劉承軍，夏新萌，王海麗

（1.聊城市動(dòng)物醫(yī)院，山東聊城 252000；2.聊城市畜牧獸醫(yī)局，山東聊城 252000 3.聊城職業(yè)技術(shù)學(xué)院，山東聊城 252000）

鴨肝炎病毒對(duì)雛鴨腦組織損傷的研究

劉承軍1，夏新萌2，王海麗3

（1.聊城市動(dòng)物醫(yī)院，山東聊城 252000；2.聊城市畜牧獸醫(yī)局，山東聊城 252000 3.聊城職業(yè)技術(shù)學(xué)院，山東聊城 252000）

為系統(tǒng)研究鴨肝炎病毒（DHV）在腦組織引起的病理變化隨時(shí)間的發(fā)展變化規(guī)律，通過(guò)人工感染雛鴨DHV的方法建立DHV的疾病病理模型，運(yùn)用常規(guī)病理技術(shù)、組織中自由基的測(cè)定等方法，探索DHV感染時(shí)間的發(fā)展，腦組織病變和感染時(shí)間之間的關(guān)聯(lián)度以及組織生化指標(biāo)和腦組織病變之間的關(guān)聯(lián)度。結(jié)果顯示，試驗(yàn)組雛鴨大腦于攻毒后不同時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)不同程度的病理變化，腦組織中NO、MDA含量隨時(shí)間變化一致。試驗(yàn)得出：NO在雛鴨病毒性肝炎的發(fā)生、發(fā)展的過(guò)程中發(fā)揮了重要作用，可能是雛鴨出現(xiàn)神經(jīng)癥狀和腦組織病變的重要原因之一。

鴨肝炎；腦組織病變；一氧化氮；脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)；丙二醛

鴨病毒性肝炎是由I型鴨肝炎病毒引起的雛鴨的一種急性傳染病，該病發(fā)病急、傳播快、死亡率高[1]。1980年至今，鴨肝炎病毒在我國(guó)多次爆發(fā)，且發(fā)病嚴(yán)重，流行區(qū)域廣，給養(yǎng)鴨業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。本文針對(duì)人工感染雛鴨出現(xiàn)的明顯神經(jīng)癥狀，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)行病理組織學(xué)研究和分子生物學(xué)的研究，采用人工復(fù)制鴨肝炎病毒模型，動(dòng)態(tài)取材腦組織，普通組織固定和HE染色，腦組織中NO和MDA含量的測(cè)定等方法，分析臨床癥狀、組織學(xué)病變與組織NO、MDA含量之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器

752紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)（SP-752PC上海精密科學(xué)儀器有限公司）；NO試劑盒、MDA試劑盒（購(gòu)自南京建成生物科技有限公司）；離心機(jī)、切片機(jī)（上?；C(jī)械）。

1.2 毒株

接種材料I型鴨肝炎病毒（DHV-1）由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)病理實(shí)驗(yàn)室保存。毒株復(fù)壯過(guò)程為：接種敏感、抗體陰性的健康櫻桃谷鴨5只，每只腿部肌肉注射0.2mL，收集死亡鴨的肝臟進(jìn)行勻漿，5倍生理鹽水稀釋?zhuān)与p抗（青霉素、鏈霉素），過(guò)濾后-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

50羽1日齡鴨肝炎抗體陰性的健康櫻桃谷鴨，購(gòu)自武漢市天綠農(nóng)業(yè)科技有限公司，常規(guī)飼養(yǎng)正大牌肉鴨料，自由飲水采食。4日齡后隨機(jī)分為2組，每組25羽，一組為對(duì)照組，另外一組為試驗(yàn)組。在試驗(yàn)過(guò)程中死亡的鴨子，及時(shí)取其腦組織，進(jìn)行HE染色。

1.4 方法

1.4.1 人工感染模式的復(fù)制及取材。試驗(yàn)組雛鴨進(jìn)行腿部肌肉注射DHV-I病毒懸液0.2mL/羽，對(duì)照組25只，相同部位注射等量生理鹽水。于隔離器內(nèi)飼養(yǎng)。觀察其臨床癥狀，并與感染后0、3、6、12、24、48h按照3羽每組進(jìn)行靜脈放血處死，剖檢觀察病變，采集腦組織，1份甲醛固定用于制作石蠟切片、常規(guī)的HE染色；另一份研磨制成10%腦勻漿，用于NO和MDA濃度等的測(cè)定。

1.4.2 腦勻漿的制備。濾紙吸干腦組織表面的血液，準(zhǔn)確稱(chēng)取1g腦組織塊，用冷生理鹽水沖洗，加入10mL冰凍磷酸鹽緩沖液（pH7.2），制成100g/L組織勻漿，3000r/min離心15min，取上清液，-20℃保存待用。

1.4.3 測(cè)定方法。MDA含量測(cè)定采用硫代巴比妥酸法；NO利用硝酸還原酶特異性將硝酸根還原為亞硝酸根，通過(guò)顯色深淺測(cè)定其濃度。

1.4.4 數(shù)據(jù)處理。數(shù)據(jù)結(jié)果均以平均數(shù)表示，用t檢驗(yàn)法分析對(duì)照組和試驗(yàn)組間的差異顯著性。

1.4.5 嚴(yán)格按有關(guān)程序?qū)M織塊脫水及HE染色。

2 結(jié)果及分析

2.1 臨床變化

臨床觀察發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組鴨沒(méi)有發(fā)生特征性表現(xiàn)，在攻毒24h后，試驗(yàn)組雛鴨表現(xiàn)呆滯，離群獨(dú)立，行動(dòng)遲緩，精神沉郁，垂翅縮頸，部分鴨出現(xiàn)抽搐和運(yùn)動(dòng)失調(diào)等癥狀[2]；48h時(shí)部分雛鴨死亡，并與攻毒后72h全部死亡，死鴨呈典型角弓反張狀態(tài)。剖檢發(fā)現(xiàn)，肝臟腫大、質(zhì)脆、色暗或發(fā)黃，表面有大小不等的斑點(diǎn)狀出血[3]；雛鴨的大腦、腎臟、脾以及胰腺的表面有點(diǎn)狀或塊狀出血，腸粘膜也腫脹、充血。

2.2 組織病理學(xué)變化

大腦于攻毒后3h出現(xiàn)輕度水腫（圖1），3h到12h個(gè)別出現(xiàn)神經(jīng)元死亡和血管淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)（圖2、圖4）。24h神經(jīng)細(xì)胞和血管周?chē)霈F(xiàn)明顯的水腫，血管充血并見(jiàn)輕度出血（圖3），48h后及死亡鴨只的腦組織[4]，膠質(zhì)細(xì)胞呈局灶型增生，神經(jīng)元形成壞死結(jié)節(jié)（圖5），血管周?chē)馨图?xì)胞浸潤(rùn)（圖6），出現(xiàn)典型的神經(jīng)元壞死病灶（圖7）。

對(duì)照組神經(jīng)組織如大腦、小腦等基本正常，偶爾見(jiàn)有輕度充血和水腫。

圖1 感染3h后，感染雛鴨大腦，血管水腫

圖2 感染3h后，感染雛鴨大腦，神經(jīng)元壞死

圖3 感染24h后，感染雛鴨大腦，腦膜下充血

圖4 感染12h，感染雛鴨大腦，神經(jīng)元壞死

圖5 死亡雛鴨腦組織，神經(jīng)元壞死后的小膠質(zhì)細(xì)胞結(jié)節(jié)

2.3 NO、MDA測(cè)定結(jié)果

圖6 死亡雛鴨腦組織，血管周?chē)馨图?xì)胞浸潤(rùn)

圖7 感染80h后，雛鴨腦組織，典型的壞死灶

表1 腦組織中NO、MDA含量的測(cè)定結(jié)果（n=3）

試驗(yàn)組雛鴨腦組織中NO含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。腦組織中NO含量在接種后12h開(kāi)始逐步升高，48h到達(dá)測(cè)定最大值，隨后雛鴨開(kāi)始死亡。腦組織中MDA含量從12h開(kāi)始逐步增高，到48h達(dá)到測(cè)定最大值，和腦組織中NO含量變化一致。對(duì)照組腦組織中NO和MDA含量均變化不顯著。這兩項(xiàng)數(shù)據(jù)的一致性可以一定程度反映出，隨著NO含量的增加，腦組織過(guò)氧化反應(yīng)也在加劇，腦組織損傷不斷推進(jìn)。

2.4 小結(jié)

試驗(yàn)組雛鴨臨床癥狀和剖檢病變和組織學(xué)病

理變化相一致，可一定程度反映腦組織病變和雛鴨神經(jīng)癥狀之間的關(guān)聯(lián)程度。經(jīng)過(guò)腦組織中NO和MAD的測(cè)定顯示，NO含量隨時(shí)間的變化規(guī)律和MDA隨時(shí)間的變化相一致，可以反映出NO在腦組織病變中發(fā)揮了一定作用?？v向來(lái)看，NO在雛鴨病毒性肝炎的發(fā)生、發(fā)展的過(guò)程中發(fā)揮了一定作用；NO可能是雛鴨出現(xiàn)神經(jīng)癥狀和腦組織病變的原因之一。

3 討論

自由基是機(jī)體正常生化過(guò)程的產(chǎn)物，參與生物體許多病理、生理過(guò)程[4]。正常情況下，自由基的產(chǎn)生與清除保持著動(dòng)態(tài)平衡。任何增強(qiáng)氧化作用和（或）降低抗氧化能力的因素均可打破這一平衡，致氧自由基增加。試驗(yàn)結(jié)果表明，氧自由基可以介導(dǎo)腦組織的損傷，導(dǎo)致疾病的發(fā)生、發(fā)展。生物體內(nèi)的自由基，與過(guò)氧化氫反應(yīng)所產(chǎn)生的羥自由基可引發(fā)脂類(lèi)過(guò)氧化，導(dǎo)致細(xì)胞損傷，使細(xì)胞膜破壞，通透性增加，蛋白質(zhì)及DNA變形[4]。

胡薛英等研究表明結(jié)果表明，鴨肝炎病毒對(duì)雛鴨神經(jīng)組織的損傷，早期以水腫為主，后期以變形、壞死增生為主，與本試驗(yàn)結(jié)果相同。

PUFA在ROS的作用下，可在不飽和雙鍵上不斷發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng)，MDA為脂質(zhì)過(guò)氧化的最終產(chǎn)物之一，它可反應(yīng)脂質(zhì)過(guò)氧化的程度，間接反映自由基變化程度。本試驗(yàn)結(jié)果表明，腦組織中MDA含量隨著時(shí)間的發(fā)展不斷增加，且在48h時(shí)含量最高，腦組織中的MDA含量增加規(guī)律同鴨的臨床癥狀和組織學(xué)病變的發(fā)展規(guī)律一致，一定程度上反映了組織損傷的發(fā)展規(guī)律，同時(shí)也驗(yàn)證了腦組織的損傷一定程度上是由自由基反應(yīng)引起的。

NO是常見(jiàn)的炎癥介質(zhì)。研究表明，NO參與了各種原因引起的組織損傷，既有保護(hù)性作用，又有細(xì)胞毒性作用。NO生成過(guò)多，將通過(guò)機(jī)體內(nèi)蛋白質(zhì)、脂肪、核酸等生物分子的作用，損傷組織細(xì)胞，對(duì)機(jī)體產(chǎn)生毒性作用。本試驗(yàn)結(jié)果試驗(yàn)組腦組織中NO含量隨著時(shí)間的增加而不斷增加，表明NO在疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中扮演了很重要的角色，在腦組織損傷方面發(fā)揮了一定的作用。NO做為一種重要的自由基，在腦組織生理、病理方面都扮演了很重要的角色；MDA作為自由基脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的一種重要產(chǎn)物，其測(cè)定從反應(yīng)細(xì)胞膜損傷方面具有一定意義[5]。但是NO和MDA之間具體的量化關(guān)系尚不明確，NO引起腦組織細(xì)胞其他方面的病變（比如增生、核酸、蛋白質(zhì)損傷）尚不明確，需要我們進(jìn)一步研究。

[1]王丙云，黃興國(guó)，陳志勝，等．雛鴨感染鴨病毒性肝炎后神經(jīng)系統(tǒng)的動(dòng)態(tài)病理學(xué)觀察[J]．中國(guó)獸醫(yī)雜志，2003（1）：14-15.

[2]趙海全，王丙云，馮軍，等．鴨肝炎病毒對(duì)雛鴨肝組織中MDA和GSH-PX的影響[J]．中國(guó)家禽，2003（11）：11-12.

[3]蔣學(xué)軍，夏邦才，林松女．雛鴨病毒性肝炎綜合防治[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2007（5）：1.

[4]鄭艷華，胡薛英，程國(guó)富，等．感染新型鴨肝炎病毒雛鴨的SOD活性和MDA含量變化[J]. 中國(guó)獸醫(yī)科技，2004（12），6-9．

[5]叢濤，趙霖，鮑善芬．臨床營(yíng)養(yǎng)學(xué)研究中脂質(zhì)過(guò)氧化的評(píng)價(jià)方法[J]．中國(guó)臨床營(yíng)養(yǎng)雜志，2004（2）：127-131.

A Study on the Damages Caused by Duck Hepatitis Virus（DHV）in the Duckling Brain Tissues

Liu Chengjun1，Xia Xinmeng2，Wang Haili3
（1.Liaocheng Animal Hospital，Liaocheng，Shandong 252000；2. Liaocheng Animal Husbandry and Veterinary Bureau，Liaocheng，Shandong，252000；3.Liaocheng Vocational＆Technical College，Liaocheng，Shandong 252000）

In order to study the pathological changes in brain tissues caused by DHV with time，the pathology model was established by means of artificial infection of ducklings with DHV. Conventional pathology techniques and the tissue free radical determination were used to detect the DHV infection development，the association of brain lesions with infection time and the association of biochemical index with pathological lesions. Results showed that the test duckling group developed pathological changes in the brain in different degrees at different times，NO and MDA in the brain tissue changed consistently with time. It was concluded that NO played an important role in the incidence of viral hepatitis ducklings and the process of development，which may be one of the important reasons of neurological symptoms and brain lesions in ducklings.

DVH； brain tissue；NO；lipid peroxidation；malondialdehyde.

S852.657；S858.32

B

1005-944X（2015）06-0060-04