王苗利，王貴升，孫圣福，徐 鴻，徐 聰，尹斐斐，劉麗平，陳 靜

（山東省動物疫病預(yù)防與控制中心，山東濟(jì)南 250022）

生物發(fā)酵法處理病死豬后堆體溫度及微生物含量的跟蹤監(jiān)測

王苗利1，王貴升2，孫圣福2，徐 鴻2，徐 聰2，尹斐斐2，劉麗平2，陳 靜

（山東省動物疫病預(yù)防與控制中心，山東濟(jì)南 250022）

[目的]研究利用生物發(fā)酵技術(shù)對病死豬進(jìn)行無害化處理后發(fā)酵堆體的溫度及其微生物含量的變化情況。[方法]本試驗(yàn)利用溫度探頭分層埋堆全程記錄、細(xì)菌學(xué)計(jì)數(shù)和熒光RT-PCR/RT-PCR檢測等方法對臨沂市沂水縣某豬場的病死豬生物發(fā)酵無害化處理技術(shù)效果進(jìn)行跟蹤監(jiān)測和評估。[結(jié)果]經(jīng)21天監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵溫度最高達(dá)70℃；試驗(yàn)病毒均已被殺滅；細(xì)菌含量（CFU）也分別由A組的1.33×108下降至1.37×103、B組的3.26×107下降至1.62×103。[結(jié)論]研究結(jié)果表明，此場生物發(fā)酵堆體上、中、下三層中層的溫度最高，最高溫度出現(xiàn)在第3天～9天之間，達(dá)到70℃左右，堆體發(fā)酵溫度受環(huán)境溫度的影響較大；發(fā)酵法對病毒和細(xì)菌的殺滅效果顯著。

生物發(fā)酵；平板計(jì)數(shù)；熒光RT-PCR；無害化處理

被丟棄的病畜禽尸體所帶的細(xì)菌、病毒會隨空氣或其他途徑迅速傳播擴(kuò)散，如果是重大動物疫病或人畜共患病，會造成重大動物疫情或人畜共患病發(fā)生，人畜生命安全就會受到威脅，經(jīng)濟(jì)就會受到嚴(yán)重?fù)p失，影響畜牧養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展[1]。病死畜禽的無害化處理是消滅傳染源最有效和最徹底的措施，特別是當(dāng)前正值重大動物疫病防控的重要階段和食用農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全水平全面提升的關(guān)鍵時(shí)期[2]。隨著畜牧業(yè)生產(chǎn)規(guī)模不斷擴(kuò)大，養(yǎng)殖密度不斷增加，豬感染病原機(jī)會增多，病原變異幾率加大，新發(fā)疫病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增加。開展生物發(fā)酵法無害化處理病死豬是發(fā)展生態(tài)畜牧業(yè)的需求。

目前，國內(nèi)外規(guī)?；B(yǎng)殖生產(chǎn)中常采用的畜禽尸體無害化處理方法主要包括：焚燒法，需要投入

專門設(shè)備和油、電等，可對環(huán)境造成不利影響；高溫處理法，受設(shè)施的局限性非常大；掩埋法，需要專用場地，易造成地下水污染，常會留下疫情隱患；傳統(tǒng)發(fā)酵法，對尸體坑的建設(shè)位置及建筑質(zhì)量要求較高，而且處理尸體所需時(shí)間較長，后期管理難度高。因此，尋求有效、方便、環(huán)保的病死畜禽的無害化處理技術(shù)方法顯得尤為必要，

生物發(fā)酵床養(yǎng)豬技術(shù)起源于日本民間，在日本、韓國被大力推廣和廣泛應(yīng)用，是近年我國引進(jìn)的一項(xiàng)新興養(yǎng)豬技術(shù)，又稱“自然養(yǎng)豬法”、“零排放養(yǎng)豬法”或“生物環(huán)保養(yǎng)法”［3］。生物發(fā)酵床養(yǎng)豬技術(shù)是根據(jù)微生態(tài)理論，利用自然界的微生物資源，按一定比例將其與鋸末、谷殼等輔助材料、活性劑等混合和發(fā)酵制成豬圈有機(jī)墊料，使豬糞、尿中的有機(jī)物質(zhì)得到充分的分解和轉(zhuǎn)化，達(dá)到無臭、無味、無害化的目的，是一種無污染、無排放、無臭氣的環(huán)保養(yǎng)豬技術(shù)[4]。對生物發(fā)酵法無害化處理病死畜禽技術(shù)進(jìn)行效果追蹤監(jiān)測及評估，為開展病死豬無害化處理的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 法國科瑪嘉顯色定位培養(yǎng)基（批號：LOT646）、麥康凱選擇培養(yǎng)基（批號：1303271）、TSA培養(yǎng)基（批號：20120829，青島高科園海博生物技術(shù)有限公司）、法國生物梅里埃ID32E生化反應(yīng)條（批號：1002551050）、熒光RT-PCR/ RT-PCR檢測試劑盒

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 溫度記錄 本試驗(yàn)于2013年7月份在臨沂市沂水縣某豬場進(jìn)行，試驗(yàn)組先后設(shè)計(jì)了2組堆體試驗(yàn)，分別為A組、B組。同時(shí)試驗(yàn)對A組進(jìn)行了溫度追蹤結(jié)果，測定時(shí)，結(jié)合生產(chǎn)操作，將溫度記錄儀探頭于埋入病死豬同時(shí)埋入墊料堆中，探頭埋入深度分別為距離堆體表面40～50 cm、20～30 cm及3～5 cm。連續(xù)監(jiān)測整個(gè)處理周期（28天）堆體的溫度變化情況，同時(shí)記錄環(huán)境溫度。

1.2.2 樣品采集 本次實(shí)驗(yàn)共對兩組堆體的樣品進(jìn)行采集，分別為A組、B組，結(jié)合生產(chǎn)操作，于埋入病死豬前0 d、7 d、14 d、21 d分別取樣，其中A組跟蹤到第28天。取樣位置按照堆體對角線布置4個(gè)點(diǎn)，每個(gè)采樣點(diǎn)分表層3～5 cm、中心20～30 cm、深部40～50 cm進(jìn)行取樣，每個(gè)樣品200 g左右，塑料袋密封。

1.2.3 病毒檢測 對采集的樣品經(jīng)過常規(guī)處理后，進(jìn)行病毒檢測，檢測的病毒種類、檢測方法和鑒定方法，見表1。

表1 病毒檢測種類、檢測和鑒定方法

1.2.4 細(xì)菌計(jì)數(shù) 對采集的樣品進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，方法按照GB/T 4789.28-2003進(jìn)行。

樣品稀釋：稱取25 g樣品置盛有225 mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質(zhì)杯內(nèi)，8 000 r/ min～10 000 r/min均質(zhì)1 min～2 min，制成1∶10的樣品勻液；用1 mL無菌吸管或微量移液器吸取1∶10樣品勻液1 mL，沿管壁緩慢注于盛有9mL稀釋液的無菌試管中（注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面），振搖試管或換用1支無菌吸管反復(fù)吹打使其混合均勻，制成1∶100的樣品勻液。依次進(jìn)行制備10倍系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋一次，換用1次1 mL無菌吸管或吸頭；根據(jù)對樣品污染狀況的估計(jì)，選擇2個(gè)～3個(gè)適宜稀釋度的樣品勻液，在進(jìn)行10倍遞增稀釋時(shí)，吸取1mL樣品勻液于無菌平皿內(nèi)，每個(gè)稀釋度做兩個(gè)平皿。同時(shí)，分別吸取 1mL 空白稀釋液加入兩個(gè)無菌平皿內(nèi)作空白對照；及時(shí)將 15mL～20mL 冷卻至 46 ℃的平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基（可放置于 46 ℃±1 ℃恒溫水浴箱中保溫）傾注平皿，并轉(zhuǎn)動平皿使其混合均勻。培養(yǎng)：待瓊脂凝固后，將平板翻轉(zhuǎn)，36 ℃±1 ℃培養(yǎng) 48 h±2 h。

菌落計(jì)數(shù)：可用肉眼觀察，必要時(shí)用放大鏡或菌落計(jì)數(shù)器，記錄稀釋倍數(shù)和相應(yīng)的菌落數(shù)量。菌落計(jì)數(shù)以菌落形成單位（CFU）表示。

2 結(jié)果

2.1 溫度記錄結(jié)果

試驗(yàn)對A組進(jìn)行了溫度追蹤結(jié)果，A組結(jié)果見表2，每天溫度變化趨勢圖見圖1。

表2 A組溫度記錄結(jié)果

圖1 A組每日平均溫度變化趨勢圖

由表1、圖1可知，通過對堆體上、中、下三層的溫度一個(gè)月的追蹤監(jiān)測，堆體中層的溫度普遍高于上、下兩層的溫度；堆體中層的發(fā)酵最高溫度出現(xiàn)在第3天～9天之間，能維持約7天，達(dá)到70℃左右 ；且堆體溫度變化隨環(huán)境溫度變化而變化，趨勢吻合。

2.2 熒光RT-PCR/ RT-PCR檢測樣品中病毒的結(jié)果生物發(fā)酵法無害化處理病死豬對病毒的殺滅情況檢測結(jié)果，見表3，不同病毒對溫度的耐受力，見表4。由表3可知，B組在試驗(yàn)全程未檢測到目標(biāo)病毒。A組在0d僅檢出藍(lán)耳病毒，但也在經(jīng)7d的發(fā)酵后被殺滅，直至28d均未檢測出。由表4可知，大多數(shù)病毒（藍(lán)耳病毒、偽狂犬病毒、細(xì)小病毒、流感病毒）在56℃半個(gè)小時(shí)左右就能被殺滅，傳染性胃腸炎病毒、流行性腹瀉病毒在60℃左右被殺滅，圓環(huán)病毒抵抗力最強(qiáng)，70℃15min才能被殺滅。

表3 不同時(shí)間A、B組病毒檢測結(jié)果

表4 不同病毒溫度耐受力

2.3 細(xì)菌計(jì)數(shù)結(jié)果 通過細(xì)菌計(jì)數(shù)可知，制堆前A組、B組樣品CFU/g分別為1.33×108、3.26×107，制堆后兩組樣品第7、14、21天的樣品CFU結(jié)果見表5。

由表5可知，發(fā)酵堆在第14天的CFU達(dá)到一

致，均為104，在第21天達(dá)到103，并趨于穩(wěn)定，與第28天的CFU基本無異。

表5 A組、B組第7天、14天、21天平板計(jì)數(shù)結(jié)果（CFU/g）

3 討論

通過對堆體溫度跟蹤記錄可知，兩組堆體的中層溫度高于上下兩層，且維持時(shí)間較長，因此通過定期翻堆以及對環(huán)境溫度進(jìn)行控制和調(diào)節(jié)，能夠優(yōu)化堆體發(fā)酵的效果，使堆體發(fā)酵更均勻。

通過對堆體病毒及微生物的追蹤監(jiān)測可知，兩組無害化處理堆經(jīng)過21天的處理，兩組菌體含量下降明顯，達(dá)到3個(gè)數(shù)量級。說明采用此無害化方法處理病死豬，其殺滅微生物的效果非常顯著，理論上發(fā)酵時(shí)間設(shè)計(jì)到21天，微生物含量最低，用時(shí)最短，且發(fā)酵試驗(yàn)操作簡單，可重復(fù)性高。

生物發(fā)酵法無害化處理病死豬是近年來新興的生態(tài)無害化處理模式，尚無豬場生物發(fā)酵無害化處理技術(shù)效果相關(guān)的數(shù)據(jù)，因此，本試驗(yàn)通過對臨沂豬場采取的無害化處理堆體的溫度、病毒殺滅效果和微生物的含量進(jìn)行了全程的跟蹤監(jiān)測，為生物發(fā)酵技術(shù)處理病死畜禽方面提供了可靠有效的數(shù)據(jù)，對研究、發(fā)展及推廣生物發(fā)酵技術(shù)處理病死畜禽提供了有力的支撐。此法因其眾多的優(yōu)點(diǎn)受到國內(nèi)外廣大養(yǎng)殖戶喜愛，但在實(shí)際應(yīng)用過程中也存在一些不足的地方，例如夏季發(fā)酵舍內(nèi)溫度過高，若通風(fēng)不好，可導(dǎo)致工作環(huán)境較為惡劣，因此，相關(guān)工作人員應(yīng)做好相應(yīng)的防護(hù)措施。另外，如何進(jìn)一步提高生物發(fā)酵無害化處理病死豬的微生物殺滅效果，并進(jìn)行推廣，有待于進(jìn)一步研究。

[1] 方煥森. 淺談對病死畜禽無害化處理過程中存在的問題及對策[J]. 中國畜牧獸醫(yī)文摘，2011，27（5）：2-2.

[2] 王聯(lián)芳，朱新華. 病死畜禽無害化處理存在的問題及對策[J]. 醫(yī)學(xué)動物防制，2008，24（11）：876-877.

[3] 杜曉光，武俊海.發(fā)酵床養(yǎng)豬PK農(nóng)村戶用沼氣［J］.中國動物保健，2008（5）：26-28.

[4] 武華玉，喬木，彭先文，等. 對生物發(fā)酵床養(yǎng)豬技術(shù)的認(rèn)識[J]. 畜牧與飼料科學(xué)，2009，30（6）：101-102.

（責(zé)任編輯：胡藕祥）

Monitoring of Temperature and Micro-organism Amount in Stacks of Dead Pigs Treated with Bio-fermentation

Wang Miaoli1，Wang Guisheng2，Sun Shengfu，Xu Hong，Xu Cong，Yin Feifei，Liu Liping，Chen Jing
（Shandong Province Animal Disease Prevention and Control Center，Jinan City 250022）

[Objective]The experiment was designed to study the changes of temperature and microorganism amount in stacks of dead pigs treated with bio-fermentation. [Method] Temperature detectors，bacterium counting and fl uorescent RT-PCR/RT-PCR assays were used to monitor and assess the effect of bio-fermentation in pig farms in Yishui county，Shandong province. [Result]After 21 days monitoring，it was found that the highest fermentation temperature was up to 70℃，the 2 test viruses were all killed and the bacteria content （CFU） was decreased from 1.33×108to 1.37×103in group A，and from 3.26 × 107to 1.62×103in group B. [Conclusion]The experiment showed that the mid-layer in the stack reached the highest temperature of 70℃ lasting from the third to the ninth day；the fermentation was affected signifi cantly by the environment temperature；the bio-fermentation produced signifi cant killing effect on virus and bacterium.

bio-fermentation；plate count；fl uorescence RT-PCR；harmless treatment

X713

B

1005-944X（2015）08-0027-04

病死畜禽無害化處理技術(shù)推廣項(xiàng)目。

陳 靜