劉軍海， 李志洲， 王俊宏， 鄭 楠

（陜西理工學(xué)院化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，陜西漢中 723000）

天然植物黃酮具有抗腫瘤、抗氧化、抗菌等生理作用，能夠維持腸道菌落平衡，提高機(jī)體免疫力，促進(jìn)動物生長，降低料肉比。除此之外，還具有類雌激素作用，可提高動物繁殖能力，而且安全無毒（占今舜等，2014；陳佩佩等，2012）。 研究發(fā)現(xiàn)，桂花殘渣中含有豐富的黃酮類化合物，如果將這一資源利用起來作為飼料添加劑的來源，不僅降低了飼料成本，也提高了桂花的綜合利用價值（朱沛沛等，2012；王麗梅等，2012）。本試驗(yàn)研究了微波預(yù)處理對酶解法提取桂花殘渣總黃酮的影響，通過正交試驗(yàn)優(yōu)化了提取工藝條件，并對其抗氧化活性進(jìn)行研究，旨在為桂花殘渣總黃酮在飼料工業(yè)中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及儀器 桂花殘渣，粉碎后恒溫干燥備用；蘆?。ㄖ袊幤飞镏破窓z驗(yàn)所，純度≥98%）；纖維素酶（15000 U/g，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；乙醇、NaNO2、Al（NO）3、醋酸鈉、冰醋酸、硫酸亞鐵、雙氧水、水楊酸、抗壞血酸、2，2-二苯代苦味?；诫禄―PPH）等均為分析純。

GR-200電子天平 （日本 AND）、pHS-3TC（0.01級）精密酸度計（上海天達(dá)儀器有限公司）、WF-2000微波快速反應(yīng)系統(tǒng)（上海屹堯分析儀器有限公司）、DHG-9075A型電熱鼓風(fēng)箱（上海一恒科技有限公司）、Cary50型紫外可見分光光度計（美國瓦里安）、80-1型離心機(jī) （江蘇金壇正基儀器有限公司）、FW117中草藥粉碎機(jī)（天津泰斯特儀器有限公司）、SHZ-D9（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵（鞏義市予華儀器有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 采用NaNO2-Al（NO3）3比色法測定總黃酮含量（王桃云等，2009）。精密稱取0.010 g在60℃烘干至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，置100 mL的容量瓶中，用體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇定容，配制濃度為0.2 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液，精密量取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液 0、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10 mL，分別移入7個25 mL的容量瓶中，先加入0.3 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的NaNO2，搖勻，靜置6 min，再加入 0.3 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 10%的 Al（NO3）3，靜置6 min，待溶液充分絡(luò)合，顏色不再變化后加入4 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的NaOH，最后用體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇定容至刻度線，在510 nm處測定吸光度，分別以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液及測定的吸光度為橫縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為：

A=15.05C+0.0114，R2=0.9984；

式中：A為吸光度值；C為蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，mg/mL。

1.2.2 桂花殘渣總黃酮的提取 稱取備用的桂花殘渣粉末1.000 g，倒入50 mL錐形瓶中，加入60%體積分?jǐn)?shù)的乙醇，移入微波反應(yīng)系統(tǒng)，根據(jù)設(shè)定的參數(shù)進(jìn)行微波預(yù)處理后再加入緩沖液調(diào)節(jié)pH，在恒溫水浴槽中進(jìn)行酶解。酶解完成后得到的提取液經(jīng)過抽濾、離心，取上清液作為提取液的最終測定樣本測定桂花殘渣總黃酮吸光度，計算提取率。

將測定的桂花殘渣總黃酮的吸光度回代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程中求出對應(yīng)的濃度C，按下式計算提取率。

桂花殘渣總黃酮提取率/（mg/g）=VCX/W；

式中：V為測定液的體積；C為桂花殘渣總黃酮測定樣品液濃度；X為桂花殘渣總黃酮提取液稀釋總倍數(shù)；W為每次提取加入的桂花殘渣質(zhì)量，g。

1.3 桂花殘渣總黃酮的抗氧化活性試驗(yàn)

1.3.1 清除羥自由基活性研究 參照陳佳等（2011）和孟娜（2014）的方法，將微波預(yù)處理酶法最佳工藝條件下提取的桂花殘渣總黃酮提取液配制成不同質(zhì)量濃度梯度的溶液8份，相同質(zhì)量濃度的抗壞血酸作為對比，每個質(zhì)量濃度的提取液均取2.00 mL移入25 mL的容量瓶中，依次加入6.0 mmol/L的硫酸亞鐵 2.0 mL，1.0 mmol/L的雙氧水2.0 mL混合均勻，靜置10 min后再加入6.0 mmol/L的水楊酸2.0 mL，反應(yīng)30 min于510 nm處測定吸光度，記為A0；用雙氧水代替水楊酸測得的吸光度記為A1；以蒸餾水代替提取液所測得的吸光度記為A2。每次試驗(yàn)重復(fù)三次，以其平均值作為最終的試驗(yàn)值，按下式計算清除率：

羥自由基清除率/%=[1-（A0-A1）/A2]×100。

1.3.2 清除DPPH自由基活性研究 參照孟娜等（2014）和丁振柱（2011）的方法，將微波預(yù)處理酶法最佳工藝條件下提取的桂花殘渣總黃酮提取液配制成不同質(zhì)量濃度梯度的溶液8份，每個質(zhì)量濃度的溶液均取2.0 mL移入10 mL的具塞試管中，再加入2.0 mL濃度為0.06 mg/mL的DPPH自由基溶液（用60%體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶解0.06 mg的DPPH自由基，轉(zhuǎn)移到100 mL棕色的容量瓶中定容），混合均勻后反應(yīng)30 min，于4000 r/min離心10 min，取上清液在波長517 nm處測定吸光度，記為A0；另移取2.0 mL不同質(zhì)量濃度的總黃酮溶液于10 mL的具塞試管中，分別加入無水乙醇2.0 mL，在波長517 nm處測定其吸光度，記為A1；以2.0 mL 0.03 mg/mL的DPPH自由基溶液和2.0 mL無水乙醇反應(yīng)作為參比測定吸光度，記為A2；以抗壞血酸作為對照。每個試驗(yàn)平行測定三次，取平均值作為最終試驗(yàn)數(shù)據(jù)。按下式計算清除率：

DPPH 自由基清除率/%=[1-（A0-A1）/A2]×100。

1.4 正交試驗(yàn)因素與水平 基于單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取試驗(yàn)所涉及的5個單因素作為影響因子，桂花殘渣總黃酮提取率為響應(yīng)值，設(shè)計正交試驗(yàn)進(jìn)一步考察酶法提取桂花殘渣總黃酮中酶解時間、纖維素酶用量、料液比、pH及酶解溫度對桂花殘渣總黃酮提取率的影響，并優(yōu)化篩選出最佳提取工藝參數(shù)，正交試驗(yàn)設(shè)計因素與水平見表1。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計因素與水平

2 試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 微波預(yù)處理對酶法提取桂花殘渣總黃酮的影響 稱取1 g桂花殘渣粉末放入50 mL的錐形瓶中，加入25 mL體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇，轉(zhuǎn)入微波反應(yīng)系統(tǒng)中預(yù)處理1 min，微波溫度50℃，微波功率300 W。預(yù)處理后移出，加入纖維素酶8 mg，調(diào)節(jié)pH=6，在50℃條件下酶解。桂花殘渣總黃酮提取率在微波預(yù)處理和未經(jīng)微波預(yù)處理情況下隨酶解時間延長的變化結(jié)果如圖1所示。

圖1 微波預(yù)處理對桂花殘渣總黃酮提取效果的影響

由圖1可以看出，與未經(jīng)微波預(yù)處理組相比，微波預(yù)處理組不僅提取率高而且縮短了提取時間。微波預(yù)處理組酶解40 min的提取率和未經(jīng)預(yù)處理組酶解90 min的提取效果基本相當(dāng)，微波預(yù)處理組酶解60 min時提取率最高達(dá)到25.19 mg/g，而未經(jīng)微波預(yù)處理酶解60 min提取率僅為17.33 mg/g。微波輻射能加快分子熱運(yùn)動，細(xì)胞內(nèi)的壓強(qiáng)不斷增大最終破壞細(xì)胞壁，再經(jīng)過充分酶解，桂花殘渣中的總黃酮更易溶出而被提取出來。微波預(yù)處理對酶解過程具有一定的協(xié)同及促進(jìn)作用。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果及分析

2.2.1 纖維素酶用量對桂花殘渣總黃酮提取率的影響 稱取1 g桂花殘渣粉末放入50 mL的錐形瓶中，加入25 mL的體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇，添加不同量的纖維素酶，用緩沖液調(diào)節(jié)pH=6，在50℃條件下酶解60 min，考察纖維素酶用量對桂花殘渣總黃酮提取量的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 纖維素酶用量對桂花殘渣總黃酮提取率的影響

纖維素酶能破壞桂花殘渣的細(xì)胞壁，有助于總黃酮的溶出。由圖2可知，纖維素酶用量在10 mg時桂花殘渣中總黃酮的提取率最大，這主要是因?yàn)槔w維素酶添加量較少，桂花殘渣的細(xì)胞壁破壞不完全，黃酮不能全部釋放出來；纖維素酶添加量較多進(jìn)一步促進(jìn)了破壁效果，各種醇溶性雜質(zhì)競相溶出，但同時也容易和桂花殘渣中的多糖類物質(zhì)黏附，堵塞總黃酮的部分溶出通道，因此提取率減小，故10 mg纖維素酶的效果最好。

2.2.2 料液比對桂花殘渣總黃酮提取率的影響 稱取1 g桂花殘渣粉末放入50 mL錐形瓶中，配制成不同的料液比，添加8 mg纖維素酶，用緩沖液調(diào)節(jié)pH=6，在50℃條件下酶解60 min，考察料液比對桂花殘渣總黃酮含量的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 料液比對桂花殘渣總黃酮提取率的影響

由圖3可知，并不是料液比越大提取率越高。料液比在1∶35 g/mL時桂花殘渣總黃酮的提取率最大，料液比小，一方面?zhèn)髻|(zhì)速率小，另一方面酶在提取劑中分散空間有限容易黏結(jié)，活性受到影響，因此提取效果不好；料液比增大溶劑消耗量大且提取率增幅不明顯，對于優(yōu)化工藝來說沒有太大意義，1∶25～1∶35 g/mL 桂花殘渣的提取率比較接近，綜合考慮提取成本及提取率，選擇1∶25g/mL為最佳料液比。

2.2.3 pH對桂花殘渣總黃酮提取率的影響 稱取1 g桂花殘渣粉末放入50 mL的錐形瓶中，加入25 mL體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇，添加8 mg纖維素酶，用緩沖液調(diào)節(jié)為不同的pH，在50℃條件下酶解60 min，考察pH對桂花殘渣總黃酮含量的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4 pH對桂花殘渣總黃酮提取率的影響

纖維素酶的活性高對應(yīng)的桂花殘渣總黃酮提取率就高，pH是影響纖維素酶活性的重要因素。由圖4可知，弱酸環(huán)境對纖維素酶活性的影響非常明顯，桂花殘渣總黃酮在pH=6時提取率最高，偏堿性的環(huán)境中纖維素酶容易失活，總黃酮的提取效果不好，因此，提取時選擇pH=6較好。

2.2.4 酶解溫度對桂花殘渣總黃酮提取率的影響稱取1 g桂花殘渣粉末放入50 mL的錐形瓶中，加入25 mL的體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇，添加8 mg纖維素酶，用緩沖液調(diào)節(jié)pH=6，在不同溫度條件下酶解60 min，考察酶解溫度對桂花殘渣總黃酮含量的影響，結(jié)果如圖5所示。

圖5 酶解溫度對桂花殘渣總黃酮提取率的影響

溫度是酶解過程中一個重要的影響因素，酶在適宜的溫度下才會有效地進(jìn)行酶解反應(yīng)。由圖5可知，桂花殘渣總黃酮提取率隨酶解溫度的升高先增大后減小，60℃時提取率最高。低溫不足以激發(fā)纖維素酶的活性，高溫又容易使纖維素酶失活而且能耗高，因此選擇60℃作為較佳的酶解溫度。

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果及分析 以酶解時間、纖維素酶用量、料液比、pH、酶解溫度為正交試驗(yàn)的5個影響因子，桂花殘渣總黃酮提取率為指標(biāo)，通過L16（45）正交試驗(yàn)優(yōu)化酶法提取桂花殘渣總黃酮的提取工藝。 結(jié)果如表1所示。

表1 正交試驗(yàn)結(jié)果

由表1可知，pH對酶法提取桂花殘渣總黃酮影響最大，其余依次為酶解溫度、酶解時間、纖維素酶用量及料液比。pH和酶解溫度影響纖維素酶的活性，直接決定桂花殘渣總黃酮的提取，因此在試驗(yàn)過程中要嚴(yán)格控制，合理調(diào)節(jié)。正交試驗(yàn)優(yōu)化的最佳工藝參數(shù)為：酶解70 min，纖維素酶用量8 mg，料液比 1∶30 g/mL，pH=6，酶解溫度 60 ℃。由于正交試驗(yàn)中無此組合，因此要對其進(jìn)行驗(yàn)證。在優(yōu)化的試驗(yàn)條件下進(jìn)行三次平行試驗(yàn)，所得提取率分別為 26.416、26.183、26.274 mg/g， 效果優(yōu)于其他組合的提取率，故取其平均值26.291 mg/g為正交優(yōu)化條件下的最終提取率。

2.4 桂花殘渣總黃酮提取液性質(zhì)研究

2.4.1 抗氧化活性研究

2.4.1.1 清除羥自由基活性 由圖6可知，總黃酮和抗壞血酸對羥自由基的清除效果均與質(zhì)量濃度呈正比關(guān)系，總體來看，桂花殘渣總黃酮提取液清除羥自由基能力不及抗壞血酸，高濃度時的桂花殘渣總黃酮提取液對羥自由基的清除能力接近抗壞血酸，具有較好的抗氧化活性。桂花殘渣總黃酮提取液質(zhì)量濃度為0.06 mg/mL時清除羥自由基能力大于抗壞血酸，低濃度的桂花殘渣總黃酮提取液清除羥自由基能力與抗壞血酸相比沒有優(yōu)勢。

圖6 羥自由基清除試驗(yàn)結(jié)果

2.4.1.2 清除DPPH自由基活性 由圖7可知，濃度在0.04～0.06 mg/mL，桂花殘渣總黃酮提取液清除DPPH自由基能力強(qiáng)于抗壞血酸。低濃度范圍內(nèi)，隨著總黃酮提取液質(zhì)量濃度的增大，DPPH自由基的清除率增長較快，濃度大于0.14 mg/mL之后清除率基本不變，而大于此濃度的抗壞血酸的清除率依然繼續(xù)增大，最大清除率達(dá)到91.016%，桂花殘渣總黃酮提取液對DPPH的最大清除率為77.472%。雖然桂花殘渣總黃酮提取液清除DPPH自由基能力整體沒有抗壞血酸好，但還是具有一定的清除DPPH自由基能力。

3 結(jié)論

圖7 DPPH自由基清除試驗(yàn)結(jié)果

3.1 微波預(yù)處理能縮短酶法提取桂花殘渣總黃酮的提取時間，同時提取率也得到大幅度的提升。正交試驗(yàn)優(yōu)化的最佳工藝參數(shù)為：酶解時間70 min，纖維素酶用量 8 mg，料液比 1∶30 g/mL，pH=6，酶解溫度60℃，此條件下的提取率為26.291 mg/g。

3.2 桂花殘渣總黃酮提取液對DPPH自由基和羥自由基均有很強(qiáng)的清除能力，作為飼料抗氧化劑能減少因自由基引發(fā)疾病的發(fā)病率，提高禽畜機(jī)體免疫力.

注：因版面所限參考文獻(xiàn)省略，如有需要，可來函索取。電子郵箱：iamliujunhai@126.com