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡指數(shù)：再灌注3 h后迅速剪下心臟，置于磷酸鹽緩沖液（PBS）中洗凈殘血，分離左心室前壁，于4%的多聚甲醛固定12 h，石蠟包埋。應(yīng)用TUNEL 凋亡檢測(cè)試劑盒，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。主要流程如下: 切片脫蠟脫水；1%TritonX-100通透液促滲；3%H2O2封閉液封閉內(nèi)源性過氧化酶（POD） 10 min；蛋白酶K通透30 min；加50 μl TdT反應(yīng)液，37℃，1 h；加50 μl Streptavidin-FITC工作液，37℃避光反應(yīng)30 min；加POD-conjugated Anti-FITC 50 μl ，37℃避光反應(yīng)30 min；二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色、蘇木精復(fù)染、水洗、脫水透明、封片、鏡檢。每次試劑反應(yīng)后均用PBS沖洗，每次5 ml，洗3次。上述步驟不加TdT 為陰性對(duì)照。光鏡下正常心肌細(xì)胞核呈藍(lán)色，凋亡細(xì)胞核為深淺不一的棕褐色，每張切片于缺血部位隨機(jī)選取8 個(gè)高倍視野（×400 ） ，分別記數(shù)凋亡心肌細(xì)胞數(shù)和心肌細(xì)胞總數(shù)并進(jìn)行匯總，以凋亡心肌細(xì)胞數(shù)占心肌細(xì)胞總數(shù)的百分比作為凋亡指數(shù)（AI）。

2 結(jié)果

藏紅花酸對(duì)大鼠缺血再灌注后血清CK-MB、TNF-α與IL-10含量的影響： 與假手術(shù)組相比，缺血再灌注組及藏紅花酸組CK-MB和TNF-α含量均明顯升高（P＜0.01），藏紅花酸組IL-10含量也明顯升高（P＜0.01）；而與缺血再灌注組相比，藏紅花酸組CK-MB和TNF-α含量明顯降低，IL-10含量明顯升高（P＜0.01）。表1

表1 各組大鼠血清CK-MB、TNF-α和IL-10含量比較

表1 各組大鼠血清CK-MB、TNF-α和IL-10含量比較

注： 與假手術(shù)組比較**P＜0.01; 與缺血再灌注組比較△△P＜0.01。 CK-MB：肌酸激酶MB同工酶 TNF-α：腫瘤壞死因子-α IL-10：白細(xì)胞介素-10

?

藏紅花酸對(duì)缺血再灌注后心肌細(xì)胞凋亡的影響： TUNEL染色結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，缺血再灌注組及藏紅花酸組心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯增加（P＜0.01）；與缺血再灌注組相比，藏紅花酸組凋亡指數(shù)明顯降低（P＜0.01），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。圖1

圖1 脫氧核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記檢測(cè)大鼠心肌細(xì)胞凋亡

3 討論

由于缺血性心臟病發(fā)病率和死亡率逐年增加，因此其關(guān)注度也逐年增加。心肌細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)已被認(rèn)為是心肌缺血再灌注損傷的主要機(jī)制，最近的研究證據(jù)表明，缺血開始即啟動(dòng)心肌細(xì)胞凋亡，再灌注將其放大并部分有助于整體心肌的死亡[11]。阻斷細(xì)胞凋亡過程可能會(huì)阻止收縮細(xì)胞的損失，最小化由缺血再灌注引起的心肌損傷，并延緩心肌頓抑和心力衰竭的發(fā)生[13,14]。同樣，降低局部缺血損傷后再灌注過程中的炎癥反應(yīng)在許多研究中已被證實(shí)是有益的[15,16]。

在本研究中，與假手術(shù)組相比，缺血再灌注組和藏紅花酸組的血清CK-MB濃度水平均升高，說明缺血再灌注可致心肌損傷，也說明我們的模型是成功的；而與缺血再灌注組相比，藏紅花酸組的CK-MB濃度則顯著降低，說明藏紅花酸可以減輕采用結(jié)扎左前降支方法建立的大鼠心肌梗死模型的心肌缺血/再灌注損傷。其機(jī)制可能與抑制心肌細(xì)胞凋亡，減弱炎癥反應(yīng)可能有助于藏紅花酸的心臟保護(hù)作用。

細(xì)胞凋亡是組織損傷繼發(fā)于短暫缺血再灌注損傷的重要機(jī)制。在本研究中，TUNEL法被用來研究心肌細(xì)胞凋亡，通過DNA片段出現(xiàn)的多少來判斷心肌細(xì)胞凋亡的多少。在缺血再灌注組缺血3小時(shí)后心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)類似于先前研究報(bào)道的關(guān)于缺血再灌注損傷大鼠心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)的數(shù)據(jù)[16]。經(jīng)50 mg/kg藏紅花酸預(yù)處理的藏紅花酸組大鼠心肌的凋亡指數(shù)顯著低于缺血再灌注組，這表明藏紅花酸在再灌注的早期階段的抗凋亡作用可能有助于以后心肌壞死的衰減。

急性心肌梗死后心肌壞死引起補(bǔ)體活化和自由基的產(chǎn)生，觸發(fā)TNF-α從梗死心肌中釋放。所分泌的TNF-α進(jìn)一步刺激促炎細(xì)胞因子，如IL-1β、IL-6、趨化因子、黏附分子從浸潤(rùn)的白細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞中釋放，引發(fā)細(xì)胞因子級(jí)聯(lián)反應(yīng)。 促炎細(xì)胞因子，如IL-1β，IL-6和TNF-α，已成為心肌功能障礙的主要損害因子[17,18]。促炎細(xì)胞因子進(jìn)一步促進(jìn)炎癥細(xì)胞粘附和浸潤(rùn)到心肌，并導(dǎo)致毛細(xì)血管阻塞、血管活性物質(zhì)及細(xì)胞毒性成分的釋放，最終引起急性組織損傷[19]。 但同時(shí)炎癥也是心臟損傷修復(fù)的重要因素。IL-10 是一種分子量相當(dāng)于18～21 kD的細(xì)胞因子；屬于輔助性T細(xì)胞2類因子（Th2）,

由各種淋巴細(xì)胞產(chǎn)生，在缺血再灌注損傷過程中，IL-10抑制活化的單核細(xì)胞，巨噬細(xì)胞合成多種細(xì)胞因子[IL-1、TNF-a、IL-6、粒細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）及IL-8]，調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞功能，誘導(dǎo)肥大細(xì)胞生長(zhǎng), 在下調(diào)炎癥反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[20],是目前非常受關(guān)注的抗炎介質(zhì)之一。

在本研究中，我們可以發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組相比，藏紅花酸組和缺血再灌注組的血清TNF-α和IL-10水平均顯著增高，說明缺血再灌注可以激活機(jī)體的炎癥反應(yīng)。與缺血再灌注組比較，藏紅花酸組血清TNF-α水平則顯著降低，而IL-10的含量則顯著升高，說明藏紅花酸可以抑制TNF-α，促進(jìn)IL-10的產(chǎn)生來減弱炎癥反應(yīng)，減輕其帶來的炎癥損害。因此，抑制炎癥反應(yīng)可能是藏紅花酸保護(hù)心肌對(duì)抗缺血再灌注損傷的機(jī)制之一。

總之，本研究的突出發(fā)現(xiàn)是藏紅花酸對(duì)缺血再灌注大鼠心肌有保護(hù)作用，其機(jī)制可能為抑制心肌細(xì)胞的凋亡和炎癥反應(yīng)能力。因此，藏紅花酸的這一對(duì)缺血再灌注心肌的顯著保護(hù)作用,具有很大的應(yīng)用前景，值得進(jìn)一步研究。

[1] Hausenloy DJ, Yellon DM. Myocardial ischemia-reperfusion injury: a neglected therapeutic target. J Clin Invest, 2013, 123: 92-100.

[2] Xie Z, Koyama T, Suzuki J, et al. Coronary reperfusionfollowingisehemia: different expression of bcl-2 and bax proteins, and cardimyoeyte apoptosis. Jpn Heart J, 2001, 42: 759-770.

[3] 趙亞玲, 敖虎山．心肌缺血再灌注損傷的研究進(jìn)展．中國循環(huán)雜志, 2011, 5: 396-398．

[4] Steffens S, Montecucco F, Mach F. The inflammatory response as a target to reduce myocardial ischaemia and reperfusion injury. Thromb Haemost, 2009, 102: 240-247.

[5] Xiang M, Yang M, Zhou C, et al. Crocetin prevents AGEs-induced vascular endothelial cell apoptosis. Pharmacol Res, 2006, 54: 268-274.

[6] Yang R, Yang L, Shen X, et al. Suppression of NF-κB pathway by crocetin contributes to attenuation of lipopolysaccharide-induced acute lung injury in mice. Eur J Pharmacol, 2012, 674: 391-396.

[7] Wang Y, Yan J, Xi L, et al. Protective effect of crocetin on hemorrhagic shock-induced acute renal failure in rats. Shock, 2012, 38: 63-67.

[8] Cao F, Sun D, Li C, et al. Long-term myocardial functional improvement after autologous bone marrow mononuclear cells transplantation in patients with ST-segment elevation myocardial infarction: 4 years follow-up. Eur Heart J, 2009, 30: 1986-1994.

[9] Chang G, Zhang D, Yu H, et al. Cardioprotective effects of exenatide against oxidative stress-induced injury. Int J Mol Med, 2013, 32: 1011-1020.

[10] Fang J, Fan L, Chen L, et al. Coronary effluent from postconditioned hearts promotes survival of mesenchymal stem cells under hypoxia. Scand Cardiovasc J, 2014, 48: 120-127.

[11] Pavione MA, Carmona F, de Castro M, et al. Late remote ischemic preconditioning in children undergoing cardiopulmonary bypass: a randomized controlled trial. J Thorac Cardiovasc Surg, 2012, 144: 178-183.

[12] Fliss H, Gattinger D. Apoptosis in ischemic and reperfused rat myocardium. Circ Res, 1996, 79: 949-956.

[13] Anselmi A, Abbate A, Girola F, et al. Myocardial ischemia, stunning, inflammation, and apoptosis during cardiac surgery: a review of evidence. Eur J Cardiothorac Surg, 2004, 25: 304-311.

[14] 高妮妮, 王芳, 廉哲勛. P13K-Akt-eNOS信號(hào)通路在三磷酸腺苷后處理減輕兔心肌缺血再灌注損傷中的作用, 中國循環(huán)雜志, 2014, 29: 59-63.

[15] Bao W, Hu E, Tao L, et al. Inhibition of Rho-kinase protects the heart against ischemia/reperfusion injury. Cardiovasc Res, 2004, 61: 548-558.

[16] Sun D, Huang J, Zhang Z, et al. Luteolin limits infarct size and improves cardiac function after myocardium ischemia/reperfusion injury in diabetic rats. PLoS One, 2012, 7: e33491.

[17] Ahn J, Kim J. Mechanisms and consequences of inflammatory signaling in the Myocardium. Curr Hypertens Rep, 2012, 14: 510-516.

[18] Woldbaek PR, Tonnessen T, Henriksen UL, et al. Increased cardiac IL-18 mRNA, pro-IL-18 and plasma IL-18 after myocardial infarction in the mouse; a potential role in cardiac dysfunction. Cardiovasc Res, 2003, 59: 122-131.

[19] Liu X, Shen J, Jin Y, et al. Recombinant human erythropoietin (rhEPO) preconditioning on nuclear factor-kappa B (NF-kB) activation & proinflammatory cytokines induced by myocardial ischaemiareperfusion. Indian J Med Res, 2006, 124: 343-354.

[20] Frangogiannis NG, Mendoza LH, Lindsey ML, et al. IL-10 is induced in the reperfused myocardium and may moduiate the reaction to injury. J Immunoi, 2000, 165: 798-808.

Effect of Crocetin Pretreatment on Inflammatory Reaction and Apoptosis of Myocardial Ischemiareperfusion Injury in Experimental Rats

SUN Jing-wu, WANG Yan-yan, FANG Can.
Department of Cardiology, Affliated Yantai Hospital of Binzhou Medical College, Yantai (264100), Shandong, China

Objective: To explore the effect and mechanism of crocetin (CRO) pretreatment on inflammatory reaction and apoptosis of myocardial ischemia-reperfusion (I/R) injury in experimental rats.

Crocetin; Myocardial ischemia reperfusion injury; infammation; Apoptosis

2014-05-26)

（編輯：常文靜）

264100 山東省煙臺(tái)市 ， 濱州醫(yī)學(xué)院煙臺(tái)附屬醫(yī)院 心內(nèi)科（孫經(jīng)武、王艷艷），消化內(nèi)科（房燦）

孫經(jīng)武 主任醫(yī)師 教授 碩士研究生導(dǎo)師 主要從事心血管疾病的基礎(chǔ)與臨床研究 Email： bysjw@163.com 通訊作者：孫經(jīng)武

R54

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1000-3614（2015）02-0172-04

10.3969/j.issn.1000-3614.2015.02.019