葉光斌 王彩虹 王 毅 甄 攀 王 勇 羅惠波

（1.四川理工學(xué)院生物工程學(xué)院，四川 自貢 643000；2.釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 自貢 643000；3.五糧液集團(tuán)質(zhì)量檢測中心，四川 宜賓 644000；4.山西杏花村汾酒廠股份有限公司，山西 汾陽 032200）

清香型大曲是中國大曲清香型白酒的生產(chǎn)用曲，主要包括清茬曲、紅心曲和后火曲3種大曲。這3種大曲在生產(chǎn)上使用的原材料相同，生產(chǎn)流程也基本相似，可簡單概括為：臥曲→上霉期→晾霉期→潮火期→干火期→后火期→養(yǎng)曲→出房驗(yàn)收→貯曲。所不同的是在培曲過程中，各曲種對培曲溫度的要求各不相同（見表1）。不同的制曲溫度及生產(chǎn)工藝，使得不同大曲內(nèi)的微生物生長和發(fā)酵特征各具特色，其產(chǎn)生的不同代謝產(chǎn)物對白酒風(fēng)味形成也有所差異［1］。清香型白酒生產(chǎn)中將清茬曲、紅心曲和后火曲按照4∶3∶3的比例混合后使用［2］。采用不同工藝生產(chǎn)的3種大曲共同發(fā)酵，相輔相成，便形成了清香型白酒（大曲清香）獨(dú)特的風(fēng)格。因此，認(rèn)識清香型大曲內(nèi)不同曲種間微生物群落結(jié)構(gòu)與差異，對于研究清香型白酒發(fā)酵具有十分重要的意義。

原核細(xì)胞核糖體小亞基16SrRNA基因，長約1.5kb左右，大小適中，既含有高度保守的基因片段又具有種間變異的核酸片段，非常適合于進(jìn)行序列測定和菌屬間的分析比較，是理想的基因鑒定靶序列［3］。張守印等［4］對16SrDNA克隆文庫用于細(xì)菌群落分析的可靠性進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，16SrRNA基因序列分析可以反映菌群中各種細(xì)菌的豐度，是一種較好的分析細(xì)菌菌群的方法。目前，16SrRNA基因克隆文庫技術(shù)也已被廣泛應(yīng)用于發(fā)酵食品［5，6］、城市污水［7］、土壤［8］等各類復(fù)雜環(huán)境中細(xì)菌微生態(tài)的研究。

本研究擬以汾酒清香型大曲—清茬曲、后火曲、紅心曲為研究對象，通過提取大曲微生物總DNA、PCR擴(kuò)增及構(gòu)建細(xì)菌16SrRNA基因文庫，對其細(xì)菌群落組成進(jìn)行了比較研究，確定了3種大曲的優(yōu)勢菌群，為進(jìn)一步解析清香型大曲功能微生物、篩選優(yōu)良釀造微生物奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大曲樣品：采集自山西杏花村汾酒集團(tuán)有限責(zé)任公司，全部為成品曲（見表1）。每個大曲樣品取3個平行，按“四分法”［9］將不同類型大曲分別粉碎混合，用無菌封口袋分裝后，置于－80℃保藏備用。

引物：由上海英俊生物技術(shù)有限公司合成；

Taq酶、pMD19-T載體和EscherichiacoliDH5α感受態(tài)細(xì)胞、限制性內(nèi)切酶MspI和HhaI：大連寶生物有限公司；

PCR儀：BIO-RAD Thermal Cycle型，美國 BIO-RAD公司；

離心機(jī)：Eppendorf Centrifuge 5418型，美國Eppendorf公司。

表1 試驗(yàn)所用大曲樣品信息表Table 1 Information of Daqu samples of the experiment

表1 試驗(yàn)所用大曲樣品信息表Table 1 Information of Daqu samples of the experiment

來源山西杏花村。

名稱 類型（制曲最高品溫） 所產(chǎn)白酒香型汾酒清茬曲 中溫曲（45～46℃）清香型清香型汾酒后火曲 中溫曲（46～48℃） 清香型汾酒紅心曲 中溫曲（最高可達(dá)50℃）

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 總DNA的提取及PCR擴(kuò)增 DNA提取參照文獻(xiàn)［10］。引物 Eub27f（5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’）和 Eub1492r（5’-CGG TTA CCT TGT TAC GAC TT-3’）用于擴(kuò)增細(xì)菌16SrDNA［11，12］，為了防止 PCR 偏差，每個樣品做3個重復(fù)。具體的PCR擴(kuò)增體系及PCR擴(kuò)增程序同葉光斌等的方法［10，12］。

1.2.2 細(xì)菌16SrRNA基因克隆文庫的構(gòu)建 將純化后的PCR產(chǎn)物與pMD-19T載體16℃過夜連接，通過熱激法（42℃熱激90s）將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞E.coliDH5α（感受態(tài)細(xì)胞的效價(jià)約108個/μg）中。

1.2.3 陽性克隆子的篩選及RFLP分析 菌落PCR篩選陽性克隆 子。引 物 RV-M（5＇-GAG CGG ATA ACA ATT TCA CAC AGG-3＇）和 M13-47（5＇-CGC CAG GGT TTT CCC AGT CAC GAC-3＇）用于菌落PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系及PCR擴(kuò)增程序同葉光斌等的方法［10，12］，利用MspI和HhaI雙酶切陽性克隆子菌落PCR產(chǎn)物的酶切圖譜，確定不同譜型，統(tǒng)計(jì)每一譜型出現(xiàn)的頻率及數(shù)目，并將不同譜型的克隆子送到上海杰李生物技術(shù)有限公司進(jìn)行DNA測序。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 將16SrDNA序列相似性≥97%的序列定義為同一OTU（operational taxonomic units，運(yùn)算分類單位）［10，12］。根據(jù)測序結(jié)果和RFLP統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果，統(tǒng)計(jì)各文庫內(nèi)OTU數(shù)目及每個OTU在個克隆文庫的分布比例。將每個OTU的代表克隆子序列與NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，找出與克隆子序列同源性最高的序列，用于構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹和確定其分類地位。Seaview4軟件對齊序列，Mega 4軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。文庫的評估方法參考葉光斌等的方法［10，12］。共有32個克隆子的16SrRNA基因序列上傳至NCBI Gen-Bank數(shù)據(jù)庫，GenBank序列號為KF984353-KF984384。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌16SrRNA基因的PCR擴(kuò)增

不同大曲細(xì)菌16SrRNA基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖電泳圖譜見圖1。由圖1可知，3種大曲樣品的細(xì)菌16SrDNA PCR擴(kuò)增效果都很好，均得到了一條較亮的1 500bp左右的目的條帶。

圖1 細(xì)菌16SrRNA基因PCR產(chǎn)物的電泳圖譜Figure 1 The electrophoresis diagram of PCR products of bacterial 16SrRNA gene

2.2 陽性克隆子檢測及RFLP分析

部分菌落PCR產(chǎn)物電泳圖譜見圖2。菌落PCR產(chǎn)物為單條帶，且片段長度在1 600bp左右的均可視為陽性克隆子。清茬曲、后火曲和紅心曲細(xì)菌16SrRNA基因文庫內(nèi)分別有45，60和45個陽性克隆子用于后續(xù)的RFLP分析。將各文庫的陽性克隆子菌落PCR產(chǎn)物通過MspI和HhaI雙酶切后，進(jìn)行RFLP分析，部分RFLP電泳圖譜見圖3。不同大曲樣品根據(jù)RFLP分析結(jié)果，挑選不同譜型的32個代表克隆子進(jìn)行測序，并與NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫比對（見表3）。

圖2 部分克隆子菌落PCR產(chǎn)物電泳圖譜Figure 2 The electrophoretogram of colony PCR products of partial colonies

圖3 部分陽性克隆子菌落PCR產(chǎn)物雙酶切產(chǎn)物電泳圖譜（MspI和HhaI雙酶切）Figure 3 The electrophoretogram of double enzyme digested products from PCR products of partial positive colonies（Digested with MspI and HhaI）

2.3 細(xì)菌16SrRNA基因文庫的評估

3種大曲細(xì)菌16SrRNA基因文庫的統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表2。從文庫覆蓋率上看，在64%～72%，均未達(dá)到飽和；Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)顯示3種清香型大曲內(nèi)細(xì)菌群落多樣性豐富；且從物種多樣性上看，后火曲＞清茬曲＞紅心曲。Buzas-Gibson均一度指數(shù)的分析結(jié)果表明，紅心曲＞后火曲＞清茬曲。盡管以上3個文庫均未達(dá)到飽和，但該文庫能在一定程度上反映各樣品內(nèi)的主要細(xì)菌類群的多樣性及豐度差異。

2.4 清香型大曲細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)

清茬曲、后火曲、紅心曲的細(xì)菌16SrRNA基因文庫內(nèi)代表克隆子在文庫中的分布及NCBI數(shù)據(jù)庫比對信息見表3。由表3可知：克隆子與對應(yīng)序列間的相似度均達(dá)到98%以上。代表克隆子參與構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖4。由圖4可知，所有清香型大曲內(nèi)細(xì)菌群落主要分布于芽孢桿菌綱、放線菌綱及變形菌綱。芽孢桿菌綱內(nèi)克隆子主要分布于乳桿菌目（Lactobacillales）和芽孢桿菌目（Bacillales）。其中乳桿菌目內(nèi)克隆子種類最多，共有11個OTUs，主要分布于乳桿菌屬（Lactobacillus）、魏斯氏菌屬（Weissella）、明串株菌屬（Leuconostoc）、乳球菌屬（Lactococcus）；芽孢桿菌目內(nèi)克隆子包含有5個OTUs，分別為芽孢桿菌屬（Bacillus）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）、高溫放線菌屬（Thermoactinomyces）。放線菌綱內(nèi)克隆子主要分布于放線菌目（Actinomycetales）內(nèi)的鏈霉菌屬（Streptomyces）、短桿菌屬（Brevibacterium）、考克氏菌屬（Kocuria）及Brachybacterium屬。變形桿菌綱內(nèi)克隆子主要分布于不動桿菌屬（Acinetobacter）和泛菌屬（Pantoea）。

表2 不同清香型大曲細(xì)菌16SrRNA基因文庫的統(tǒng)計(jì)分析Table 2 The statistical analysis of bacterial 16SrRNA gene libraries of different Fen-Daqus

表2 不同清香型大曲細(xì)菌16SrRNA基因文庫的統(tǒng)計(jì)分析Table 2 The statistical analysis of bacterial 16SrRNA gene libraries of different Fen-Daqus

通常Shannon-Wiener指數(shù)數(shù)值越大，表明文庫中克隆子多樣性越豐富；Simpson指數(shù)越接近1，表明文庫中克隆子多樣性越豐富；Buza-Gibson均一度指數(shù)越接近1，表明文庫中克隆子分布越均勻［10，12，13］。

文庫來源 克隆子數(shù)目 OUT數(shù)目 文庫覆蓋率/%Buzas-Gibson均一度指數(shù)清茬曲Shannon-Wiener指數(shù)Simpson指數(shù)45 13 71.11 2.39 0.89 0.84 45 16 64.44 2.51 0.90 0.78后火曲 60 19 68.33 2.71 0.92 0.79紅心曲

從克隆子分布表和系統(tǒng)發(fā)育樹可以看出：乳桿菌屬、葡萄球菌屬、芽孢桿菌屬、魏斯氏菌屬、明串株菌屬在3個大曲中同時(shí)存在；高溫放線菌屬只存在于制曲品溫較高的后火曲和紅心曲中；乳球菌屬和短桿菌屬只存在于清茬曲和后火曲中；泛菌屬只存在于清茬曲和紅心曲中；考克氏菌屬和短桿菌屬是清茬曲的特有菌群；鏈霉菌屬和不動桿菌屬是后火曲的特有菌群。其中，清茬曲的優(yōu)勢菌群為乳桿菌屬（占全部克隆子的比例為37.78%，7OTUs）和葡萄球菌屬（22.22%，1OTU）；后火曲的優(yōu)勢菌群為乳桿菌屬（占全部克隆子的 比 例 為 35%，8OTUs）、葡 萄 球 菌 屬 （16.67%，2 OTUs）、芽孢桿菌屬（16.67%，2OTUs）、魏斯氏菌屬（13.33%，1OTU）；紅心曲的優(yōu)勢菌群為乳桿菌屬（占全部克隆子的比例 為 26 .67%，6OTUs）、芽 孢 桿 菌 屬 （28.89%，2 OTUs）、高溫放線菌屬（17.78%，1OTU）?？傮w而言，清香型3種曲的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)存在一定的差異，后火曲分別與清茬曲和紅心曲比較相似，而清茬曲和紅心曲間群落相似性較低。

據(jù)周恒剛［14］、胡承等［15］報(bào)道，制曲品溫在30℃左右較適合微生物的生長，而隨著溫度的上升微生物的活菌數(shù)也呈倍下降，大多數(shù)不耐高溫的細(xì)菌逐漸死亡。汾酒3種大曲微生物群落的差異與大曲生產(chǎn)過程中溫度的控制密切相關(guān)。

紅心曲制曲溫度最高，因此耐高溫的芽孢桿菌和高溫放線菌與不耐高溫的細(xì)菌相比具有較大的競爭優(yōu)勢，在文庫中占了較高的比例，但細(xì)菌群落多樣性較其它兩種曲低；后火曲的制曲溫度較清茬曲的高，因此后火曲中芽孢桿菌所占的比例明顯高于清茬曲，后火曲中也有較低含量的高溫放線菌分布；而清茬曲制曲溫度最低，未檢測到高溫放線菌的存在。不同的制曲溫度使得微生物的生長和發(fā)酵特征也各具特色，其產(chǎn)生的不同代謝產(chǎn)物對白酒風(fēng)味形成也有所差異，汾酒采用不同工藝生產(chǎn)的3種大曲共同發(fā)酵，三者相輔相成，便形成了汾酒獨(dú)特的風(fēng)格。

表3 不同清香型大曲細(xì)菌16SrRNA基因文庫內(nèi)代表克隆子的分布及比對信息Table 3 Blast and distribute information of represental clones from 16SrRNA gene libraries of different Fen-Daqus

表3 不同清香型大曲細(xì)菌16SrRNA基因文庫內(nèi)代表克隆子的分布及比對信息Table 3 Blast and distribute information of represental clones from 16SrRNA gene libraries of different Fen-Daqus

“QCQX”、“HHQX”、“HXQX”分別代表清茬曲、后火曲、紅心曲細(xì)菌16SrDNA文庫克隆子。

代表克隆子編號清茬曲分布比例/%后火曲分布比例/%紅心曲分布比例/% 近似序列號 相似率/%分類信息QCQX-12 11.11 5.00 4.44 AB605665 99 Lactobacillus paralimentarius QCQX-88 8.90 6.67 6.67 HQ322272 99 Lactobacillus sp.HHQX-18 4.44 3.33 4.44 AB598972 99 Lactobacillus sp.QCQX-4 4.44 5.00 4.44 NR＿036788 99 Lactobacillus pontis QCQX-74 4.44 1.67 4.44 NR＿075038 99 Lactobacillus sanfranciscensis HHQX-81 2.22 3.33 0.00 EF120367 99 Lactobacillus brevis HHQX-9 2.22 3.33 2.22 EF536361 99 Lactobacillushelveticus HHQX-2 0.00 6.67 0.00 DQ399353 99 Lactobacillusparacasei QCQX-7 8.90 6.67 8.90 NR＿074694 99 Leuconostoc citreum HHQX-20 8.90 13.33 4.44 DQ321751 99 Weissella sp.QCQX-58 4.44 1.67 0.00 AB601163 99 Lactococcus lactis subsp.lactis HXQX-70 0.00 5.00 17.78 AJ251778 99 Thermoactinomyces sanguinis QCQX-33 22.22 13.33 0.00 NR＿024667 99 Staphylococcus sp.HHQX-16 0.00 3.33 4.44 EU855191 99 Staphylococcus sciuri HHQX-8 0.00 13.33 15.56 JQ291596 99 Bacillus licheniformis HXQX-92 2.22 3.33 13.33 JX680141 99 Bacillus sp.HHQX-14 0.00 1.67 0.00 NR＿041208 98 Streptomyces albus QCQX-27 6.67 1.67 0.00 AY243345 99 Brevibacterium linens QCQX-6 2.22 0.00 0.00 NR＿025502 99 Brachybacterium paraconglomeratum QCQX-65 4.44 0.00 0.00 FJ607312 99 Kocuria koreensis HHQX-32 0.00 1.67 0.00 NR＿074737 99 Acinetobacter baumannii HXQX-16 2.22 0.00 8.90 FJ756354 99 Pantoea sp.

潘勤春等［16］通過PCR—DGGE技術(shù)對汾酒大曲細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析，結(jié)果表明制曲品溫最低的清茬曲多樣性最豐富，制曲品溫最高的紅心曲群落組成最簡單，后火曲居中，且清茬曲和紅心曲間群落組成差異較大，測序結(jié)果表明，清香型大曲內(nèi)細(xì)菌主要為芽孢桿菌屬、腸桿菌屬、乳酸菌屬、不動桿菌屬、土壤球菌屬，且芽孢桿菌屬和腸桿菌屬為優(yōu)勢類群。高亦豹［17］運(yùn)用PCR—DGGE技術(shù)對不同工藝大曲（包括汾酒清茬曲、后火曲、紅心曲）的微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究，結(jié)果表明清香型大曲中乳酸菌多樣性較豐富，包括Lactobacillu.helveticus、L.panis、L.pontis、L.fermentum、Weissellacibaria；地衣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌為大曲中的優(yōu)勢菌；而Thermoactinomycessanguinis僅存在于醬香型大曲中。Zhang等［18］通過454測序技術(shù)研究汾酒3種清香型大曲內(nèi)細(xì)菌群落組成，結(jié)果表明3種大曲內(nèi)細(xì)菌種群主要分布于厚壁菌門和放線菌門，厚壁菌門是優(yōu)勢種群，分別占清茬曲、后火曲和紅心曲的72.2%，98.6%，81.4%；乳酸菌種類豐富，主要包括Weissellacibaria、Leuconostoccitreum、Lactobacillussakei、L.pontis、L.paralimentarius和L.mindensis；清茬曲內(nèi)優(yōu)勢科為鏈霉菌科和明串珠菌科；后火曲內(nèi)優(yōu)勢菌為芽孢桿菌；紅心曲內(nèi)優(yōu)勢菌為高溫放線菌科和鏈霉菌科。但未見γ－變形桿菌的報(bào)道。本試驗(yàn)對汾酒大曲的研究中也發(fā)現(xiàn)乳酸菌的多樣性非常豐富，芽孢桿菌是紅心曲和后火曲的優(yōu)勢菌群，這一結(jié)論與潘勤春［16］、高亦豹［17］、Zhang［18］等的結(jié)論較一致；不同的是在具體的屬種組成比例上存在差異，且本研究得到的細(xì)菌多樣性更豐富。此外本研究在清香型大曲的后火曲和紅心曲內(nèi)均檢測到了較高比例的高溫放線菌（Thermoactinomycessanguinis）。導(dǎo)致以上差異的原因可能是由于試驗(yàn)方法或試驗(yàn)樣品的不同導(dǎo)致的。

圖4 清香型大曲細(xì)菌克隆子16SrRNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹Figure 4 Phylogenetic tree of bacterial 16SrRNA gene of Fen-Daqus

3 結(jié)論

通過細(xì)菌16SrRNA基因文庫法和RFLP指紋技術(shù)系統(tǒng)研究了清香型大曲清茬曲、后火曲和紅心曲內(nèi)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異。研究結(jié)果表明：制曲溫度對于清香型3種大曲內(nèi)細(xì)菌多樣性具有顯著影響，制曲溫度較低的清茬曲和后火曲的細(xì)菌多樣性要明顯高于制曲溫度較高的紅心曲。3種大曲的細(xì)菌多樣性豐富，均分布于芽孢桿菌綱、放線菌綱及變形菌綱，但在具體種屬組成上存在明顯差異；其中清茬曲的優(yōu)勢細(xì)菌群為乳桿菌屬和葡萄球菌屬；后火曲的優(yōu)勢細(xì)菌群為乳桿菌屬、葡萄球菌屬、芽孢桿菌屬、魏斯氏菌屬；紅心曲的優(yōu)勢細(xì)菌群為乳桿菌屬、芽孢桿菌屬、高溫放線菌屬。

此外，本試驗(yàn)在進(jìn)行測序序列與NCBI數(shù)據(jù)庫比對過程中發(fā)現(xiàn)，部分克隆子的測序序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中多個同屬不同種菌株的序列相似度都達(dá)到98%以上，如代表克隆子HHQX-20，與魏斯氏菌屬的Weissellaconfusa、W.cibaria的相似度均為99%；HXQX-92與芽孢桿菌屬的Bacillus aerophilus、B.stratosphericus、B.pumilus相似度均達(dá)到98%以上；QCQX-88與乳桿菌屬的L.farciminis、L.futsaii、L.crustorum的相似度均達(dá)到98%以上。而在群落多樣性分析時(shí)，由于只將序列相似度≥97%計(jì)為同一種OTU類型，因此可能會低估了清香型大曲的細(xì)菌多樣性。后期的研究將結(jié)合高通量測序技術(shù)，以進(jìn)一步確定以上大曲內(nèi)的細(xì)菌群落組成信息，并有目的的針對清香型大曲的主要細(xì)菌類群進(jìn)行分離、純化和發(fā)酵機(jī)理的相關(guān)研究，以弄清其在清香型白酒固態(tài)發(fā)酵中的具體作用。

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17 高亦豹.PCR—DGGE研究中國白酒大曲中微生物群落結(jié)構(gòu)［D］.無錫：江南大學(xué)，2010.

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