盧 彬 王忠合 王 軍 鄒 敏 傅 力

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052；2.韓山師范學(xué)院生物系，廣東 潮州 521041）

近年來，有關(guān)魚類蛋白酶水解物抗氧化活性的研究引起了人們的廣泛關(guān)注，如鰱魚蛋白［1］、羅非魚內(nèi)臟蛋白［2］、金帶細(xì)鲹魚肉蛋白［3］、金槍魚肝臟蛋白［4］等。雖然酶水解產(chǎn)物具有一定的抗氧化活性，但遠(yuǎn)不如人工合成的抗氧化劑活性高［5］。美拉德反應(yīng)是食品中羰基和氨基之間的非酶促褐變反應(yīng)［6］。美拉德反應(yīng)不僅能使食品具有獨(dú)特的風(fēng)味和誘人的色澤，而且美拉德反應(yīng)產(chǎn)物（maillard reaction products，MRPs）中的類黑素、還原酮及一些含氮硫的雜環(huán)化合物均具有較強(qiáng)的抗氧化活性［7］。劉蒙蒙等［8］研究表明，羅非魚魚皮膠原肽與葡萄糖發(fā)生美拉德反應(yīng)后，產(chǎn)物的抗氧化性相較于原膠原肽有顯著提高。尤娟等［9］發(fā)現(xiàn)，鰱魚魚肉蛋白酶水解物與葡萄糖在60℃下，以1∶4（m∶m）的比例進(jìn)行糖基化反應(yīng)，得到的MRPs清除DPPH自由基能力較強(qiáng)。

金帶細(xì)鲹（Selaroidesleptolepis）為近海暖水性魚類，體長(zhǎng)可達(dá)18cm，中國(guó)產(chǎn)于南海、臺(tái)灣海峽，攝食浮游動(dòng)物和底棲動(dòng)物，含有豐富的蛋白質(zhì)、維生素類、鈣等營(yíng)養(yǎng)元素，且價(jià)格相對(duì)較低。作為原料加工的產(chǎn)品多為一些脫水魚干、魚粉等低附加值產(chǎn)品，也是一種未充分利用的大宗低值魚。本研究擬以金帶細(xì)鲹魚肉蛋白為原料，研究溫度對(duì)金帶細(xì)鲹魚肉蛋白水解物美拉德反應(yīng)及其MRPs抗氧化活性的影響，進(jìn)一步分析MRPs中具有抗氧化活性組分的產(chǎn)生過程、在整個(gè)反應(yīng)過程中的變化趨勢(shì)以及抗氧化形成機(jī)理，旨在為金帶細(xì)鲹魚高值化利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

金帶細(xì)鲹：購(gòu)于廣東省潮州市楓春市場(chǎng)；

胰蛋白酶：3 000～3 500NFU/mg，生工生物工程（上海）有限公司；

菲洛嗪、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS）：分析純，美國(guó)Sigma公司；

葡萄糖：分析純，廣東光華化學(xué)廠有限公司；

其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

紫外可見分光光度計(jì)：UV-2800型，尤尼科（上海）儀器有限公司；

冷凍干燥機(jī)：FD-1D-50型，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；

離心機(jī)：2-16P型，美國(guó)Sigma公司；

pH計(jì)：PHSJ-4A型，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；

電子恒溫水浴鍋：B056028型，深圳市國(guó)華電子有限公司。

1.2 方法

1.2.1 魚肉蛋白水解物的制備 魚肉糜按質(zhì)量比1∶3的比例與水混合，用6mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至8.0，酶解溫度為50℃，加1%（m/m）的胰蛋白酶（［E］/［S］＝1∶100）酶解3h，在酶解過程中用2mol/L NaOH調(diào)節(jié)溶液pH不變。酶解結(jié)束后100℃滅酶10min，將酶解液在10 000r/min離心10min，上清液冷凍干燥24h后，將制備好的水解物置于密封袋中，在－18℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 不同條件下美拉德反應(yīng)體系的制備 將制備好的水解物溶解在蒸餾水中，按魚肉蛋白水解物與葡萄糖質(zhì)量比1∶2加入葡萄糖，用1mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至9.0，最后將魚肉蛋白水解物濃度為25mg/mL的溶液置于20mL具塞密閉試管中分別在100，120 ℃下反應(yīng)0，1，2，3，4，5，6h（MRPs-100、MRPs-120分別表示100，120 ℃下所得的反應(yīng)產(chǎn)物）。反應(yīng)完畢后，立即取出置于冰水冷卻至室溫，測(cè)定pH值，然后置于－18℃冷凍備用。同時(shí)按上述相同試驗(yàn)條件，以不加葡萄糖的作為對(duì)照（對(duì)照-100、對(duì)照-120分別表示在100，120℃單獨(dú)加熱的魚肉蛋白水解物）。

1.2.3 中間產(chǎn)物和褐變程度的測(cè)定 根據(jù)文獻(xiàn)［10］修改如下：反應(yīng)樣液用蒸餾水稀釋100倍和50倍，以蒸餾水做參比，分別在294nm和420nm下測(cè)定吸光度。

1.2.4 游離氨基含量的測(cè)定 根據(jù)文獻(xiàn)［11］修改如下：取用蒸餾水稀釋25倍后的樣液125μL，加入0.212 5mol/L pH 8.2的磷酸鹽緩沖液2.0mL和0.01%的TNBS溶液1.0mL，混勻，置于50℃水浴中暗處反應(yīng)30min。反應(yīng)后加入0.1mol/L的亞硫酸鈉2.0mL終止反應(yīng)，室溫下冷卻15 min，于420nm處測(cè)定吸光度。以L-亮氨酸為標(biāo)樣繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。游離氨基含量表示為處理后的樣液的游離氨基數(shù)占處理前樣液游離氨基數(shù)的百分比。

1.2.5 美拉德反應(yīng)產(chǎn)物抗氧化活性的測(cè)定

（1）DPPH自由基清除率：根據(jù)文獻(xiàn)［12］修改如下：稱取一定量的DPPH，用無(wú)水乙醇配制成0.15mmol/L的溶液。取2mL用蒸餾水稀釋25倍后的樣品溶液與2mL DPPH溶液混合均勻，室溫暗處反應(yīng)30min后，于517nm處測(cè)定吸光度A2。同時(shí)測(cè)定2mL DPPH與2mL無(wú)水乙醇溶液混合后的吸光度A0；2mL樣液與2mL無(wú)水乙醇溶液混合后吸光度A1。DPPH自由基的清除率用式（1）計(jì)算：

式中：

R——DPPH自由基清除率，%；

A0——乙醇加DPPH溶液的吸光度；

A1——乙醇加樣液的吸光度；

A2——樣液加DPPH溶液的吸光度。

（2）還原力：根據(jù)文獻(xiàn)［13］修改如下：在10mL離心管中分別加入0.2mol/L pH 6.6的磷酸鹽緩沖液2mL和用蒸餾水稀釋25倍后的樣品溶液2mL，加入1%鐵氰化鉀2 mL，混合均勻后于50℃反應(yīng)20min。取出加入2mL 10%三氯乙酸終止反應(yīng)，5 000r/min離心10min。取上清液2 mL，加入去離子水2mL和FeCl30.5mL，混勻后靜置10 min，在700nm處檢測(cè)吸光度。吸光度的大小表示還原力的強(qiáng)弱。

（3）羥自由基清除率：根據(jù)文獻(xiàn)［14］修改如下：取用蒸餾水稀釋25倍后的樣品溶液1mL，加入9mmol/L FeSO40.25mL和9mmol/L水楊酸—乙醇溶液0.25mL，混勻后，加入1.5mL蒸餾水。最后加1mL 8.8mmol/L H2O2啟動(dòng)反應(yīng)，在37℃反應(yīng)30min，以蒸餾水為參比，在510nm下測(cè)定各樣液的吸光度A2。以1mL蒸餾水代替樣液，測(cè)定在510nm處的吸光度A0；以1mL蒸餾水代替H2O2，測(cè)定在510nm處的吸光度A1。按式（2）計(jì)算羥自由基清除率：

式中：

R——羥自由基清除率，%；

A0——蒸餾水代替樣液后在510nm處的吸光度；

A1——蒸餾水代替H2O2后在510nm處的吸光度；

A2——加入樣液后在510nm處的吸光度。

（4）Fe2＋螯合力的測(cè)定：根據(jù)文獻(xiàn)［15］修改如下：取用去離子水稀釋25倍后的樣品溶液1mL，加入去離子水1.85mL和2mmol/L的FeCl2溶液0.05mL，混合均勻室溫靜置30s，再加入5mmol/L的菲洛嗪溶液0.1mL，室溫下靜置10min，3 000r/min離心5min后于562nm處測(cè)定其吸光度A2。以1mL去離子水代替樣液，測(cè)定在562nm處的吸光度A0；以0.1mL去離子水代替菲洛嗪，測(cè)定562nm處的吸光度A1。按照式（3）計(jì)算螯合力：

式中：

R——Fe2＋螯合力，%；

A0——去離子水代替樣液后在562nm處的吸光度；

A1——去離子水代替菲洛嗪后在562nm處的吸光度；A2——加入樣液后在562nm處的吸光度。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)重復(fù)測(cè)定3次，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差SD。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行一維方差分析（oneway ANOVA），差異顯著性采用Duncan（鄧肯）檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水平P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 魚肉水解物水解度的測(cè)定

前期試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，采用胰蛋白酶水解金帶細(xì)鲹魚肉3h后，水解物的抗氧化性和功能特性較好，測(cè)定水解度為20.18%。

2.2 反應(yīng)產(chǎn)物pH值的變化

由圖1可知，MRPs-100的pH值隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)緩慢降低（P＜0.05）。MRPs-120的pH 值在前4h急劇降低（P＜0.05），4h后pH值趨于平緩。pH值的降低主要是因?yàn)槊览路磻?yīng)過程中糖和水解產(chǎn)物受熱發(fā)生降解生成一些有機(jī)酸，包括甲酸和乙酸以及其他可能形成的乳酸、丙酮酸、檸檬酸和糖精酸等［13］。對(duì)照組pH值無(wú)顯著變化（P＞0.05）。

2.3 中間產(chǎn)物和褐變程度的變化

如圖2所示，MRPs-120的A294nm和A420nm顯著高于MRPs-100下的吸光值（P＜0.05）。此結(jié)果與 Yilmaz等［16］的研究相一致，MRPs-120的顏色與MRPs-100相比，變?yōu)楦畹纳詈稚?。?duì)照（100，120℃）的A294nm無(wú)明顯變化，而A420nm略有升高，原因可能是金帶細(xì)鲹水解產(chǎn)物中含有少量的還原糖，加熱導(dǎo)致還原糖的焦糖化反應(yīng)或者糖與肽之間的美拉德反應(yīng)。

圖1 美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的pH值隨時(shí)間的變化Figure 1 Changes in pH value of MRPs as a function of reaction times

圖2 美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的中間產(chǎn)物和褐變程度隨時(shí)間的變化Figure 2 Changes in the intermediate compounds and the browning intensity of MRPs as a function of reaction times

2.4 游離氨基含量的變化

游離氨基的含量變化是用來比較美拉德反應(yīng)程度的指標(biāo)［17］。如圖3所示，反應(yīng)最初2h游離氨基的含量迅速下降，反應(yīng)2h時(shí)MRPs-120的游離氨基的損失速率是 MRPs-100的2.88倍，反應(yīng)2h之后游離氨基的含量變化不顯著（P＞0.05）。在美拉德反應(yīng)的初期階段，肽類或者蛋白質(zhì)的α－氨基和賴氨酸殘基的ε－氨基與葡萄糖的羰基發(fā)生反應(yīng)，造成這些高活性游離氨基大量減少，而其它氨基難以被利用，因而加熱處理后期游離氨基含量變化不明顯［18］。對(duì)照組游離氨基酸的含量無(wú)顯著變化（P＞0.05）。

2.5 DPPH自由基清除活性

如圖4所示，反應(yīng)時(shí)間前3h內(nèi)，MRPs-120的DPPH清除率顯著增大，在4～6h時(shí)趨于平緩。而MRPs-100的DPPH自由基清除率顯著低于 MRPs-120（P＜0.05）。MRPs-100、MRPs-120對(duì) DPPH 自由基清除率最大值分別為26.12%和82.70%。對(duì)照組DPPH自由基清除活性隨著反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)略微增大，當(dāng)在6h時(shí)，對(duì)照-120的DPPH自由基清除率只達(dá)到19.04%。研究發(fā)現(xiàn)MRPs的DPPH自由基清除活性在一定程度上與褐變程度有關(guān)，這可能是因?yàn)槊览路磻?yīng)在高級(jí)階段會(huì)形成褐色高分子聚合物類黑精，此類物質(zhì)具有顯著的抗氧化性［19］。

圖3 美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的游離氨基含量隨時(shí)間的變化Figure 3 Changes in free amino group content of MRPs as a function of reaction times

圖4 美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的DPPH自由基清除率隨時(shí)間的變化Figure 4 Changes in DPPH radical scavenging activity of MRPs as a function of reaction times

2.6 還原力

如圖5所示，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，MRPs-100和MRPs-120的還原力都顯著增大（P＜0.05），相比于 MRPs-100，MRPs-120表現(xiàn)出了較強(qiáng)的還原力。反應(yīng)6h后，MRPs-120的還原力是 MRPs-100的2.16倍，是對(duì)照-120的7.19倍。Jiang等［20］也發(fā)現(xiàn)，在整個(gè)美拉德反應(yīng)過程中，MRPs的還原能力隨反應(yīng)時(shí)間的增加而增加。對(duì)照組反應(yīng)6 h后其還原力無(wú)明顯變化（P＞0.05）。

2.7 羥基清除活性

由圖6可知，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，MRPs-100和MRPs-120的羥基清除率逐漸降低，相比未反應(yīng)前分別降低11.81%和17.27%。而對(duì)照組羥基清除率基本沒有變化（P＞0.05）。結(jié)果說明美拉德反應(yīng)使金帶細(xì)鲹魚肉水解產(chǎn)物的羥基清除活性下降。這與劉蒙蒙等［8］的研究結(jié)果不一致。

圖5 美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的還原力（A700nm）隨時(shí)間的變化Figure 5 Changes in Reducing power of MRPs as a function of reaction times

圖6 美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的羥自由基清除率隨時(shí)間的變化Figure 6 Changes in Hydroxyl radical scavenging activity of MRPs as a function of reaction times

2.8 Fe2＋螯合能力

如圖6所示，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)照組Fe2＋螯合力無(wú)顯著變化（P＞0.05），MRPs-100的Fe2＋螯合力略有減少，反應(yīng)6h后其Fe2＋螯合力相比對(duì)照-100減少5.60%，而MRPs-120的Fe2＋螯合力顯著減少，反應(yīng)6h后其Fe2＋螯合力相比未反應(yīng)前減少67.37%。其原因可能是因?yàn)榻饚Ъ?xì)鲹魚肉水解產(chǎn)物中一些游離氨基酸、肽鏈和蛋白質(zhì)，其側(cè)鏈上的氨基和羧基能與Fe2＋配位，但高溫下美拉德反應(yīng)使這類物質(zhì)大量減少，導(dǎo)致Fe2＋螯合能力也隨之減弱［21］。

圖7 美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的Fe2＋螯合率隨時(shí)間的變化Figure 7 Changes in Fe2＋chelating ability of MRPs as a function of reaction times

3 結(jié)論

（1）當(dāng)反應(yīng)溫度為120℃時(shí)，反應(yīng)體系的pH值和游離氨基酸含量與100℃時(shí)相比顯著降低，中間產(chǎn)物及褐變程度急劇增加，對(duì)照組沒有顯著變化。說明較高的反應(yīng)溫度下，能夠促進(jìn)金帶細(xì)鲹魚肉蛋白水解物與葡萄糖美拉德反應(yīng)的進(jìn)行。

（2）當(dāng)反應(yīng)溫度為120℃時(shí)，反應(yīng)產(chǎn)物的DPPH自由基清除率和還原力與100℃時(shí)相比大幅度提高，對(duì)照組沒有顯著變化。有研究表明［19］DPPH自由基清除率和還原力在一定程度上與褐變程度有關(guān)，可能是因?yàn)槊览路磻?yīng)在高級(jí)階段會(huì)形成褐色高分子聚合物類黑精，此類物質(zhì)具有顯著的抗氧化性。而羥基清除率和Fe2＋螯合力的降低，可能是因?yàn)槟撤N游離氨基酸或肽的含量大量減少導(dǎo)致，具體原因還有待進(jìn)一步的研究探討。

（3）雖然較高反應(yīng)溫度夠促進(jìn)美拉德反應(yīng)的進(jìn)行和抗氧化活性物質(zhì)的生成，但也會(huì)生成一些對(duì)人體有害的物質(zhì)如中級(jí)產(chǎn)物羥甲基糠醛、丙烯酰胺和晚期產(chǎn)物羧甲基賴氨酸等。如何抑制此類物質(zhì)的生成，而又不影響MRPs的抗氧化活性，需進(jìn)一步的分析研究。

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