文/李轉(zhuǎn)羽 宋靜頤 劉松玲 葛紹陽 劉 力 桑 躍 武永超 張建銘 劉治麟 趙 亮*

（1中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京市高等學(xué)校畜產(chǎn)品工程研究中心；2江西鴻燕健康科技有限公司；3北京和益源生物技術(shù)有限公司）

雙歧桿菌是一種重要的益生菌，對人體有多種益生功能。長雙歧桿菌BBMN68來源于健康長壽老人腸道，有研究證明BBMN68具有調(diào)節(jié)免疫[1，2]、調(diào)節(jié)腸道菌群、改善便秘[3]等作用，是優(yōu)良的益生菌。

雙歧桿菌屬于專性厭氧菌，對氧氣敏感，這使其在加工、包裝和貯藏過程中極易產(chǎn)生氧中毒，進(jìn)而導(dǎo)致活力降低，從而限制其進(jìn)一步的生產(chǎn)應(yīng)用。由于雙歧桿菌細(xì)胞內(nèi)無過氧化氫酶，有氧氣存在時，細(xì)胞無法分解代謝所產(chǎn)生的過氧化氫，而過氧化氫對碳水化合物代謝系統(tǒng)中的果糖-6-磷酸酮酶活性有不可逆的阻礙作用[4～6]。此外，有氧時，細(xì)胞內(nèi)的某些酶及輔酶因被氧化而失活，也會造成代謝障礙。因此，如何提高雙歧桿菌的耐氧性是促進(jìn)其廣泛應(yīng)用的關(guān)鍵問題。

目前，提高雙歧桿菌耐氧性能的方法主要有微膠囊法[7]和耐氧菌株馴化法2 種。相比于微膠囊法，通過耐氧馴化獲得耐氧菌株的方法不僅可以避免雙歧桿菌在益生菌制品的加工、包裝、貯藏和攝入過程中失活，還可以降低生產(chǎn)中對發(fā)酵工藝及設(shè)備的要求，從而減少產(chǎn)品生產(chǎn)成本[8]，有利于雙歧桿菌BBMN68的大規(guī)模應(yīng)用，是一種非常具有發(fā)展前景的方法。

本研究采用逐漸增加氧分壓[4]的方法馴化BBMN68菌株，增強其在產(chǎn)品中的穩(wěn)定性，為今后馴化其它厭氧性菌株提供參考，同時也為BBMN68的大規(guī)模應(yīng)用提供條件。

1 試驗材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌株

長雙歧桿菌BBMN68，由教育部-北京市共建功能乳品重點實驗室提供。

1.1.2 培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，酵母浸粉5 g，牛肉膏10 g，葡萄糖20 g，吐溫80 1 mL，無水乙酸鈉5 g，磷酸氫二鉀2 g，檸檬酸氫二銨2 g，四水合硫酸錳0.25 g，七水合硫酸鎂0.58 g，蒸餾水1 L；pH值為6.5。

MRSC培養(yǎng)基：MRS培養(yǎng)基中每升添加半胱氨酸0.5 g；MRSC固體培養(yǎng)基：MRS培養(yǎng)基中每升添加瓊脂15 g；MRSC耐膽鹽培養(yǎng)基：MRSC培養(yǎng)基中的吐溫80含量改為1.5%，膽鹽含量根據(jù)試驗要求添加；深冷保護(hù)劑：12%脫脂乳中加入30%甘油。

所有培養(yǎng)基均在121 ℃高溫下高壓蒸汽滅菌15 min。

1.1.3 主要試劑及來源

半胱氨酸鹽酸鹽：美國AMRESCO公司；瓊脂糖G-10：西班牙Biowest公司；牛膽鹽（生物試劑）：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；D2000 DNA Marker，2×Taq PCR MasterMix，細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）：天根生物技術(shù)有限責(zé)任公司；Loading Buffer：日本Takara公司。

1.1.4 主要儀器及設(shè)備

WFZ UV-2102PC型紫外可見分光光度計：尤尼柯（上海）儀器有限公司；DNP-9082型電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海精宏實驗設(shè)備有限公司；TGL-16B臺式離心機：上海安亭科學(xué)儀器廠；LDZM立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；DYY-6C型電泳儀：北京六一儀器廠；SW-CJ-2FS潔凈工作臺：蘇州佳寶凈化工程設(shè)備有限公司；DELTA320 pH計：METTLER-TOELDO公司；T100 PCR儀：美國伯樂公司；4400凝膠成像掃描儀：Gel-Pro公司；Infite200PRO酶標(biāo)儀：Tecan公司；XSZ-4G顯微鏡：COIC公司。

1.1.5 16S rDNA的PCR擴增引物

上游引物：5’-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG -3’，下游引物：5’-TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T -3’，均由Invitrogen生物技術(shù)有限公司合成。

1.2 試驗方法

1.2.1 形態(tài)學(xué)鑒定

參考張苓花等方法[9]，挑取厭氧培養(yǎng)的MRSC固體培養(yǎng)基上的菌落進(jìn)行革蘭染色和鏡檢，觀察菌體顏色、大小、分叉形狀等是否符合雙歧桿菌屬的基本形態(tài)特征。

1.2.2 長雙歧桿菌BBMN68的耐氧馴化

將鏡檢合格的菌液以5%接種量接種于滅菌的MRSC培養(yǎng)基中，將接種后的厭氧管放于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)培養(yǎng)基出現(xiàn)明顯渾濁時進(jìn)行傳代。傳代至第10次后，換MRS培養(yǎng)基繼續(xù)傳代至23 次，菌株生長達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)。

1.2.3 利用OD600nm篩選耐氧菌株

參照Talwalkar等方法[10]，將傳代菌液進(jìn)行10 倍梯度稀釋后倒平板，37 ℃厭氧條件倒置培養(yǎng)48 h，從固體平板上挑取單菌落約30 個。將其接種、活化后，分別等量接種于pH值為6.5的MRS/MRSC培養(yǎng)基中。經(jīng)過37 ℃、12 h的有氧/厭氧培養(yǎng)后，分別測定不同培養(yǎng)條件下的OD600nm，并計算有氧條件與厭氧條件下OD600nm的比值。

1.2.4 耐氧菌株16S rDNA序列鑒定

用細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒提取馴化菌株DBBMN68的基因組，以基因組為模板，進(jìn)行16S rDNA基因的PCR擴增，反應(yīng)體系及反應(yīng)條件如下。

PCR反應(yīng)體系（50 μL）：Premix Ex Taq 25 μL，上游引物1.25 μL，下游引物1.25 μL，基因組模板2.5 μL，超純水20 μL。

PCR擴增條件：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性15 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，共34 個循環(huán)，最后72 ℃延伸3 min，反應(yīng)結(jié)束。

PCR產(chǎn)物純化后委托上海生工生物技術(shù)有限公司測序，得到的PCR產(chǎn)物序列通過BLAST在基因庫中進(jìn)行同源性比對，鑒定到種。

1.2.5 耐氧菌株耐酸能力測定

37 ℃活化待測菌株15 h后，分別以2%的接種量分別接種于pH值2.5、3.0和6.5的MRSC培養(yǎng)基中。37 ℃下分別培養(yǎng)0、0.5、1和2 h，對馴化菌株與原始菌株進(jìn)行平板計數(shù)。每組試驗至少有2 個重復(fù)。

1.2.6 耐氧菌株耐膽鹽能力測定

37 ℃活化待測菌株15 h后，分別以1%的接種量接種于含0%、3%、5%膽鹽的MRSC耐膽鹽培養(yǎng)基中。每隔2 h測定一次菌液的OD600nm，一直持續(xù)12 h。每組試驗至少有3 個重復(fù)。

1.2.7 雙歧桿菌的平板菌落計數(shù)

參考GB/T 4789.34-2003的方法，培養(yǎng)基改為MRSC固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為厭氧。

1.2.8 菌株保藏

將已經(jīng)充分活化的菌種10 mL在4 200 r／min下離心15 min，棄去上清液，加入深冷保護(hù)劑2 mL，充分混勻，分裝于200 μL離心管，于-20 ℃中保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 長雙歧桿菌BBMN68 耐氧馴化結(jié)果

由圖1可知，傳代初期，隨著傳代次數(shù)的增加，OD600nm值呈現(xiàn)緩慢上升的趨勢，同時pH值不斷下降，說明在這段期間，長雙歧桿菌BBMN68的耐氧能力在穩(wěn)步提高。傳代10 次后，為了進(jìn)一步提高培養(yǎng)環(huán)境中的氧分壓，將培養(yǎng)基更換為MRS。隨著傳代次數(shù)增加，OD600nm值不斷增大，且在傳代第20次時達(dá)到最大值，而此時pH值較低。取傳代第20次的菌株涂布法倒平板，獲得單菌落進(jìn)行革蘭染色和鏡檢，觀察菌體顏色、大小、形狀、分叉形狀等是否符合長雙歧桿菌BBMN68的基本形態(tài)特征。挑取單菌落繼續(xù)馴化至傳代23 次，達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)。

圖1 長雙歧桿菌BBMN68 耐氧馴化結(jié)果

2.2 利用OD600nm篩選耐氧菌株結(jié)果

在整個馴化階段的后期，傳代第20次時，OD600nm達(dá)到最高值而pH值較低，根據(jù)1.2.3所述的方法從傳代20 次的菌液中篩選菌株，試驗數(shù)據(jù)如表1所示。

根據(jù)表1 試驗數(shù)據(jù)中有氧OD600nm/厭氧OD600nm一項，篩選出耐氧能力最好的菌株，即比值最高的3 個菌株（序號分別為28、29和25）進(jìn)行下一步試驗，與原始菌株耐氧能力進(jìn)行比較，結(jié)果見表2。

由表2可以看出，序號為25、28和29的3 個菌株，其有氧OD600nm/厭氧OD600nm一項均比原始菌株高，可知馴化后菌株的耐氧能力比原始菌株有一定的提高，說明通過逐漸增加氧分壓的方法可以提高菌株的耐氧能力，這與李青青的研究結(jié)果一致[4]。通過耐氧馴化得到耐氧能力較強的菌株DBBMN68，即29號菌株。

2.3 耐氧菌株16S rDNA 序列鑒定結(jié)果

利用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，提取乳酸菌DBBMN68的基因組，結(jié)果如圖2所示，所提基因組完整性較好，沒有降解，可以進(jìn)行PCR擴增。以基因組為模板，采用16S rDNA 引物進(jìn)行PCR擴增，得到約1 500 bp的特異性擴增產(chǎn)物。PCR擴增產(chǎn)物純化后委托生工生物技術(shù)公司完成測序，將測序結(jié)果在NCBI 網(wǎng)站上應(yīng)用BLAST 軟件在基因庫中進(jìn)行同源性比對。結(jié)果顯示，馴化菌株DBBMN68的16S rDNA PCR擴增產(chǎn)物的核心序列與長雙歧桿菌BBMN68的基因序列一致，因此鑒定乳酸菌DBBMN68為長雙歧桿菌。

表1 馴化菌株在有氧與厭氧條件下的生長情況

表2 馴化菌株與原始菌株耐氧能力比較

2.4 耐氧菌株耐酸能力測定結(jié)果

圖2 菌株DBBMN68 的基因組DNA 凝膠電泳圖

根據(jù)1.2.5的方法對原始菌株和馴化后菌株的耐酸能力進(jìn)行比較，結(jié)果見圖3。原始菌株BBMN68與馴化菌株DBBMN68在對照組（pH值6.5）的2 h培養(yǎng)過程中活菌數(shù)呈上升趨勢，而在試驗組（pH值3.0）的相同時間培養(yǎng)過程中活菌數(shù)并沒有增長，說明酸性環(huán)境對于長雙歧桿菌BBMN68的生長具有抑制作用。原始菌株與馴化菌株在pH值3.0的酸性環(huán)境中培養(yǎng)2 h后活菌數(shù)沒有顯著性變化，說明馴化菌株維持了良好的耐酸性能。

2.5 耐氧菌株耐膽鹽能力測定結(jié)果

根據(jù)1.2.6的方法對原始菌株和馴化后菌株的耐膽鹽能力進(jìn)行比較，結(jié)果見圖4。原始菌株與馴化菌株在含0%及0.3%膽鹽的培養(yǎng)基中的OD600nm值呈上升趨勢，相比于含0.3%膽鹽的培養(yǎng)條件，0%膽鹽含量的2 菌株生長速度更快；而在含0.5%膽鹽的培養(yǎng)基中的OD600nm值一直沒有顯著變化，說明膽鹽對于長雙歧桿菌BBMN68的生長有抑制作用。

在膽鹽環(huán)境培養(yǎng)12 h過程中，馴化菌株與原始菌株的OD600nm值無顯著性差異，說明耐氧馴化沒有降低長雙歧桿菌對膽鹽的耐受能力。

圖3 耐氧菌株DBBMN68 耐酸性能評價

圖4 耐氧菌株DBBMN68 耐膽鹽性能評價

3 小結(jié)與展望

通過逐漸增加氧分壓的方法進(jìn)行耐氧馴化，得到了1 株氧耐受性加強的長雙歧桿菌，在MRS不充氮氣的厭氧管中可以正常生長。經(jīng)16S rDNA測序，鑒定該菌株仍為長雙歧桿菌BBMN68。耐受性試驗說明馴化菌株的耐酸能力和耐膽鹽能力與原始菌株無顯著差異，即在增加了耐氧能力的同時，仍基本保持了菌株原有的其它方面性能，確定了馴化菌株的穩(wěn)定性，為益生菌BBMN68的廣泛應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

雙歧桿菌屬于專性厭氧菌，這一特性嚴(yán)重限制了其在生產(chǎn)、加工中的應(yīng)用，而耐氧馴化作為針對這一問題的有效解決辦法，具有很好的效果。同時馴化這一適應(yīng)學(xué)原理不僅可以應(yīng)用于耐氧，還可以應(yīng)用于耐膽鹽、耐熱等其它方面，是一種很有應(yīng)用前景的方法。

[1]Zhu J，Zhao L，Guo H Y，et al.Immunomodulatory effects of novel bifidobacterium and lactobacillus strains on murine macrophage cells.African Journal of Microbiology Research，2011，5（1）：8-15.

[2]Yang H Y，Liu S L，Ibrahim S A，et al.Oral administration of live Bifidobacterium substrains isolated from healthy centenarians enhanced immune function in BALB/c mice.Nutrition research，2009，29（4）：281-289.

[3]李平蘭.長壽老人源雙歧桿菌優(yōu)良菌株的篩選及生理功能研究：[博士論文].北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)，2004.

[4]李青青.耐氧性雙歧桿菌的篩選及其生理特性與應(yīng)用研究：[博士論文].杭州：浙江大學(xué)，2010.

[5]桂仕林.利用H2O2對雙歧桿菌進(jìn)行氧適應(yīng)的研究：[博士論文].哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008.

[6]桂仕林，孟祥晨，張久龍.雙歧桿菌的耐氧機制.食品工業(yè)科技，2008，29（7）：280-283.

[7]錢列生，芮漢明.食品微膠囊技術(shù).中山大學(xué)學(xué)報論叢，2007（3）：101.

[8]徐速，徐香玲.耐氧性雙歧桿菌的馴化及其培養(yǎng)條件的研究.食品科技，2007（9）：34-39.

[9]張苓花，于湛，王濱蕾，等.雙歧桿菌厭氧培養(yǎng)方法及耐氧馴化的研究.中國乳品工業(yè)，1996（6）：13-15.

[10]Talwalkar A，Kailasapathy K，Peiris P，et al.Application of RBGR-a simple way of screening of oxygen tolerance in probiotic bacteria.International journal of food microbiology，2001，71（2-3）：245-248.