張 婷 楊 波 羅瑞明 王萬(wàn)銀

（1.寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏 銀川 750021；2.寧夏大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，寧夏 銀川 750021；3.平羅縣農(nóng)副產(chǎn)品流通服務(wù)中心，寧夏 石嘴山 753400）

苦苦菜，屬菊科菊苣族，又名苦苣菜、苣荬菜等，在中藥中稱(chēng)之為敗醬草，是一種藥食兼具的無(wú)毒野生植物，屬一年生或兩年生草本植物。苦苦菜具有明目和胃、破瘀活血、消炎利尿、益氣養(yǎng)陽(yáng)、排膿去淤消腫的功效，對(duì)預(yù)防心臟病、恢復(fù)腦細(xì)胞功能和預(yù)防癌癥均具有一定療效。

對(duì)食品發(fā)酵后微生物菌群和風(fēng)味物質(zhì)變化的研究有助于實(shí)現(xiàn)該發(fā)酵食品的工業(yè)化生產(chǎn)，如對(duì)糟魚(yú)［1］、香腸［2］、冬瓜［3］等發(fā)酵后的研究，但尚未發(fā)現(xiàn)有對(duì)發(fā)酵苦苦菜及其發(fā)酵菌種和滋味物質(zhì)的研究。本試驗(yàn)著重研究苦苦菜自然發(fā)酵過(guò)程中，主要菌群和典型發(fā)酵菌株的變化，并對(duì)其發(fā)酵過(guò)程中的總酸、pH值和腌制液鹽濃度進(jìn)行了動(dòng)態(tài)檢測(cè)。此外，評(píng)價(jià)山野菜腌制后的風(fēng)味主要從質(zhì)地、顏色、香氣、滋味等方面。氨基酸是一種高含量呈味物質(zhì)，其含量與類(lèi)型是影響風(fēng)味很重要的因素［4］，不同的氨基酸呈現(xiàn)的味道不同［5］。本試驗(yàn)測(cè)定了苦苦菜發(fā)酵過(guò)程中游離氨基酸含量的變化，按其呈味分類(lèi)，檢測(cè)各類(lèi)呈味氨基酸含量隨發(fā)酵時(shí)間的變化，分析其變化規(guī)律，為苦苦菜的開(kāi)發(fā)利用和產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

苦苦菜、食鹽、辣椒、生姜、茴香、花椒等：市售；

MRS瓊脂培養(yǎng)基：在MRS液體培養(yǎng)基中加入1.5%～2.0%的瓊脂，121℃滅菌20min；

MRS分離培養(yǎng)基：在MRS培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入2～5g無(wú)水碳酸鈣，121℃滅菌20min，用于乳酸菌的分離與鑒定。

1.2 主要儀器與試劑

氨基酸自動(dòng)分析儀：L-8900型，上海仁特檢測(cè)儀器有限公司；

手動(dòng)控制壓力蒸汽滅菌器：GMSX-280，北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；

精密pH計(jì)：PHS-3C型，上海精密科學(xué)儀器有限公司；

生化培養(yǎng)箱：LRH系列，上海一恒科技有限公司；

恒溫干燥箱：101-3型，上海東星建材試驗(yàn)設(shè)備有限公司；

葡萄糖、牛肉膏、瓊脂粉、胰蛋白胨、酵母浸粉：生化試劑，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

乙醇：分析純，浙江雙林有限公司；

氫氧化鈉：分析純，天津化學(xué)試劑三廠(chǎng)；

硝酸銀：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 腌制工藝流程

食鹽放入量5%，菜放入量70%，香辛料（辣椒∶生姜∶茴香＝6∶3∶1）放入量4%（均為占菜水總重百分比），花椒水中花椒放入量為所用水3‰～4‰。

1.3.2 發(fā)酵過(guò)程指標(biāo)檢測(cè)

（1）菌落總數(shù)計(jì)數(shù)：采用平板培養(yǎng)計(jì)數(shù)法。

（2）酵母菌、霉菌菌落總數(shù)：采用平板培養(yǎng)計(jì)數(shù)法。

（3）乳酸菌總數(shù)：采用液體培養(yǎng)法和平板培養(yǎng)計(jì)數(shù)法。

（4）pH值的測(cè)定：采用pH計(jì)測(cè)定。

（5）總酸含量（以乳酸計(jì)）測(cè)定：采用直接滴定法，按GB/T 12456—90執(zhí)行。

（6）腌制液鹽濃度的測(cè)定：硝酸銀溶液滴定法［6］。

（7）感官評(píng)價(jià)：請(qǐng)10位有經(jīng)驗(yàn)的評(píng)定人員對(duì)苦苣菜腌制期間的色澤、外觀(guān)組織、香氣、質(zhì)地、滋味、口感等計(jì)分（滿(mǎn)分100分），取平均值。評(píng)比計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1。

1.3.3 游離氨基酸樣品前處理 參照文獻(xiàn)［5］。

1.3.4 乳酸菌的分離及純化 分別取0，3，7，14，21，28d的苦苦菜自然發(fā)酵菜汁，按10倍稀釋到合適梯度，涂布于用MRS分離培養(yǎng)基平板，在生化培養(yǎng)箱中于30℃培養(yǎng)48h，挑取長(zhǎng)勢(shì)好且有明顯較大鈣溶圈的菌落，在MRS瓊脂培養(yǎng)基平板上反復(fù)劃線(xiàn)分離至純菌落，然后進(jìn)行革蘭氏染色和接觸酶反應(yīng)，挑選出革蘭氏陽(yáng)性、接觸酶陰性的菌株［7］，轉(zhuǎn)移至MRS斜面培養(yǎng)基上，編號(hào)并于4℃保存，待鑒定用。

表1 感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Standard of sensory evaluation

1.3.5 乳酸菌菌體的鑒定 乳酸菌按常規(guī)接種方法培養(yǎng)，挑取典型菌落革蘭氏染色，油鏡下觀(guān)察。生理生化鑒定具體包括［8，9］：① 過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)；② 吲哚試驗(yàn)；③ 明膠液化試驗(yàn)；④ 硫化氫產(chǎn)生試驗(yàn)；⑤ 糖發(fā)酵產(chǎn)酸試驗(yàn)；⑥ 運(yùn)動(dòng)性檢查。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用軟件SPSS 19.0和Excel 2007。

2 結(jié)果與分析

2.1 微生物學(xué)指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

2.1.1 主要微生物菌落總數(shù)的變化 由圖1可知，苦苦菜發(fā)酵液中細(xì)菌總數(shù)隨發(fā)酵天數(shù)的增加呈現(xiàn)出先上升后下降再緩慢上升的趨勢(shì)，第3天左右達(dá)到最大值后迅速下降，到第20天左右數(shù)量又開(kāi)始上升。發(fā)酵液中乳酸菌總數(shù)在0～3 d就出現(xiàn)了增長(zhǎng)的高峰，隨之增長(zhǎng)平緩，6～14d乳酸菌總數(shù)維持在最大值范圍，之后隨著發(fā)酵的進(jìn)行緩慢降低，整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中乳酸菌生長(zhǎng)情況較好，菌落總數(shù)基本維持在107CFU/mL以上。酵母菌數(shù)量在發(fā)酵剛開(kāi)始時(shí)較少，隨著腌制的進(jìn)行在發(fā)酵初期較大量繁殖后又減少，發(fā)酵14d左右總數(shù)趨于穩(wěn)定。

圖1 細(xì)菌、乳酸菌和酵母菌總數(shù)隨發(fā)酵時(shí)間的變化Figure 1 The total number of bacteria，lactic acid bacteria and yeast changes along with the fermentation time

2.1.2 霉菌的檢測(cè) 圖2為苦苦菜腌制前進(jìn)行燙漂和不燙漂處理，腌制后感官品質(zhì)的對(duì)比，以及不燙漂的情況下霉菌生長(zhǎng)情況。由圖2可知，隨著發(fā)酵天數(shù)的增加，苦苦菜燙漂和不燙漂處理后的感官品質(zhì)雖均有所下降，但整體上燙漂后苦苦菜的色澤、香氣、滋味等品質(zhì)要高于不燙漂處理，并且下降趨勢(shì)平緩，發(fā)酵第30天感官品質(zhì)仍保持在80分左右，這主要是因?yàn)闋C漂溫度達(dá)到95℃時(shí)，會(huì)導(dǎo)致苦苦菜中的葉綠素酶失活，時(shí)間適當(dāng)延長(zhǎng)，苦苦菜的變色程度越輕，但考慮到菜要腌制，對(duì)苦苦菜進(jìn)行10s左右的燙漂處理，這樣的處理不僅可以獲得很好的護(hù)色效果，還能祛除苦澀味［10］，提高腌菜品質(zhì)。此外，苦苦菜在腌制時(shí)極易出現(xiàn)霉變問(wèn)題，腌制前將菜燙漂還能有效地減少苦苦菜自然發(fā)酵前的雜菌，燙漂處理過(guò)的苦苦菜中未檢測(cè)出霉菌的出現(xiàn)，未燙漂苦苦菜中霉菌總數(shù)檢測(cè)見(jiàn)圖2，并伴有不良?xì)馕丁?/p>

2.2 乳酸菌的分離及鑒定

2.2.1 自然發(fā)酵苦苦菜中乳酸菌的分離 自然發(fā)酵苦苦菜汁中乳酸菌經(jīng)培養(yǎng)、分離純化后，一共挑出10株可疑菌株進(jìn)行液體發(fā)酵，利用酸堿滴定法測(cè)定發(fā)酵液中的產(chǎn)酸量，最終共篩選出4株產(chǎn)酸較多的菌株，分別記為L(zhǎng)1、L2、L3和L4。

2.2.2 乳酸菌的鑒定 對(duì)4株產(chǎn)酸量高的乳酸菌（L1、L2、L3、L4）進(jìn)行進(jìn)一步的菌種鑒定，對(duì)菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)分析和生化特征鑒定等，結(jié)果見(jiàn)圖3和表2、3。通過(guò)運(yùn)動(dòng)性檢查結(jié)果顯示4菌株均無(wú)運(yùn)動(dòng)性。

圖2 預(yù)處理方式對(duì)苦苦菜腌制品品質(zhì)的影響Figure 2 The influence of different treatments on quality of dandelion before pickled processing

圖3 菌株L1、L2、L3、L4的革蘭氏染色結(jié)果Figure 3 Gram staining results of strain L1，L2，L3and L4

表2 生化鑒定結(jié)果Table 2 The biochemical test results

表2 生化鑒定結(jié)果Table 2 The biochemical test results

“－”為陰性反應(yīng)。

菌株 明膠試驗(yàn) 硫化氫試驗(yàn) 接觸酶試驗(yàn) 吲哚試驗(yàn)L1－－－－L2－－－－L3－－－－L4－－－－

表3 糖發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果Table 3 The result of sugar fermentation

表3 糖發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果Table 3 The result of sugar fermentation

“＋”為陽(yáng)性反應(yīng)，“－”為陰性反應(yīng)，“±”為不確定性反應(yīng)。

菌株 葡萄糖 纖維二糖 麥芽糖 甘露醇 山梨醇 乳糖 七葉苷 蔗糖 水楊苷L1＋＋＋＋＋＋＋＋＋L2＋－＋－－＋＋±－L3＋＋＋＋＋＋＋＋＋L4＋±＋－－＋－＋－

由圖3和表2、3可知，這4株菌均為革蘭氏陽(yáng)性，氧化酶陰性，接觸酶陰性桿菌，根據(jù)《伯杰氏細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》［11］，這4株菌都屬于乳酸桿菌Lactobacillus。在這4株菌中，L1和L3菌落圓形突起，表面光滑呈白色，邊緣整齊不透明，菌體形態(tài)為短桿或圓端直桿，單個(gè)或成對(duì)或呈鏈狀排列，兩者的生理生化試驗(yàn)結(jié)果也基本相同，試驗(yàn)用的糖、醇都能進(jìn)行發(fā)酵，可以判斷這兩株菌均為植物乳桿菌（Lactobacillusplantarum）。菌株L2圓形邊緣整齊，表面粗糙呈灰白色，菌體形態(tài)為短桿，單個(gè)或成對(duì)存在，糖醇發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果表示其不能利用纖維二糖、甘露醇、山梨醇和水楊苷，可判定為短乳桿菌（Lactobacillusbreris）。L4菌株呈白色圓形，邊緣整齊，表面光滑半透明，菌體形態(tài)為桿狀，單生或短鏈，對(duì)比其生化鑒定結(jié)果可判定該菌為發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillusfermentum）。

L1、L2、L3和L4隨苦苦菜發(fā)酵天數(shù)變化的生長(zhǎng)曲線(xiàn)如圖4所示。蔬菜的發(fā)酵主要有發(fā)酵初期、中期和后期3個(gè)階段［6］。由圖4可知，發(fā)酵初期0～3d，苦苦菜發(fā)酵液中的3種乳酸菌均快速地增長(zhǎng)，其中主要以植物乳桿菌為優(yōu)勢(shì)乳酸菌，短乳桿菌和發(fā)酵乳桿菌的數(shù)量不多，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，植物乳桿菌仍較快地增長(zhǎng)，而短乳桿菌和發(fā)酵乳桿菌呈現(xiàn)出緩慢的增長(zhǎng)趨勢(shì)。7～14d進(jìn)入主發(fā)酵階段，由于初期發(fā)酵進(jìn)行一段時(shí)間后，酸度增加pH下降，一些不抗酸的微生物不能存活，各種乳酸菌數(shù)量則不斷增長(zhǎng)，這時(shí)植物乳桿菌仍占優(yōu)勢(shì)，短乳桿菌菌落總數(shù)在這個(gè)階段迅速地增長(zhǎng)，植物乳桿菌和短乳桿菌分別達(dá)到各自增長(zhǎng)的最大值，而發(fā)酵乳桿菌的數(shù)量仍增長(zhǎng)緩慢。乳酸菌的大量繁殖，發(fā)酵后期15d后發(fā)酵液中乳酸含量猛增開(kāi)始反饋抑制乳酸菌的生長(zhǎng)，植物乳桿菌和短乳桿菌菌落總數(shù)開(kāi)始不斷減少，發(fā)酵乳桿菌的數(shù)量繼續(xù)增加后也開(kāi)始減少，為苦苦菜發(fā)酵后期的優(yōu)勢(shì)乳酸菌。

2.3 理化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

圖4 L1、L2、L3和L4菌株生長(zhǎng)曲線(xiàn)Figure 4 Growth curve of L1、L2、L3and L4

圖5 發(fā)酵過(guò)程中pH、總酸和鹽度變化曲線(xiàn)Figure 5 Changes curve of pH，total acid and salinity during fermentation

由圖5可知，前3d苦苦菜啟動(dòng)發(fā)酵，發(fā)酵初期隨著異型乳酸菌發(fā)酵的進(jìn)行，生成的乳酸、醋酸等物質(zhì)使苦苦菜發(fā)酵液的總酸含量不斷增加，同時(shí)導(dǎo)致發(fā)酵液的pH值迅速下降，苦苦菜在前3dpH值下降最快。主發(fā)酵期間隨著乳酸菌的大量繁殖，總酸度增長(zhǎng)最快，pH值呈現(xiàn)出不斷下降的趨勢(shì)。發(fā)酵后期體系進(jìn)入過(guò)酸階段，可發(fā)酵碳水化合物耗盡，乳酸菌群受到抑制，這種反饋抑制使總酸含量的增長(zhǎng)趨于平穩(wěn)，pH值也趨于穩(wěn)定。此外隨著發(fā)酵天數(shù)的增加，苦苦菜發(fā)酵液中的鹽度經(jīng)歷先上升后下降的趨勢(shì)，在發(fā)酵初期鹽度比初始鹽度高，因?yàn)樵诎l(fā)酵初期會(huì)產(chǎn)生使鹽度上升的亞硝酸鹽，但亞硝酸鹽會(huì)隨著發(fā)酵液pH的降低逐漸消失，整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，鹽度變化浮動(dòng)在0.3%以?xún)?nèi)。

2.4 苦苦菜中呈味氨基酸隨發(fā)酵時(shí)間的變化

食品中所含的游離氨基酸對(duì)食品的滋味貢獻(xiàn)大，所以測(cè)定游離氨基酸的組成與含量是研究氨基酸對(duì)食品滋味的影響時(shí)十分必要的內(nèi)容。氨基酸分為D-型氨基酸和L-型氨基酸，主要按照其側(cè)鏈基團(tuán)分類(lèi)，同時(shí)也影響了氨基酸的口味感官。甜味氨基酸大多為D-型氨基酸；L-型氨基酸中，呈苦味的主要為側(cè)基較大并帶堿基的氨基酸；當(dāng)側(cè)基很小時(shí)一般為甜感，當(dāng)側(cè)基帶有芳香基團(tuán)時(shí)通常具有香味［12］。按照味覺(jué)強(qiáng)度，可以大致把氨基酸分為甜味、苦味、鮮味和芳香族氨基酸（甜味：絲氨酸Ser、甘氨酸Gly、蘇氨酸Thr、丙氨酸Ala、脯氨酸Pro、組氨酸His；苦味：纈氨酸Val、亮氨酸Leu、異亮氨酸Ile、精氨酸Arg、蛋氨酸Met、色氨酸Trp；鮮味：谷氨酸Glu、賴(lài)氨酸Lys、天冬氨酸Asp；芳香族：酪氨酸Tyr、苯丙氨酸Phe、半胱氨酸Cys）。苦苦菜腌制發(fā)酵各個(gè)時(shí)期呈味氨基酸隨發(fā)酵時(shí)間的變化見(jiàn)圖6。

圖6 苦苦菜中呈味氨基酸隨發(fā)酵時(shí)間的變化Figure 6 Flavor amino acids in dandelion change along with the fermentation time

由圖6可知，整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中苦苦菜的氨基酸含量變化明顯。甜味、苦味、鮮味氨基酸含量相差不大，變化的平均值分別為1.84%，1.82%，1.72%，變化趨勢(shì)也基本一致，都呈現(xiàn)出先減少后增加再減少的變化，芳香族氨基酸含量變化的平均值為0.63%，僅約為其他呈味氨基酸的1/3。除芳香族氨基酸外，甜味、苦味、鮮味的氨基酸含量的變化為：發(fā)酵中期含量減少，發(fā)酵中后期含量增加，發(fā)酵末期含量減少，并均在發(fā)酵中后期20d左右達(dá)到最高值，含量分別為2.24%，2.08%，1.99%。從發(fā)酵時(shí)間看各呈味氨基酸含量的變化，發(fā)酵初期苦苦菜中氨基酸以苦味氨基酸居多，含量為1.88%，高于甜味1.80%和鮮味1.82%，同時(shí)由于苦苦菜中含有許多具有生物活性的倍半萜、三萜及黃酮類(lèi)化合物［13］，萜類(lèi)化合物一般以含有內(nèi)酯、內(nèi)氫鍵、內(nèi)縮醛、糖苷基等能形成螯合物的結(jié)構(gòu)而具有苦味，所以這個(gè)階段的苦苦菜發(fā)酵滋味一般。隨著發(fā)酵的進(jìn)行苦味氨基酸含量逐漸減少，甜味和鮮味氨基酸的含量逐漸增加?？辔栋被岬臏p少與乳酸菌的代謝有關(guān)，如Liu等［14］研究發(fā)現(xiàn)精氨酸（Arg）可以被發(fā)酵乳桿菌、短乳桿菌等乳酸桿菌代謝。

此外，感官試驗(yàn)表明，主發(fā)酵期間的苦苦菜苦味、咸味、酸味都比較均衡，滋味最好。發(fā)酵后期苦味氨基酸含量為1.91%，低于甜味氨基酸2.09%和鮮味氨基酸1.92%的含量，發(fā)酵乳桿菌逐漸成為優(yōu)勢(shì)乳酸菌，可代謝氨基酸的乳酸菌中短乳桿菌和發(fā)酵乳桿菌代謝氨基酸能力強(qiáng)，除了可以利用精氨酸（Arg）外，還可以利用絲氨酸（Ser）、谷氨酸（Glu）、天門(mén)冬氨酸（Asp）和支鏈氨基酸［14］，各種呈味氨基酸的含量都逐漸減少。整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中芳香族氨基酸的含量變化不大，只出現(xiàn)平均為0.08%小幅度的增減。

乳酸菌在自然生長(zhǎng)環(huán)境中有完善的蛋白代謝系統(tǒng)，因其不能同化無(wú)機(jī)氮源，所以必須通過(guò)降解蛋白質(zhì)和多肽來(lái)滿(mǎn)足細(xì)胞合成代謝對(duì)氨基酸的需要?？嗫嗖嗽谡麄€(gè)發(fā)酵過(guò)程中菜中的蛋白質(zhì)會(huì)被蛋白酶降解形成氨基酸，形成的氨基酸滲透進(jìn)入發(fā)酵液中，有些氨基酸又會(huì)被微生物生長(zhǎng)繁殖利用，各氨基酸含量的增減也與苦苦菜原料本身所含可溶性蛋白質(zhì)的含量及種類(lèi)都有關(guān)系。

3 結(jié)論

苦苦菜在自然發(fā)酵過(guò)程中，6～14d乳酸菌總數(shù)維持在最大值范圍，整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中乳酸菌生長(zhǎng)情況較好，菌落總數(shù)基本維持在107CFU/mL以上，發(fā)酵初期和主發(fā)酵期以植物乳桿菌為優(yōu)勢(shì)乳酸菌，發(fā)酵后期以發(fā)酵乳桿菌為優(yōu)勢(shì)菌。發(fā)酵初期，總酸增長(zhǎng)緩慢，呈味氨基酸中尤以苦味氨基酸含量較多，主發(fā)酵期，總酸含量快速上升，苦味氨基酸含量逐漸減少，甜味和鮮味氨基酸的含量逐漸增加，發(fā)酵后期，總酸含量趨于穩(wěn)定，苦味氨基酸含量低于甜味和鮮味氨基酸，發(fā)酵中后期7～20d苦苦菜的滋味最好。

苦苦菜的發(fā)酵風(fēng)味除了添加的輔料的作用外，還有微生物酶降解碳水化合物、蛋白質(zhì)等形成的風(fēng)味物質(zhì)，以及苦苦菜中各種呈味物質(zhì)與氨基酸通過(guò)拮抗、協(xié)同或掩蓋［15］等作用下共同產(chǎn)生的結(jié)果，限于本文篇幅與研究重點(diǎn)，此問(wèn)題有待進(jìn)一步研究。

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