萬(wàn)軍 車云 康寧寧 柴惠平

安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院普胸外科，合肥 230022

小細(xì)胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）是肺癌的常見基本類型之一，約占20%，其癌細(xì)胞生長(zhǎng)迅速，易轉(zhuǎn)移擴(kuò)散，并且有三分之二的肺癌患者在診斷時(shí)就已存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。SCLC以全身化療為主，但其治療水平在近30多年來(lái)一直處于平臺(tái)期[1-2]。多項(xiàng)研究從分子水平證實(shí)，SCLC的發(fā)生可能涉及多種因子的參與[3-5]。雖然SOCS3和PYK2與腫瘤發(fā)生發(fā)展間的關(guān)系正日益受到關(guān)注[6-8]，但目前尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道SOCS3和PYK2在SCLC中表達(dá)和機(jī)理方面的內(nèi)容。

因?yàn)閷?shí)體腫瘤過(guò)快的增殖生長(zhǎng)方式與其血管生成不成比例，腫瘤內(nèi)部普遍存在缺氧的情況。現(xiàn)有的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床觀察雖已證實(shí)缺氧是惡性腫瘤進(jìn)展的主要負(fù)面因素，但其具體作用機(jī)制尚未明確[9-10]。HIF-1是具有轉(zhuǎn)錄活性的核蛋白，主要由α和β兩個(gè)亞單位組成，一般情況下α亞單位是主要的調(diào)節(jié)因子。HIF-1普遍存在于人和哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)，只有在缺氧條件下才被穩(wěn)定表達(dá)，并發(fā)揮轉(zhuǎn)錄和基因調(diào)控作用[11]。近十年的研究顯示，HIF-1α和SOCS在人類許多常見的腫瘤中都有表達(dá)，它們調(diào)節(jié)腫瘤生物學(xué)的各個(gè)方面，如細(xì)胞生存、增殖、血管生成等[12-13]，從而成為非常引人矚目的抗癌藥物研發(fā)目標(biāo)。本研究主要探討在SCLC進(jìn)展過(guò)程中SOCS3與PYK2信號(hào)通路的關(guān)系及對(duì)HIF-1α表達(dá)和細(xì)胞增殖潛能的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

6周齡雄性裸鼠24只，體重為19～23 g（中科院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供）；人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株NCI-H446購(gòu)自上海北諾生物科技有限公司；HIF-1α、SOCS3、PYK2和Tyr402單克隆抗體購(gòu)自上海漢恒生物科技有限公司；RPMI 1640培養(yǎng)基、異硫氰酸熒光素（FITC）和RNase A酶購(gòu)自上海博升生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2..11轉(zhuǎn)染細(xì)胞的制備 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人小細(xì)胞肺癌株NCI-H446細(xì)胞，室溫下200 r/min離心5 min；然后用RPMI 1640培養(yǎng)基（0.5%的FCS）重懸細(xì)胞，200 r/min離心5 min，棄上清。用電穿孔緩沖液重懸細(xì)胞，將細(xì)胞濃度調(diào)整為每毫升2×106個(gè)，孵育20 min；加入質(zhì)?；蚱渌d體后混勻，使終濃度為25μg/ml。將800μl細(xì)胞懸液移入4 mm電擊杯內(nèi)，使細(xì)胞懸浮并避免氣泡；給予電擊。電擊參數(shù)為620 V持續(xù)60μs，脈沖1次；電擊后15 min內(nèi)將細(xì)胞小心地轉(zhuǎn)移至含3 ml RPMI 1640培養(yǎng)基（10%的FCS）的培養(yǎng)皿中，48 h后檢測(cè)。利用此方法分別制備Ad5轉(zhuǎn)染細(xì)胞株、Ad5-SOCS3轉(zhuǎn)染細(xì)胞株和Ad5-SOCS3-HIF-1α共轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。

1.2..22免疫熒光檢測(cè) 使用紅色熒光標(biāo)記，在倒置熒光顯微鏡下，分別檢測(cè)已轉(zhuǎn)染細(xì)胞株及未轉(zhuǎn)染細(xì)胞株中SOCS3的表達(dá)水平。

1.2..33細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的繪制 將人小細(xì)胞肺癌株NCI-H446細(xì)胞、Ad5轉(zhuǎn)染細(xì)胞株、Ad5-SOCS3轉(zhuǎn)染細(xì)胞株和Ad5-SOCS3-HIF-1α共轉(zhuǎn)染細(xì)胞株分別移至培養(yǎng)基中培養(yǎng)，于第4、8、12、16、20、24、28天使用細(xì)胞計(jì)數(shù)板分別計(jì)算細(xì)胞增殖數(shù)。檢測(cè)SOCS3單獨(dú)轉(zhuǎn)染及SOCS3與HIF-1α共轉(zhuǎn)染對(duì)細(xì)胞增殖的影響。

1.2..44建立實(shí)驗(yàn)用裸鼠移植瘤模型 24只裸鼠被隨機(jī)分為Ad5轉(zhuǎn)染對(duì)照組、Ad5-SOCS3單獨(dú)轉(zhuǎn)染組和Ad5-SOCS3-HIF-1α共同轉(zhuǎn)染組，每組8只。于裸鼠背側(cè)近右前肢處，皮下注射對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的NCI-H446小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株，總量為200μl，為含1×107個(gè)懸浮細(xì)胞的無(wú)血清RPMI 1640培養(yǎng)液。觀察并記錄各組裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)速率，定期測(cè)量腫瘤體積，計(jì)算腫瘤生長(zhǎng)抑制率，繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線圖。28天后，脫頸處死所有裸鼠，稱重比較瘤體。

1.2..55蛋白印跡法檢測(cè)表達(dá)情況 采用蛋白印跡法檢測(cè)HIF-1α、SOCS3、PYK2及其磷酸化活性形式Tyr402在裸鼠移植瘤中的表達(dá)情況。首先裂解懸浮細(xì)胞樣品，抽提目的蛋白質(zhì)；然后在100 V、120 min的條件下進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳；再次于15 mA硝酸纖維素膜轉(zhuǎn)膜過(guò)夜；最后封閉、一抗孵育、二抗孵育，使用X光片自動(dòng)洗片機(jī)顯影檢測(cè)蛋白表達(dá)情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法

電泳產(chǎn)物及蛋白印跡產(chǎn)物采用半定量的方法獲得數(shù)據(jù)。采用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以xˉ±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較選用SNK法檢驗(yàn)，以p＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染后SOCS3的表達(dá)情況

使用Ad5-SOCS3轉(zhuǎn)染小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株NCI-H446。經(jīng)細(xì)胞爬片并使用免疫熒光標(biāo)記SOCS3（紅色）后，研究者于倒置顯微鏡下發(fā)現(xiàn)Ad5-SOCS3轉(zhuǎn)染前后SOCS3蛋白的表達(dá)水平存在明顯差異，轉(zhuǎn)染后細(xì)胞胞質(zhì)的SOCS3蛋白表達(dá)水平明顯升高（圖1A和圖1B）。以未轉(zhuǎn)染的人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株NCI-H446為空白對(duì)照組，以單純轉(zhuǎn)染Ad5的細(xì)胞為陰性對(duì)照，以轉(zhuǎn)染了Ad5-SOCS3的細(xì)胞為陽(yáng)性組，以各組的β-actin蛋白表達(dá)情況為內(nèi)對(duì)照，采用蛋白印跡法檢測(cè)三組細(xì)胞中SOCS3蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，Ad5-SOCS3轉(zhuǎn)染組中SOCS3蛋白表達(dá)水平顯著高于Ad5組和空白對(duì)照組，Ad5組中SOCS3蛋白表達(dá)水平明顯高于空白對(duì)照組（圖1C和圖片1D，均p＜0.05）。

2.2 裸鼠模型皮下移植瘤生長(zhǎng)情況

從培養(yǎng)皿傳代轉(zhuǎn)染的細(xì)胞開始，每4天計(jì)數(shù)一次細(xì)胞增殖數(shù)量，至第28天結(jié)束觀察計(jì)數(shù)，Ad5轉(zhuǎn)染組、Ad5-SOCS3轉(zhuǎn)染組和Ad5-SOCS3-HIF-1α共轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞增殖情況存在明顯差異，其中Ad5-SOCS3轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞增殖速率最慢、Ad5轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞增殖速率最快、Ad5-SOCS3-HIF-1α轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞增殖速率居中但更接近Ad5轉(zhuǎn)染組，Ad5-SOCS3轉(zhuǎn)染組和Ad5轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞增殖速率相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖2A，p＜0.05）。

將Ad5轉(zhuǎn)染組、Ad5-SOCS3轉(zhuǎn)染組和Ad5-SOCS3-HIF-1α共轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞接種于裸鼠皮下，每4天測(cè)量一次皮下腫瘤的生長(zhǎng)情況，至第28天結(jié)束觀察測(cè)量。三組裸鼠皮下移植瘤生長(zhǎng)情況與各組細(xì)胞在培養(yǎng)皿中的增殖情況一致（圖2c），至第28天取出裸鼠皮下移植瘤，Ad5轉(zhuǎn)染組皮下移植瘤的平均體積最大、平均質(zhì)量最大，Ad5-SOCS3轉(zhuǎn)染組皮下移植瘤的平均體積最小、平均質(zhì)量最小，Ad5-SOCS3-HIF-1α共轉(zhuǎn)染組的皮下移植瘤的平均體積和平均質(zhì)量均居中；三組裸鼠28日皮下移植瘤腫瘤質(zhì)量存在顯著性差異（F=59.825，P=0.000；圖2B、圖2D和表1）。三組裸鼠皮下移植瘤腫瘤質(zhì)量SNK法進(jìn)行組間比較顯示，每?jī)蓚€(gè)比較組間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P=0.000）。

表11 三組裸鼠模型第2828天時(shí)皮下移植瘤質(zhì)量比較

2.3 Ad 5-SOCS3轉(zhuǎn)染及干預(yù)對(duì)HI F-1α和PYK2表達(dá)的影響

2 2..3.1 轉(zhuǎn)染SOCS3后HI F-1α和PYK2表達(dá)的比較 在未轉(zhuǎn)染SOCS3和（或）HIF-1α的小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株（Ad5轉(zhuǎn)染組）中，HIF-1α、PYK2及其磷酸化活性形式Tyr402的表達(dá)情況如圖3第1泳道所示。與第1泳道相比，Ad5-SOCS3轉(zhuǎn)染組（圖3第2泳道）、Ad5-SOCS3-HIF-1α共轉(zhuǎn)染組（圖3第4泳道）中HIF-1α的表達(dá)水平明顯下降，其中SOCS3轉(zhuǎn)染組HIF-1α的表達(dá)水平下降最明顯，Ad5-SOCS3-HIF-1α共轉(zhuǎn)染組HIF-1α的表達(dá)水平明顯高于Ad5-SOCS3轉(zhuǎn)染組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均p＜0.05）。Ad5-SOCS3轉(zhuǎn)染組和 Ad5-SOCS3-HIF-1α共轉(zhuǎn)染組的PYK2和Tyr402表達(dá)水平基本一致，但均明顯低于未轉(zhuǎn)染組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均p＜0.05）。

22..3.2特異性干預(yù)對(duì)HIF-1α和Tyr Tyr 402402表達(dá)的影響 PYK2特異性小干擾組（siPYK2組，圖3第3泳道）的HIF-1α表達(dá)水平明顯低于未轉(zhuǎn)染組，且Tyr402的表達(dá)水平同樣低于未轉(zhuǎn)染組。

3 討論

SOCS3是SOCS家族成員之一，能夠阻斷細(xì)胞因子應(yīng)答并負(fù)反饋調(diào)節(jié)信號(hào)傳導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子 3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）的信號(hào)通路，在抑制細(xì)胞過(guò)度增殖、誘導(dǎo)凋亡、維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)等方面發(fā)揮重要作用[14-15]。SOCS3在多種腫瘤中的表達(dá)均下調(diào)，與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。據(jù)推測(cè)，SOCS3表達(dá)上調(diào)可能參與某些腫瘤細(xì)胞對(duì)腫瘤生長(zhǎng)抑制因子的應(yīng)答。在本研究中，與未轉(zhuǎn)染Ad5-SOCS3的情況相比，Ad5-SOCS3轉(zhuǎn)染后，小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株及其裸鼠皮下移植瘤的增長(zhǎng)速率均下降，其中以Ad5-SOCS3轉(zhuǎn)染組小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株及其裸鼠皮下移植瘤的增殖速率明顯且低于Ad5轉(zhuǎn)染組和Ad5-SOCS3-HIF-1α共轉(zhuǎn)染組，而Ad5-SOCS3-HIF-1α共轉(zhuǎn)染對(duì)細(xì)胞株和皮下移植瘤的影響較小。這提示Ad5-SOCS3-HIF-1α共轉(zhuǎn)染可削弱Ad5-SOCS3單獨(dú)轉(zhuǎn)染對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用。從第28天移植瘤質(zhì)量的比較來(lái)看，Ad5-SOCS3單獨(dú)轉(zhuǎn)染組的移植瘤質(zhì)量明顯小于Ad5-SOCS3-HIF-1α共轉(zhuǎn)染組的，而共轉(zhuǎn)染組的移植瘤質(zhì)量又明顯小于Ad5轉(zhuǎn)染組的。這提示SOCS3基因?qū)π〖?xì)胞肺癌細(xì)胞株NCI-H446中PYK2介導(dǎo)的HIF-1α的信號(hào)通路及細(xì)胞增殖有負(fù)性調(diào)控作用，且Ad5-SOCS3-HIF-1α共轉(zhuǎn)染或siPYK2技術(shù)僅可在一定程度上抑制這種負(fù)性調(diào)控，使HIF-1α的表達(dá)較Ad5-SOCS3單獨(dú)轉(zhuǎn)染時(shí)升高，但其表達(dá)無(wú)法達(dá)到未轉(zhuǎn)染SOCS3時(shí)的水平。因此，SOCS3基因有可能成為小細(xì)胞肺癌基因治療的一個(gè)新的靶點(diǎn)。

PYK是一種非受體酪氨酸激酶，在細(xì)胞內(nèi)分布廣泛，與細(xì)胞內(nèi)多種信號(hào)傳導(dǎo)通路及其生物學(xué)功能密切相關(guān)，調(diào)節(jié)細(xì)胞存活、增殖和遷移。PYK2信號(hào)通路的活化能夠增強(qiáng)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)并促進(jìn)細(xì)胞在非錨定狀態(tài)下的存活[16]。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，高侵襲性腫瘤細(xì)胞存在PYK2蛋白表達(dá)上調(diào)和（或）活性增強(qiáng)的現(xiàn)象。目前，對(duì)PYK2的研究主要集中在病理生理過(guò)程中其多個(gè)磷酸化位點(diǎn)活性的變化及其對(duì)下游靶蛋白磷酸化作用的方面。其中，酪氨酸402位點(diǎn)（Tyr402）是PYK2最重要的自身磷酸化位點(diǎn)，為PYK2活化和功能所必需，其磷酸化后可以增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力，可能在促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移方面具有重要作用。對(duì)肝癌組織的研究顯示，PYK2高表達(dá)者多為晚期肝癌患者，而動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示PYK2過(guò)表達(dá)可見于侵襲邊緣的腫瘤細(xì)胞和肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)中[17]。雖然PYK2廣泛表達(dá)于正常胃黏膜，但其在胃癌組織中的表達(dá)顯著降低，且胃癌組織學(xué)分級(jí)和TNM分期越高PYK2表達(dá)就越低。這表明PYK2蛋白在不同腫瘤中的表達(dá)情況并不相同，對(duì)不同腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用可能也不同。對(duì)肺癌的研究顯示，PYK2是參與懸浮生長(zhǎng)肺腺癌細(xì)胞的生存和神經(jīng)肽誘導(dǎo)的小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖信號(hào)通路的關(guān)鍵效應(yīng)分子。

越來(lái)越多的研究顯示PYK2對(duì)多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展均具有非常重要的作用。在轉(zhuǎn)移性和侵襲性的神經(jīng)膠質(zhì)瘤和肝癌細(xì)胞中PYK2的表達(dá)顯著增強(qiáng)。侵襲性乳腺癌細(xì)胞和小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中均可檢測(cè)到PYK2蛋白Tyr402位點(diǎn)的磷酸化，而且PYK2相關(guān)途徑的活化參與人類腫瘤細(xì)胞黏附能力的上調(diào)。盡管已有大量關(guān)于PYK2下游信號(hào)通路的研究，但是有關(guān)PYK2的調(diào)節(jié)機(jī)制目前尚不明確。在我們的研究中，與未轉(zhuǎn)染SOCS3的細(xì)胞相比，Ad5-SOCS3轉(zhuǎn)染細(xì)胞中PYK2的表達(dá)水平及Tyr402的表達(dá)水平均明顯下降，其效果與si-PYK2技術(shù)產(chǎn)生的效果相同，提示SOCS3蛋白可能具有負(fù)性調(diào)節(jié)PYK2表達(dá)的作用，可能是PYK2信號(hào)通路中非常重要的負(fù)性調(diào)節(jié)因子。

不過(guò)，SOCS3與PYK2間的相互作用是否通過(guò)磷酸化的Tyr402位點(diǎn)以及SOCS3對(duì)PYK2下游與細(xì)胞遷移相關(guān)的細(xì)胞骨架蛋白的調(diào)節(jié)是否與肺癌轉(zhuǎn)移有關(guān)等問(wèn)題均仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。

［1］Stamatis G.Neuroendocrine tumors of the lung:the role of surgery in small cell lung cancer[J].Thorac Surg Clin,2014,24(3):313-326.

［2］Katsenos S,Nikolopoulou M.Intramedullary thoracic spinal metastasis from small-cell lung cancer[J].Monaldi Arch Chest Dis,2013,79(3-4):140-142.

［3］Ishii J,Sato H,Yazawa T,et al.ClassⅢ/Ⅳ POU transcription factors expressed in small cell lung cancer cells are involved in proneural/neuroendocrine differentiation[J].Pathol Int,2014,64(9):415-422.

［4］Ahn SJ,Choi C,Choi YD,et al.Microarray analysis of gene expression in lung cancer cell lines treated by fractionated irradiation[J].Anticancer Res,2014,34(9):4939-4948.

［5］Wildey G,Chen Y,Lent I,et al.Pharmacogenomic approach to identify drug sensitivity in small-cell lung cancer[J].PLoSOne,2014,9(9):e106784.

［6］Zhang SY,Qiu XS.Expression of SOCS3 and Pyk2 and their correlation in non-small cell lung cancer[J].Zhonghua Bing Li Xue Za Zh,2012,41(10):657-661.

［7］Williams JJ,Munro KM,Palmer TM.Role of Ubiquitylation in Controlling Suppressor of Cytokine Signalling 3(SOCS3)Function and Expression[J].Cells,2014,3(2):546-562.

［8］Inagaki-Ohara K,Kondo T,Ito M,et al.SOCS,inflammation,and cancer[J].JAKSTAT,2013,2(3):e24053.

［9］Yu L,Hales CA.Long-term exposure to hypoxia inhibits tumor progression of lung cancer in rats and mice[J]BMC Cancer,2011,11:331.

［10］Swinson DE,Jones JL,Cox G,et al.Hypoxia-inducible factor-1αin non small cell lung cancer:relation to growth factor,protease and apoptosis pathways[J].Int J Cancer,111(1):43-50.

［11］Long Q,Fan C,Kai W,et al.Hypoxia inducible factor-1αexpression is associated with hippocampal apoptosis during epileptogenesis[J].Brain Res,2014,1590:20-30.

［12］Bryant JL,Meredith SL,Williams KJ,et al.Targeting hypoxia in the treatment of small cell lung cancer[J].Lung Cancer,2014,86(2):126-132.

［13］Xu WP,Li WD.SOCS3:a potential therapeutic target for many human diseases[J].Yao Xue Xue Bao,2011,46(7):747-752.

［14］Xu Q,Zheng F,Gong F,et al.Suppressor of cytokine signaling 3(SOCS3)gene transfer prolongs the survival of the murine cardiac allograft by attenuating interleukin-17-producing alloreactive T-cell responses[J].J Gene Med,2014,16(3-4):66-74.

［15］Qin W,Chen T,Yang JH,et al.Study of single nucleotide polymorphism of SOCS gene in typical myeloproliferative neoplasms[J].Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi,2013,21(6):1507-1512.

［16］Cao Z,George J,Baden DG,et al.Brevetoxin-induced phosphorylation of Pyk2 and Src in murine neocortical neurons involves distinct signaling pathways[J].Brain Res,2007,1184:17-27.

［17］Li HY,Cui XY,Wu W,et al.Pyk2 and Src mediate signaling to CCL18-induced breast cancer metastasis[J].J Cell Biochem,2014,115(3):596-603.