薛 梅，朱俊平

（山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院，山東濰坊 261061）

山東濰坊市部分奶牛場奶牛乳房炎病原菌的分離鑒定及耐藥性檢測

薛 梅，朱俊平

（山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院，山東濰坊 261061）

為了解濰坊市當(dāng)前奶牛乳房炎的發(fā)病以及病原菌的種類和耐藥性情況，為該地區(qū)奶牛乳房炎的防治提供參考，采集濰坊市6個奶牛場臨床型和隱性型乳房炎奶樣各100份，進(jìn)行了細(xì)菌分離和鑒定。結(jié)果細(xì)菌檢出率為91.50%（183/200），細(xì)菌混合感染奶樣占檢出細(xì)菌奶樣的84.70%（155/183）；共分離到265株細(xì)菌，其中鏈球菌（無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、乳房鏈球菌）占38.11%，金黃色葡萄球菌占34.34%，大腸桿菌占16.98%，這些是引起奶牛乳房炎的主要病原菌。將這些病原菌進(jìn)行藥物敏感試驗，結(jié)果顯示，敏感率高的藥物依次是頭孢喹肟（80.59%）、恩諾沙星（68.35%）、頭孢噻呋（68.35%）和氟苯尼考（67.51%），耐藥率高的藥物依次是青霉素（37.97%）、鏈霉素（26.16%）和四環(huán)素（10.55%）。

奶牛乳房炎；病原菌；分離鑒定；耐藥性

奶牛乳房炎嚴(yán)重制約著奶牛產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，其不僅能使牛乳產(chǎn)量和質(zhì)量下降，還會因盲目使用抗菌藥，導(dǎo)致耐藥菌株增多，牛乳中藥物殘留升高，危害人類健康[1-2]。研究表明[3]，引起奶牛乳房炎的病原微生物有150多種，其種類與地域、環(huán)境等因素密切相關(guān)。及時準(zhǔn)確地掌握本地區(qū)奶牛乳房炎病原菌的種類和耐藥情況是治療該地區(qū)奶牛乳房炎的關(guān)鍵。

近十年來，濰坊地區(qū)奶牛養(yǎng)殖業(yè)迅猛發(fā)展，奶牛乳房炎的發(fā)病率也在不斷升高[4]，因此開展奶牛乳房炎病原菌調(diào)查及抗菌藥耐藥性檢測具有重要意義。

1 試驗材料

1.1 培養(yǎng)基

普通營養(yǎng)瓊脂、營養(yǎng)肉湯、改良艾德華瓊脂、S-S瓊脂、麥康凱瓊脂以及細(xì)菌生化微量鑒定管，購自杭州濱和微生物試劑有限公司；綿羊血瓊脂，由山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院防疫與檢疫實驗室按郭霄峰[5]提供的方法制備。

1.2 藥敏紙片

制備青霉素、鏈霉素、阿莫西林、阿米卡星、四環(huán)素、氟苯尼考、恩諾沙星、洛美沙星、頭孢噻呋、頭孢喹肟等藥敏紙片的原材料，金黃色葡萄球菌（ATCC25923）和大腸桿菌（ATCC25922），購自杭州濱和微生物試劑有限公司；藥敏紙片，由山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院動物藥理實驗室按賈玉萍[6]、胡桂學(xué)[7]、丁伯良等[8]提供的方法制備。

1.3 診斷試劑

LMT乳房炎診斷試劑，購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所。

2 方法

2.1 乳樣采集[9]

在濰坊市6個奶牛場，選取臨床型乳房炎乳區(qū)100個和隱性乳房炎陽性（用LMT乳房炎診斷試劑進(jìn)行快速診斷）乳區(qū)100個[10-11]，共采集樣品200份。采樣前，用碘酊消毒乳頭酒精脫碘后，廢棄每個乳頭前2～3把奶，每份采集15～20mL乳樣，盛于滅菌的錐形瓶中，標(biāo)明牛號、乳區(qū)、日期等，置4℃冰箱冷藏保存。

2.2 病原菌的分離培養(yǎng)[12]

從每份奶樣中無菌取5mL置于滅菌離心管中，3000r/min 離心10min，棄去離心管中的上層液體，吸取0.1mL沉淀物分別接種于普通營養(yǎng)瓊脂和綿羊血瓊脂平板，置37℃溫箱中培養(yǎng)24～48h。觀察菌落形態(tài)、生長特征，并進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢。

將符合鏈球菌形態(tài)特征的菌株接種于改良愛德華培養(yǎng)基，將符合葡萄球菌形態(tài)特征的菌株接種于綿羊血瓊脂平板，將符合革蘭氏陰性桿菌形態(tài)的菌株接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基和S-S瓊脂培養(yǎng)基，初步判定細(xì)菌種類，并純化培養(yǎng)，將純培養(yǎng)物保存于試管斜面培養(yǎng)基內(nèi)。

如果在普通瓊脂平板上形成圓形、整齊光滑、金黃色的菌落，在血液瓊脂平板上形成明顯的溶血環(huán)，革蘭氏染色陽性，形態(tài)球形、葡萄串狀排列，則初步判定為金黃色葡萄球菌。

如果在血液瓊脂平板上形成圓形，光滑濕潤的菌落，周圍形成透明的溶血環(huán)，在改良愛德華瓊脂平板上，呈淺紫色、褐色或黑色的單個菌落，革蘭氏染色陽性，形態(tài)球形或卵圓形，多為短鏈狀排列，則初步判定為鏈球菌。

如果在營養(yǎng)瓊脂平板上形成圓形、整齊光滑的菌落，部分在綿羊血瓊脂平板上溶血，在麥康凱瓊脂上形成紅色菌落，在SS瓊脂上多數(shù)不生長或生長很差，生長者呈紅色，革蘭氏染色陰性，形態(tài)短桿狀，則初步判定為大腸桿菌。

如果在SS瓊脂平板上形成無色半透明、中等大小、表面光滑的菌落，則初步判定為沙門氏菌。

如果在普通瓊脂平板上形成光滑、隆起、邊緣整齊的菌落，培養(yǎng)基逐漸變?yōu)辄S綠色；在血液瓊脂平板上，菌落周圍形成溶血環(huán)，革蘭氏染色陰性，形態(tài)短桿狀，單個、成對或偶爾成短鏈排列，則初步判定為綠膿桿菌。

2.3 細(xì)菌生化鑒定

根據(jù)孔憲剛等[13]提供的方法，將分離純化的細(xì)菌分類增菌后，分別進(jìn)行生化鑒定。將革蘭氏陰性桿菌用腸桿菌科細(xì)菌生化編碼鑒定管GYZ—15e等進(jìn)行生化鑒定；將葡萄球菌用葡萄球菌屬細(xì)菌生化編碼鑒定管TH—16s等進(jìn)行生化鑒定；將鏈球菌進(jìn)行CAMP試驗及鏈球菌生化鑒定，包括馬尿酸鈉水解試驗，甘露醇、山梨醇和七葉苷發(fā)酵試驗等；將綠膿桿菌進(jìn)行葡萄糖、蔗糖發(fā)酵試驗，枸櫞酸鹽利用試驗、明膠液化試驗、甲基紅試驗、V-P試驗、靛基質(zhì)試驗、H2S試驗等。各類細(xì)菌的生化特性見表1、表2、表3。

2.4 藥敏試驗

按丁伯良等[8]提供的方法進(jìn)行紙片擴(kuò)散法藥敏試驗，并根據(jù)丁伯良等[8]提供的各種抗生素藥物敏感試驗判定標(biāo)準(zhǔn)，判定敏感（S）、中介（I）和耐藥（R）。

3 結(jié)果

表1 球菌的主要生化特性

表2 腸桿菌的主要生化特性

表3 綠膿桿菌的主要生化特性

3.1 細(xì)菌分離鑒定結(jié)果

100份臨床型乳房炎奶樣中，94份有細(xì)菌生長。其中，細(xì)菌單獨(dú)感染的奶樣有20份，占檢出細(xì)菌奶樣的21.28%；混合感染的奶樣74份，占檢出細(xì)菌奶樣的78.72%。共分離到138株細(xì)菌。其中，鏈球菌（無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、乳房鏈球菌）62株，占44.93%；金黃色葡萄球菌47株，占34.06%；大腸桿菌16株，占11.59%。具體結(jié)果見表4。

100份隱性乳房炎奶樣中，89份有細(xì)菌生長。其中，細(xì)菌單獨(dú)感染的奶樣有25份，占檢出細(xì)菌奶樣的29.09%；混合感染的奶樣64份，占檢出細(xì)菌奶樣的71.91%。共分離到127株細(xì)菌。其中，金黃色葡萄球菌44株，占34.65%；鏈球菌（無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、乳房鏈球菌）39株，占30.71%；大腸桿菌29株，占22.83%。具體結(jié)果見表4。

總體來看，200份乳房炎奶樣中，183份有細(xì)菌生長。其中，細(xì)菌單獨(dú)感染的奶樣45份，占檢出細(xì)菌奶樣的24.59%；混合感染的奶樣155份，占檢出細(xì)菌奶樣的84.70%。共分離到265株細(xì)菌。其中，鏈球菌（無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、乳房鏈球菌）101株，占38.11%；金黃色葡萄球菌91株，占34.34%；大腸桿菌45株，占16.98%。這些細(xì)菌是引起該地區(qū)奶牛乳房炎的主要病原菌。

3.2 藥敏試驗結(jié)果

對奶牛乳房炎的主要病原菌采用紙片擴(kuò)散法進(jìn)行藥敏試驗。結(jié)果顯示，對金黃色葡萄球菌分離株敏感率高的藥物依次是頭孢喹肟（83.52%）、恩諾沙星（71.43%）、頭孢噻呋（70.33%）和氟苯尼考（70.33%），耐藥率高的依次是青霉素（51.65%）和鏈霉素（42.86%）；對無乳鏈球菌分離株敏感率高的藥物依次是頭孢喹肟（71.43%）、阿莫西林（64.29%）和頭孢噻呋（61.90%），耐藥率高的依次是鏈霉素（19.05%）和四環(huán)素（16.67%）；對停乳鏈球菌分離株敏感的藥物依次是頭孢喹肟

（77.42%）、阿莫西林（70.97%）、恩諾沙星（64.52%）和青霉素（64.52%），耐藥率高的是洛美沙星（16.13%）和鏈霉素（12.90%）；對乳房鏈球菌分離株敏感率高的藥物依次是頭孢喹肟（78.57%）、氟苯尼考（67.86%）、阿莫西林（67.86%）、頭孢噻呋（67.86%）和洛美沙星（67.86%），耐藥率高的是鏈霉素（31.82%）和青霉素（18.18%）；對大腸桿菌分離株敏感率高的藥物依次是頭孢喹肟（86.67%）、阿米卡星（84.44%）和恩諾沙星（82.22%），耐藥率高的依次是青霉素（68.89%）和阿莫西林（17.78%）。具體結(jié)果見表5。

表4 200份乳房炎奶樣的細(xì)菌鑒定結(jié)果

總體來看，奶牛乳房炎主要病原菌各分離株敏感率高的藥物依次是頭孢喹肟（80.59%）、恩諾沙星（68.35%）、頭孢噻呋（68.35%）和氟苯尼考（67.51%），耐藥率高的依次是青霉素（37.97%）、鏈霉素（26.16%）和四環(huán)素（10.55%）。

4 討論

通過對濰坊市6個奶牛場100份臨床型乳房炎奶樣和100份隱性乳房炎奶樣主要病原菌的分離和鑒定，發(fā)現(xiàn)臨床型乳房炎奶樣的病原菌檢出率是94.0%，隱性乳房炎奶樣的病原菌檢出率是89.0%，檢出率高于張廣斌[4]2012年報道的64.54%，這說明病原菌感染已成為該地區(qū)奶牛乳房炎的主要致病因素。

在200份乳房炎奶樣中，共檢出金黃色葡萄球菌、鏈球菌（無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、乳房鏈球菌）、大腸桿菌、沙門氏菌和綠膿桿菌等7種病原菌，而鏈球菌（無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、乳房鏈球菌）、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌是目前引發(fā)該地區(qū)奶牛乳房炎的主要病原菌，這與張廣斌[4]、李振[14]等的報道一致。

細(xì)菌混合感染的奶樣占總奶樣的77.50%，占

檢出細(xì)菌奶樣的84.70%，這說明細(xì)菌混合感染已經(jīng)成為病原菌感染引起的奶牛乳房炎的主要類型，這會導(dǎo)致奶牛乳房炎臨床表現(xiàn)復(fù)雜，發(fā)病程度加重，治療難度增加。

表5 濰坊市6個奶牛場奶牛乳房炎主要病原菌藥敏試驗結(jié)果

藥敏試驗結(jié)果表明，對該地區(qū)奶牛乳房炎病原菌各分離株敏感率高的藥物依次是頭孢喹肟、恩諾沙星、頭孢噻呋和氟苯尼考，耐藥率高的依次是青霉素、鏈霉素和四環(huán)素。

抗生素在奶牛乳房炎的防治中發(fā)揮了重要作用，但是長期應(yīng)用抗生素導(dǎo)致了大量耐藥性細(xì)菌的滋生，使得常用抗菌藥物（青霉素、鏈霉素、四環(huán)素）很難發(fā)揮殺菌作用，而臨床使用時間相對較短的藥物（頭孢喹肟、恩諾沙星、頭孢噻呋和氟苯尼考）卻有較好的殺菌效果。因此，在臨床治療乳房炎時，最好先分離細(xì)菌，通過藥敏試驗選擇敏感藥物；若沒有條件進(jìn)行藥敏試驗，可優(yōu)先使用頭孢喹肟、恩諾沙星、頭孢噻呋和氟苯尼考等臨床使用時間相對較短的藥物。

[1]丁伯良，馮建忠，張國偉. 奶牛乳房炎[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2011：1-14.

[2]畢海林，唐達(dá)，唐建華. 奶牛乳房炎的研究進(jìn)展[J]. 黑龍江畜牧獸醫(yī)，2012（11上）：27-29.

[3]倪春霞，胡永浩，蒲萬霞，等．奶牛乳房炎病原菌的分離鑒定與耐藥性分析[J]. 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報，2010，19（2）：20-24.

[4]張廣斌. 濰坊地區(qū)奶牛隱性乳房炎主要病原菌的分離鑒定[J]. 山東畜牧獸醫(yī)，2012（9）：1-3.

[5]姚火春. 獸醫(yī)微生物學(xué)實驗指導(dǎo)[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2001：21.

[6]賈玉萍. 奶牛乳房炎病原菌快速檢測及藥物敏感性試驗方法研究[D]. 泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2005.

[7]胡桂學(xué). 獸醫(yī)微生物學(xué)實驗教程[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2006：71-77.

[8]丁伯良，馮建忠，張國偉. 奶牛乳房炎[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2011：183-189.

[9]趙戰(zhàn)峰，宋軍科，于三科. 奶牛乳房炎病原菌的分離鑒定[J]. 動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2010（4）：113-115.

[10]張廣斌. 奶牛隱性乳房炎檢測方法的比較研究[J]. 山東畜牧獸醫(yī)，2012（8）：6-7.

[11]李曉楠. 呼和浩特地區(qū)奶牛乳腺炎發(fā)病率調(diào)查[J]. 黑龍江畜牧獸醫(yī)，2013（1下）：90-91.

[12]東秀珠，蔡妙英. 常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊[M]. 北京：科學(xué)出版社，2001：132-134.

[13]孔憲剛．獸醫(yī)微生物學(xué)[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2013：135-225.

[14]李振. 臨沂市奶牛乳房炎病原菌的分離鑒定與藥敏試驗[J]. 中國微生態(tài)學(xué)雜志，2011，23（7）：629-631.

（責(zé)任編輯：朱迪國）

Isolation and Identif cation of Pathogenic Bacteria in Cows with Mastitis in Weifang and the Drug Resistance Test

Xue Mei，Zhu Junping
（Shandong Vocational Animal Science and Veterinary College，Weifang，Shandong 261061）

In order to understand the cow mastitis situation，kinds of pathogenic bacteria and drug resistance status，provide

for prevention in Weifang，100 milk samples were collected from 6 dairy cattle farms each with clinical or recessive mastitis in Weifang for pathogenic bacteria isolation and identifi cation，resulting in bacteria detection rate of 91.50%. Milk samples with mixed bacteria infection reached 84.70%. 265 bacteria strains were isolated，including 38.11% Streptococcus strains（S. agalactiae，S. dysgalactiae and S. uberis），34.34% Staphylococcus aureus and 16.98% E. coli，forming the dominant pathogenic bacteria of dairy cow mastitis in Weifang. The drug sensitivity test of the dominant mastitis bacteria strains in Weifang indicated that the high sensitive drugs were cefquinome （80.59%），enrofl oxacin（68.35%），ceftiofur（68.35%）and fl orfenicol（67.51%）and the high resistant drugs were penicillin（37.97%），streptomycin（26.16%）and tetracycline（10.55%）.

cow mastitis；pathogenic bacteria；isolation and identifi cation；drug resistance

S852.61；S859.79+6

B

1005-944X（2015）08-0019-05