大黃素對(duì)Lewis肺癌小鼠細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響

任維華1，金銀環(huán)2

(1.石家莊醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，河北 石家莊 050000；2.石家莊人民醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，河北 石家莊 050091)

[摘要]目的探討大黃素對(duì)Lewis肺癌小鼠腫瘤細(xì)胞Survivin mRNA、c-myc mRNA表達(dá)的影響及其機(jī)制。方法建立Lewis肺癌小鼠模型，按分組情況干預(yù)28 d，觀察腫瘤生長情況，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)Survivin mRNA、c-myc mRNA表達(dá)。結(jié)果大黃素組、順鉑組、大黃素+順鉑組的抑瘤率分別為40.31%、59.04%、70.56%。與模型組相比，大黃素組、順鉑組、大黃素+順鉑組Survivin mRNA和c-myc mRNA表達(dá)均降低(P<0.05)，其中均以大黃素+順鉑組最低。結(jié)論大黃素可通過下調(diào)Survivin mRNA、c-myc mRNA表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，進(jìn)而發(fā)揮抑制腫瘤作用。

[關(guān)鍵詞]大黃素；肺癌；凋亡相關(guān)基因

作者簡(jiǎn)介：任維華(1976-)，女，學(xué)士，醫(yī)師，主要從事腫瘤基礎(chǔ)與臨床研究工作。E-mail：wllxcf@163.com

DOI:10.3969/j.issn.1673-5412.2015.01.001

[中圖分類號(hào)]R734.2；R730.23

收稿日期：(2014-05-28)

Effects of Emodin on Cell Apoptosis

Related Gene Expressions of Mice with Lewis Lung Cancer

Ren Weihua1,Jin Yinhuan2

(1.ShijiazhuangMedicalCollege,Shijiazhuang050000,China;

2.ShijiazhuangPeople’sMedicalCollege,Shijiazhuang050091,China)

Abstract[]ObjectiveTo investigate the effects of emodin on Survivin mRNA,c-myc mRNA expressions of mice with Lewis lung cancer and the mechanisms.MethodsLewis lung cancer model was established,Intervention was enforced for 28 days according to grouping,the tumor growth was observed,and the Survivin mRNA,c-myc mRNA expression were detected by using real-time quantitative PCR.ResultsThe inhibition rates were respectively 40.31%,59.04% and 70.56% in the emodin group,the cisplatin group and the emodin plus cisplatin group.Compared with the model group,the Survivin mRNA,c-myc mRNA expressions were decreased of the emodin group,the cisplatin group and the emodin plus cisplatin group (P<0.05); their expressions in the emodin plus cisplatin group were the lowest of all the groups.ConclusionEmodin can inhibit the tumor growth,through inducing the cell apoptosis by reducing Survivin mRNA,c-myc mRNA gene expressions.

[Key words]emodin; lung cancer; apoptosis related gene

肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率與病死率均占首位，雖然治療手段的進(jìn)展及新藥的研發(fā)使得療效有所提高，但仍不十分令人滿意。中醫(yī)藥在腫瘤治療中占有重要地位，尤其在晚期腫瘤保守治療中具有諸多優(yōu)勢(shì)。研究[1]表明，大黃素(6-甲基-1，3，8-三羥基蒽醌)具有抗菌、抗炎及抗免疫抑制等多種生物學(xué)功能，并可抑制卵巢癌、胰腺癌等腫瘤細(xì)胞生長，具有抗腫瘤作用。因此，我們利用Lewis肺癌小鼠模型，研究大黃素對(duì)Lewis肺癌小鼠細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的影響，以期為大黃素治療肺癌提供有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1材料與方法

1.1動(dòng)物與瘤株C57BL/6小鼠(雄性，體質(zhì)量約20 g)購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，Lewis肺癌細(xì)胞株購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院。

1.2藥物與試劑大黃素(美國Sigma公司，用二甲基亞砜配制成0.2 mmol·L-1的溶液，-20 ℃保存)，注射用順鉑(齊魯制藥有限公司，生理鹽稀釋成0.1 mmol·L-1的溶液，-20 ℃保存)，培養(yǎng)基(DMEM型)、胎牛血清(美國Gibco公司)，高純總RNA快速提取試劑盒(美國Generay公司)，cDNA合成試劑(立陶宛Fermentas公司)，qPCR試劑(美國Bio-Rad公司)，瓊脂糖OX(英國OID公司)，3-(N-嗎啉基)丙磺酸(德國Merke公司)，焦碳酸二乙酯、二甲基亞砜(美國Sigma公司)。

1.3儀器設(shè)備CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國Forma Scientific公司)；SZ-D2倒置顯微鏡(江蘇醫(yī)用儀器廠)；Merinton SMA4000高精度分光光度計(jì)(北京美林恒通科技有限公司)；CFX connect Real-Time PCR System(美國Bio-Rad公司)；電泳儀(上海醫(yī)學(xué)儀器廠)；電泳槽(上海醫(yī)學(xué)儀器廠)；凝膠紫外分析儀(美國Bekman公司)。

1.4模型建立與實(shí)驗(yàn)分組將Lewis肺癌細(xì)胞株分別接種于10只C57BL/6小鼠右側(cè)腋下，待小鼠右腋部皮下瘤體隆起明顯時(shí)無菌條件下取瘤體，研磨，稀釋，制備細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×107·L-1，每只0.2 mL接種于40只C57BL/6小鼠右側(cè)腋窩皮下，復(fù)制Lewis肺癌小鼠模型，選取32只隨機(jī)分為模型組、大黃素組、順鉑組、大黃素+順鉑組4組，每組8只；4組分別給予生理鹽水、大黃素配制液、順鉑稀釋液、大黃素配制液+順鉑稀釋液0.2 mL/次灌胃，2次/d，共干預(yù)28 d，末次用藥后24 h內(nèi)處死取材。

參考文獻(xiàn)1.5抑瘤率的計(jì)算[2]，抑瘤率計(jì)算公式：抑瘤率=(1-藥組平均瘤質(zhì)量∕模型組平均瘤質(zhì)量)×100%，根據(jù)該公式計(jì)算抑瘤率。

1.6實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)Survivin mRNA、c-myc mRNA表達(dá)取材進(jìn)行相應(yīng)處理后，提取總RNA，檢測(cè)RNA純度及濃度以判定其質(zhì)量，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，具體步驟參照試劑盒說明書。應(yīng)用熒光定量PCR分析軟件BIO-RAD CFX Manager對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所涉及引物序列見表1。

2結(jié)果

2.1各組瘤質(zhì)量、抑瘤率比較見表2。

表1　引物序列

表2　各組瘤質(zhì)量、抑瘤率比較

注：與模型組比較，1)P<0.05；與大黃素+順鉑組比較，2)P<0.05

2.2各組Survivin mRNA、c-myc mRNA表達(dá)見表3。

表3　各組Survivin、c-myc表達(dá)比較

注：與模型組比較，1)P<0.05；與大黃素+順鉑組比較，2)P<0.05

3討論

細(xì)胞凋亡是一種基因控制的細(xì)胞自主性死亡過程，腫瘤的發(fā)生發(fā)展與腫瘤細(xì)胞凋亡紊亂關(guān)系密切，不管是凋亡促進(jìn)蛋白減少,還是凋亡抑制蛋白增多，都會(huì)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡減少，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的生長[3]。腫瘤細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Survivin、c-myc是目前研究的熱點(diǎn)。其中Survivin是目前發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的一種凋亡抑制因子，屬凋亡抑制蛋白家族成員，不但可直接或間接抑制凋亡終末效應(yīng)蛋白caspase的活化，進(jìn)而阻止細(xì)胞凋亡，還可與紡錘體纖維結(jié)合，保護(hù)細(xì)胞有絲分裂的完整性，抑制細(xì)胞的凋亡[4]。c-myc是一種位于染色體8q24上的原癌基因，是腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因子，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞程序性死亡、細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化及細(xì)胞周期過程，其表達(dá)升高可使細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和凋亡發(fā)生變化，導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)變[5]。

大黃素是從中藥大黃中提取的有效單體，其抗腫瘤作用具有多靶點(diǎn)、多環(huán)節(jié)、多效應(yīng)的特點(diǎn)，可從抑制癌基因表達(dá)、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、影響細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、延遲或阻滯細(xì)胞周期的進(jìn)程、抑制腫瘤血管形成等多方面發(fā)揮作用[6]。研究[7]發(fā)現(xiàn)，大黃素對(duì)多種腫瘤均有抑制作用，肺癌方面體外實(shí)驗(yàn)研究較多，已證實(shí)大黃素能抑制人肺癌A549細(xì)胞分裂增殖，并可促進(jìn)人肺鱗癌細(xì)胞系CH27、人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系H460的細(xì)胞凋亡，而體內(nèi)試驗(yàn)研究相對(duì)較少。本研究以大黃素為研究對(duì)象，建立Lewis肺癌小鼠模型，探討了大黃素對(duì)Lewis肺癌小鼠細(xì)胞Survivin mRNA、c-myc mRNA表達(dá)的影響。結(jié)果表明，大黃素組、順鉑組、大黃素+順鉑組的抑瘤率分別為40.31%、59.04%、70.56%；與模型組相比，各給藥組Survivin mRNA、c-myc mRNA表達(dá)均降低(P<0.05)，其中以大黃素+順組最低，提示兩者聯(lián)合有協(xié)同作用。

總之，大黃素可通過下調(diào)Survivin mRNA、c-myc mRNA表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，進(jìn)而發(fā)揮抑制腫瘤作用，為大黃素治療肺癌提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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