何思潤，胡敏，秦群，楊瑞

（中南大學(xué)湘雅醫(yī)院，湖南 長沙 410008）

·臨床論著·

甲基蓮心堿聯(lián)合伊馬替尼對慢性粒細(xì)胞白血病原代細(xì)胞Akt/p-Akt蛋白表達(dá)的影響

何思潤，胡敏，秦群，楊瑞

（中南大學(xué)湘雅醫(yī)院，湖南 長沙 410008）

目的探討甲基蓮心堿（Nef）聯(lián)合伊馬替尼（IM）對慢性粒細(xì)胞白血?。–ML）原代細(xì)胞Akt/p-Akt表達(dá)的影響。方法采用Western blot法分別檢測Akt/p-Akt蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果Nef（4μmol）、IM（1μmol）單藥組與Nef（4μmol）+IM（1μmol）聯(lián)合用藥組，對CML原代細(xì)胞Akt蛋白的表達(dá)均無影響（P＞0.05），而p-Akt蛋白表達(dá)均降低，且聯(lián)合用藥組較單藥組蛋白表達(dá)更低（P＜0.05）。結(jié)論Nef聯(lián)合伊馬替尼能夠降低CML原代細(xì)胞p-Akt蛋白表達(dá)，可能是甲基蓮心堿增強(qiáng)伊馬替尼對CML原代細(xì)胞敏感性的機(jī)制之一。

甲基蓮心堿；慢性粒細(xì)胞白血病原代細(xì)胞；p-Akt；Akt

慢性粒細(xì)胞白血?。╟hronicmyelocytic leukemia，CML）是一種多能造血干細(xì)胞的惡性骨髓增殖性疾病，Bcr/abl融合基因是CML發(fā)病的分子基礎(chǔ)，伊馬替尼是Bcr/abl的特異性抑制劑[1]。研究發(fā)現(xiàn)，甲基蓮心堿（neferine，Nef）聯(lián)合伊馬替尼（imatinib，IM）能夠增強(qiáng)K562/G01增殖抑制作用[2]。本實驗研究甲基蓮心堿聯(lián)合伊馬替尼對CML原代細(xì)胞Akt/p-Akt的表達(dá)影響，從中探討甲基蓮心堿聯(lián)合伊馬替尼對CML原代細(xì)胞敏感性影響的可能機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集中南大學(xué)湘雅醫(yī)院門診2012年10月-2013年2月初診為慢性粒細(xì)胞白血病慢性期患者3例，年齡18～59歲，平均33.75歲；Ph染色體陽性或Bcr/ abl融合基因陽性。

1.2 主要儀器與試劑

伊馬替尼（瑞士諾華公司惠贈），甲基蓮心堿（華中科技大學(xué)藥理學(xué)實驗室惠贈），1640培基（Gibco/BRL），小牛血清（杭州四季青公司），BCA蛋白分析定量試劑盒（江蘇碧云天生物技術(shù)研究所），蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（美國Genview公司），兔抗Akt抗體，兔抗p-Akt（ser473）（美國Cell Signaling Technology公司），5×SDS-蛋白上樣緩沖液（江蘇碧云天生物技術(shù)研究所）。

1.3 實驗方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)門診收集的骨髓標(biāo)本在3 h內(nèi)于無菌操作臺內(nèi)以密度梯度離心法進(jìn)行單個核細(xì)胞的提取和分離。調(diào)整細(xì)胞密度為5×106個/ml，于每孔1 600μl細(xì)胞懸液接種于6孔板，置于37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育4 h后，按分組加入藥物，使終體積為2 000μl，藥物終濃度及實驗分組如下：CML細(xì)胞懸液+400μl無藥組；CML細(xì)胞懸液+400μl Nef（4μmol）；CML細(xì)胞懸液+400μl IM（1μmol）；CML細(xì)胞懸液+200μlIM（1μmol）+200μlNef（4μmol）。按上述分組干預(yù)細(xì)胞后，置37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。

1.3.2 抽提蛋白按上述方法處理CML原代細(xì)胞經(jīng)48 h后，每組取1.5 ml，離心棄上清液，經(jīng)PBS清洗兩遍棄上清液，得細(xì)胞沉淀，向其中加入100μl RIPA蛋白裂解液，充分吹打后置冰上20 min，4℃，12 000 r/min，離心10 min，吸取上清液，提取蛋白質(zhì)。

1.3.3 檢測Akt蛋白的表達(dá)水平提取各組蛋白質(zhì)，對其進(jìn)行蛋白定量和變性，行10%SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯（polyviny-lidene fluoride，PVDF）膜，加入含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液封閉；將Akt和p-Akt抗體及內(nèi)參稀釋后，將目的和內(nèi)參膜分別放入到Akt、p-Akt和內(nèi)參的一抗工作液中，4℃孵育過夜；洗膜30 min，將洗好的反應(yīng)膜轉(zhuǎn)至對應(yīng)的已稀釋好的抗兔Akt二抗、抗兔p-Akt抗體及內(nèi)參工作液中孵育1 h；洗膜30 min。采用ECL試劑盒進(jìn)行顯影（按A∶B按體積比為1∶1充分混合）。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，資料符合正態(tài)分布且各組方差齊，直接用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計資料方差分析，若結(jié)果有統(tǒng)計學(xué)意義，進(jìn)一步用LSD-t檢驗作兩兩之間比較；若資料不符合正態(tài)分布或方差不齊時，用非參數(shù)檢驗的Fridman M檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

將p-Akt和Akt條帶灰度與β-actin的灰度比作為待測蛋白的相對表達(dá)量。結(jié)果顯示，Nef（4μmol）組、IM（1μmol）組及Nef（4μmol）+IM（1μ mol）組，對Akt蛋白表達(dá)均無影響（P＞0.05），而p-Akt蛋白表達(dá)均降低，Nef（4μmol）+IM（1μmol）組較IM（1μmol）組更降低p-Akt蛋白表達(dá)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見附表。

附表 Nef與IM對CML原代細(xì)胞Akt總蛋白和p-Akt蛋白表達(dá)的影響（n=3±s）

附表 Nef與IM對CML原代細(xì)胞Akt總蛋白和p-Akt蛋白表達(dá)的影響（n=3±s）

注：1）與Nef（4μmol）組比較，P＜0.01；2）與IM（1μmol）組比較，P＜0.05

組別Akt/actin灰度比值p-Akt/actin灰度比值對照組0.390±0.0380.346±0.023 Nef（4μmol）0.396±0.0480.319±0.032 IM（1μmol）0.389±0.0380.077±0.0151）Nef（4μmol）+IM（1μmol）0.414±0.0690.040±0.0072）

3 討論

慢性粒細(xì)胞白血病是由9號染色體的ABL基因易位與22號染色體的BCR融合，形成有酪氨酸激酶活性的BCR-ABL融合基因，進(jìn)而引起慢性粒細(xì)胞白血病[3]。伊馬替尼是第一代酪氨酸激酶抑制劑，通過與BCR-ABL激酶結(jié)合，使蛋白穩(wěn)定在一個非活化構(gòu)象而發(fā)揮功能[4]。國際研究中心（IRIS）研究干擾素和伊馬替尼的臨床試驗結(jié)果顯示，伊馬替尼對初診為慢性粒細(xì)胞白血病的慢性期患者的療效優(yōu)于干擾素和阿糖胞苷，是慢性粒細(xì)胞白血病的一線治療藥物[5]。

甲基蓮心堿是從睡蓮科植物蓮成熟種子的綠色胚芽中提取的一種雙芐基異喹啉生物堿，具有抗氧化、抗心律失常、抗血小板聚集、擴(kuò)血管、降壓及化療增敏等藥理作用[6]。研究顯示，甲基蓮心堿在無毒劑量下能增強(qiáng)伊馬替尼對K562/G01細(xì)胞的增殖抑制作用[2，7]。

Akt是PI3K/AKT/通路中的關(guān)鍵基因，在慢性粒細(xì)胞白血病患者中，PI3K/Akt通路被bcr/abl基因持續(xù)激活，Akt磷酸化（p-Akt），p-Akt激活下游靶分子，使通道活性增加，影響骨髓基質(zhì)粘附性，影響細(xì)胞增殖以及凋亡，對CML細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展起調(diào)控作用[8-9]。本研究采用Western blot法檢測Akt/p-Akt蛋白的表達(dá)水平，探討甲基蓮心堿聯(lián)合伊馬替尼對CML原代細(xì)胞影響及可能的增敏機(jī)制。實驗結(jié)果顯示，甲基蓮心堿聯(lián)合伊馬替尼能降低p-Akt蛋白表達(dá)，作者推測，甲基蓮心堿可增強(qiáng)伊馬替尼對慢性粒細(xì)胞白血病原代細(xì)胞的敏感性，可能與降低p-Akt蛋白表達(dá)有關(guān)。本研究采用的病例標(biāo)本檢測還較少，還有待進(jìn)一步研究。

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（張蕾 編輯）

Effect of Neferine combined with Imatinib on Akt/p-Akt protein expression in primary cells of chronic myelogenous leukemia

Si-run HE,Min HU,Qun QIN,Rui YANG
(Xiangya Hospital,Central South University,Changsha,Hunan 410008,P.R.China)

【Objective】To investigate the effect of a combination of Neferine and Imatinib on Akt/p-Akt protein expression in chronic myelogenous leukemia(CML)primary cells.【Methods】Akt/p-Akt protein expression was detected by Western blot.【Results】Neither Neferine(4 μmol),Imatinib(1 μmol)alone nor their combination had influence on the Akt protein expression in CML primary cells(P＞0.05).On the contrary,p-Akt expression was reduced in the three groups,and even lower in the combination group(P＜0.05).【Conclusions】p-Akt protein expression is reduced by the combination of Neferine and Imatinib,which may be one of the mechanisms of Neferine sensitizing CML primary cells to Imatinib.

Neferine；chronic myelogenous leukemia primary cell；p-Akt；Akt

R557.3

A

1005-8982（2015）30-0037-03

2015-04-09

秦群，Tel：0731-84327918；E-mail：qinqun8087@hotmail.com