沉默單?；视椭久竚RNA對肝癌大鼠的作用及機(jī)制

王金龍張俊勇陳懿王曉波1龔建平

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院肝膽外科，重慶400010)

摘要〔〕目的研究沉默單?；视椭久?MAGL)mRNA對大鼠肝癌的作用及其機(jī)制。方法CBRH7919大鼠肝癌細(xì)胞原位移植法建立大鼠肝癌模型，建模后免疫組化檢測肝癌組織及正常肝組織甲胎蛋白(AFP)表達(dá)。分為PBS液組；MAGL-shRNA質(zhì)粒微泡組；空白微泡+超聲輻照組；MAGL-shRNA質(zhì)粒微泡+超聲輻照組(A)；MAGL-shRNA質(zhì)粒微泡+超聲輻照組(B)；MAGL-shRNA質(zhì)粒微泡+超聲輻照組(C)。每只大鼠經(jīng)尾靜脈注射1 ml相應(yīng)試劑，并對空白微泡+超聲輻照組和MAGL-shRNA質(zhì)粒微泡+超聲輻照A、B、C組的大鼠肝區(qū)給予超聲輻照。前4組：免疫印跡檢測大鼠肝癌組織MAGL表達(dá)，熒光定量PCR檢測MAGL mRNA表達(dá)情況,ELISA檢測癌組織游離脂肪酸(FFAs)。解剖并比較各組大鼠的腫瘤大小、轉(zhuǎn)移情況。B組給予高脂飲食1 w后與C組一同處死，比較其腫瘤組織MAGL表達(dá)情況、FFAs含量以及腫瘤大小。結(jié)果腫瘤病理檢測符合原發(fā)性肝癌。前四組：免疫印跡檢測顯示，MAGL-shRNA質(zhì)粒微泡+超聲輻照組A的MAGL蛋白表達(dá)趨勢明顯降低；PCR結(jié)果顯示，該組MAGL-mRNA明顯低于其他3組 (P<0.05)；ELISA顯示該組FFAs含量明顯低于其余各組(P<0.05)；該組腫瘤平均大小及轉(zhuǎn)移率明顯小于其余三組 (P<0.05)。后兩組：高脂飲食組癌組織MAGL蛋白表達(dá)、FFAs濃度明顯高于正常飲食組，且前者腫瘤明顯大于后者(P<0.05)。結(jié)論沉默MAGL mRNA能夠明顯抑制大鼠肝癌生長；高脂飲食能夠逆轉(zhuǎn)MAGL沉默基因的治療作用；MAGL作用機(jī)制可能是通過調(diào)控FFAs及下游因子實現(xiàn)。

關(guān)鍵詞〔〕肝癌；單?；视椭久福怀曃⑴?/p>

中圖分類號〔〕R73〔

基金項目：重慶市衛(wèi)生局重點(diǎn)科研項目(2011-1-123)

通訊作者：龔建平(1961-)，男，博士，教授，主任醫(yī)師，主要從事肝膽外科學(xué)研究。

1重慶市涪陵中心醫(yī)院肝膽外科

第一作者：王金龍(1979-)，男，碩士，主治醫(yī)師，主要從事肝膽外科學(xué)研究。

現(xiàn)階段針對肝細(xì)胞癌的有效治療手段以手術(shù)和索拉菲尼等藥物化療為主。近年來的研究結(jié)果表明脂質(zhì)代謝紊亂、肥胖等與肝細(xì)胞癌的發(fā)生密切相關(guān)〔1～4〕。單?；视椭久?MAGL)作為甘油三酯代謝的關(guān)鍵酶，可能通過調(diào)控游離脂肪酸(FFAs)的生成，并進(jìn)一步影響FFAs的下游代謝產(chǎn)物，在侵襲性腫瘤的生長、侵襲中發(fā)揮重要作用〔5〕。FFAs的幾個代謝產(chǎn)物如前列腺素E2(PGE2)、溶血性磷脂酸(LPA)等已經(jīng)在既往的研究中被證實在肝細(xì)胞癌的進(jìn)展中起重要的促進(jìn)作用〔6～11〕。本文通過超聲微泡靶向轉(zhuǎn)染技術(shù)，在大鼠肝癌組織局部轉(zhuǎn)染MAGL-shRNA，通過抑制大鼠肝癌組織MAGL的表達(dá)，觀察對大鼠肝細(xì)胞癌的生長、浸潤及轉(zhuǎn)移的影響，并初步探討其可能的機(jī)制。

1材料及方法

1.1動物及飼養(yǎng)健康裸小鼠5只，健康SPF級雄性SD大鼠40只，購自重慶醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心并在該中心進(jìn)行飼養(yǎng)。動物使用許可證號:CQLA-2011-2443。實驗遵循《重慶市實驗動物管理辦法》，并已取得重慶醫(yī)科大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2CBRH7919細(xì)胞培養(yǎng)及裸鼠皮下種植及傳代CBRH7919大鼠肝癌細(xì)胞株購自上海生命科學(xué)研究院。培養(yǎng)基采用含10%胎牛血清及青霉素、鏈霉素雙抗的1640培養(yǎng)基，在37℃含5%CO2的恒溫孵箱內(nèi)培養(yǎng)。細(xì)胞懸液接種于裸小鼠肩胛部皮下。待其腫塊長大至直徑約1.0 cm時，麻醉荷瘤裸小鼠完整取出腫塊，取生長旺盛之魚肉樣組織切成小塊接種于另外一只裸小鼠肩胛皮下傳代培養(yǎng)。如此連續(xù)傳代培養(yǎng)3次后，得到生長旺盛的腫瘤組織，取其邊緣生長旺盛的魚肉樣組織切成1 mm3備用〔12～14〕。

1.3SD大鼠移植法原位肝癌模型構(gòu)建在術(shù)前1 d，術(shù)后3 d分別給予地塞米松2 mg肌注，2次/d。使用苯巴比妥腹腔麻醉，常規(guī)消毒皮膚，取腹部正中切口打開腹腔并暴露肝臟。取肝中葉用眼科鑷斜行刺入建立一隧道，將準(zhǔn)備好的瘤塊放入，使用棉簽壓迫止血，關(guān)閉腹腔，完成操作〔14〕。

1.4判斷建模成功麻醉下逐只打開大鼠腹腔觀察成瘤情況，發(fā)現(xiàn)有32只大鼠建模成功，局部有腫瘤生長，顯露的瘤體呈白色，包塊偏硬。處死大鼠,病理檢測符合原發(fā)性肝細(xì)胞癌特征。

1.5試驗用質(zhì)粒制備及攜MAGL-shRNA超聲微泡合成制備好的MAGL-shRNA質(zhì)粒購自美國Santa Cruz公司，使用紫外分光光度計調(diào)整質(zhì)粒的濃度為1 g/L。按照文獻(xiàn)〔15〕的步驟制備超聲微泡并將其與質(zhì)粒DNA進(jìn)行表面連接，將其濃度調(diào)整為0.1 g/L。

1.6治療方法荷瘤大鼠30只隨機(jī)分為6組，PBS液組、MAGL-shRNA質(zhì)粒微泡組(MAGL-shRNA+MB)、空白微泡+超聲輻照組(MB+US)、MAGL-shRNA質(zhì)粒微泡+超聲輻照組A(MAGL-shRNA+MB+US A)、MAGL-shRNA質(zhì)粒微泡+超聲輻照組B(MAGL-shRNA+MB+US B)、MAGL-shRNA質(zhì)粒微泡+超聲輻照組C(MAGL-shRNA+MB+US C)。分別經(jīng)尾靜脈注射入1 ml相應(yīng)試劑?？瞻踪|(zhì)粒微泡+超聲輻照組和MAGL-shRNA質(zhì)粒微泡+超聲輻照組A,B,C注射后立即采用超聲輻照治療：頻率300 kHz，2 W/cm2，輻照時間為10 s，間隔10 s，總時間20 min〔15〕。3 w后處死前4組大鼠，對于MAGL-shRNA+MB+US B，C組則繼續(xù)飼養(yǎng)1 w：MAGL-shRNA+MB+US B改為給予高脂飲食飼養(yǎng)，MAGL-shRNA+MB+US C繼續(xù)給予常規(guī)飲食飼養(yǎng)，1 w后處死進(jìn)行檢測。

1.7檢測指標(biāo)及檢測方法轉(zhuǎn)染后3 w采用斷頸法處死前4組大鼠：(1)認(rèn)真解剖大鼠，比較各組大鼠腫瘤大小及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況。(2)Western印跡檢測腫瘤組織MAGL蛋白的表達(dá)情況。收集大鼠肝癌組織并按照以下步驟進(jìn)行操作：腫瘤組織勻漿蛋白的提??；檢測蛋白濃度；配制分離膠和電泳膠；電泳及轉(zhuǎn)膜；封閉及顯色。(3)Q-PCR檢測腫瘤組織MAGL mRNA表達(dá)情況。首先從收集的大鼠肝癌組織中提取總RNA，按照常規(guī)體系配置反應(yīng)液去基因組。檢測總RNA純度及其完整性無誤，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。最后進(jìn)行定量PCR檢測，并在PCR儀及電腦上完成操作。(4)腫瘤組織病理學(xué)檢查，取出腫瘤組織用4%多聚甲醛溶液固定，石蠟切片；HE染色，觀察腫瘤組織的病理學(xué)分型；免疫2步法測定正常組織及肝癌組織甲胎蛋白(AFP)表達(dá)。(5)ELISA檢測各組大鼠FFAs含量。

對于后2組大鼠，則繼續(xù)飼養(yǎng)1 w處死：取腫瘤組織檢測MAGL在蛋白水平表達(dá)及FFAs濃度，比較2組腫瘤的平均大小，具體方法同上述。

2結(jié)果

2.1大鼠腫瘤病理學(xué)結(jié)果打開大鼠腹腔，可見灰白色腫塊位于大鼠肝臟表面，切開后腫瘤組織呈魚肉樣，其與周圍組織分界不清，無明顯包膜。HE染色后于鏡下觀察可見彌漫排列的腫瘤細(xì)胞，呈浸潤性生長，腫瘤細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，較多核分裂相，胞質(zhì)豐滿，內(nèi)有較多空泡。見圖1。

2.2免疫組化檢測結(jié)果檢查結(jié)果顯示大鼠肝細(xì)胞癌組織AFP表達(dá)明顯較正常肝組織高，其鏡下表現(xiàn)在細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)呈棕黃色或者棕褐色，彌漫分布，如圖2。

2.3Western印跡結(jié)果檢測顯示各組實驗大鼠肝癌組織在33 kD處都顯現(xiàn)特異性條帶；其中前4組比較，MAGL-shRNA+MB+US組A(4組)的MAGL蛋白表達(dá)趨勢明顯弱于其他各組；后兩組比較，高脂飲食組(5組)明顯較常規(guī)飲食組(6組)表達(dá)升高，見圖3。

圖1　大鼠肝癌HE染色鏡檢結(jié)果(×400)

圖2　正常與肝癌組織AFP表達(dá)(DAB)

1:PBS組， 2:MAGL-shRNA+MB組，3:MB+US組，4:MAGL-shRNA+MB+US組A,5:MAGL-shRNA+MB+US組B，6:MAGL-shRNA+MB+US組C 圖3　大鼠肝癌組織MAGL的Western印跡測定結(jié)果

2.4肝癌組織RT-PCR檢測結(jié)果MAGL-shRNA+MB+US組A(4組)較其余3組MAGL mRNA表達(dá)明顯降低(P<0.05)。

2.5癌組織FFAs檢測結(jié)果MAGL-shRNA+MB+US組A較其余三組FFAs濃度明顯降低(P<0.05)；高脂飲食組較常規(guī)飲食組明顯升高(P<0.05)。

2.6腫瘤大小及轉(zhuǎn)移情況MAGL-shRNA+MB+US A組腫塊平均大小(0.35 cm3)及轉(zhuǎn)移率(20%)較其余三組(PBS組0.80 cm3，80%；MAGL-shRNA+MB組0.78 cm3，100%；MB+US組0.82 cm3，80%)均明顯降低(P<0.05)，高脂飲食組腫瘤直徑(1.1 cm)明顯大于正常飲食組(0.6 cm)。

3討論

肝癌以我國的發(fā)病率最高，目前治療方案效果都不夠滿意，亟需在治療手段上取得突破。脂質(zhì)代謝和基因治療是隨著醫(yī)學(xué)的發(fā)展出現(xiàn)的關(guān)于多種腫瘤治療的熱點(diǎn)并且取得了許多重要的進(jìn)展；作為脂代謝的主要器官，目前認(rèn)為肝癌的發(fā)生發(fā)展與脂代謝紊亂有明顯相關(guān)性。那么在肝癌方面，能否通過改變肝癌相關(guān)脂代謝的基因信息來有效治療肝癌成為我們一個亟需解決的問題。

近年來對于MAGL的研究取得了重要進(jìn)展，研究者們發(fā)現(xiàn)作為甘油三酯代謝的一個關(guān)鍵酶不止在正常組織的能量代謝中起重要作用，而且可能在腫瘤組織中作為一個脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)中心通過促進(jìn)FFAs及其下游脂質(zhì)代謝產(chǎn)物的生成，從而促進(jìn)腫瘤的增殖、浸潤和轉(zhuǎn)移，這已經(jīng)在惡性黑色素瘤、乳腺癌、大腸癌等惡性腫瘤的研究中得到了證實〔5〕。本研究結(jié)果表明腫瘤組織FFAs的含量與MAGL呈正相關(guān)，這表明MAGL可能通過調(diào)節(jié)FFAs的生成進(jìn)而影響FFAs的下游代謝產(chǎn)物中腫瘤信號因子的含量，調(diào)控肝癌細(xì)胞的增殖、浸潤及轉(zhuǎn)移。另外高脂飲食的攝入能夠逆轉(zhuǎn)基因沉默的治療效果，而其作用機(jī)制可能與MAGL及FFAs的再次升高有關(guān)。這也表明，高脂飲食有可能會促進(jìn)肝癌的生長，為肝癌患者的飲食治療提供了可能的依據(jù)。

我們在試驗中用到的鼠類移植性肝癌模型，而在此前的試驗中我們采用過化學(xué)誘導(dǎo)建模，在建模成功后我們發(fā)現(xiàn)腫瘤彌散性生長，無法觀察其腫瘤生長情況，我們僅能通過比較腫瘤轉(zhuǎn)移率發(fā)現(xiàn)敲低該基因治療可能有效。因此我們再次采用大鼠肝癌細(xì)胞株原位移植法進(jìn)行建模，建模成功后腫瘤單發(fā)生長且分泌AFP明顯增加，與臨床上肝癌的病理表現(xiàn)近似，是理想的肝癌研究動物模型〔16～21〕。

綜上所述，MAGL通過基因轉(zhuǎn)染并敲低了MAGL在肝癌組織的表達(dá)，腫瘤的生長及轉(zhuǎn)移率均呈明顯下降。這個發(fā)現(xiàn)為肝細(xì)胞癌的治療提供了一個可能的治療靶點(diǎn)。同時我們使用高質(zhì)飲食逆轉(zhuǎn)MAGL基因沉默造成的治療效果以及對于癌組織FFAs測定的結(jié)果也為肝癌患者飲食治療及相關(guān)研究提供了可能的依據(jù)和機(jī)制。我們期待后續(xù)的試驗?zāi)軌蚋M(jìn)一步，為臨床治療肝細(xì)胞癌打開一扇新的大門。

4參考文獻(xiàn)

1World Health Organization.Mortality database.www.who.int/whosis/en.Accessed February,2014.

2Kurosaki M,Hosokawa T,Matsunaga K,etal.Hepatic steatosis in chronic hepatitis C is a significant risk factor for developing hepatocellular carcinoma independent of age,sex,obesity,fibrosis stage and response to interferon therapy〔J〕.Hepatol Res,2010;40(9):870-7.

3Kessler SM,Simon Y,Gemperlein K,etal.Fatty acid elongation in non-alcoholic steatohepatitis and hepatocellular carcinoma〔J〕.Int J Mol Sci,2014;15(4):5762-73.

4Choi J,Corder NL,Koduru B,etal.Oxidative stress and hepatic Nox proteins in chronic hepatitis C and hepatocellular carcinoma〔J〕.Free Radic Biol Med,2014;14(1):191-9.

5Nomura DK,Long JZ,Niessen S,etal.Monoacylglycerol lipase regulates a fatty acid network that promotes cancer pathogenesis〔J〕.Cell,2010;140(1):49-61.

6Skill NJ,Scott RE,Wu J,etal.Hepatocellular carcinoma associated lipid metabolism reprogramming〔J〕.J Surg Res,2011;169(1):51-6.

7Park SY,Jeong KJ,Panupinthu N,etal.Lysophosphatidic acid augments human hepatocellular carcinoma cell invasion through LPA1 receptor and MMP-9 expression〔J〕.Oncogene,2011;30(11):1351-9.

8Bai X,Wang J,Zhang L,etal.Prostaglandin E2receptor EP1-mediated phosphorylation of focal adhesion kinase enhances cell adhesion and migration in hepatocellular carcinoma cells〔J〕.Int J Oncol,2013;42(5):1833-41.

9Geis NA,Katus HA,Bekeredjian R.Microbubbles as a vehicle for gene and drug delivery:current clinical implications and future perspectives〔J〕.Curr Pharm Res,2012;18(15):2166-83.

10Nomikou N,McHale AP.Microbubble-enhanced ultrasound-mediated gene transfer-towards the development of targeted gene therapy for cancer〔J〕.Int J Hyperthermia,2012;28(4):300-10.

11Wirth T,Parker N,Yl?-Herttuala S.History of gene therapy〔J〕.Gene,2013;525(2):162-9.

12Kiessling F,Fokong S,Koczera P,etal.Ultra-sound microbubbles for molecular diagnosis,therapy,and theranostics〔J〕.J Nucl Med,2012;53(3):345-8.

13De Minicis S,Kisseleva T,Francis H,etal.Liver carcinogenesis:rodent models of hepatocarcinoma and cholangiocarcinoma〔J〕.Dig Liver Dis,2013;45(6):450-9.

14Jiang HC,Meng QH,Tan HT,etal.Antiangiogenic therapy enhances the efficacy of transcatheter arterial embolization for hepatocellular carcinomas〔J〕.Int J Cancer,2007;121(2):416-24.

15Jiang ZZ,Xia GY,Zhang Y,etal.Attenuation of hepatic fibrosis through ultrasound-microbubble-mediated HGF gene transfer in rats〔J〕.Clin Imaging,2013;37(1):104-10.

16Zhong XG,He S,Yin W.Selective tropism of liver stem cells to hepatocellular carcinoma in vivo〔J〕.World J Gastroenterol,2007;13(28):3886-91.

17Sun X,Jiang H,Jiang X,etal.Antisense hypoxia-inducible factor-1alpha augments transcatheter arterial embolization in the treatment of hepatocellular carcinomas in rats〔J〕.Hum Gene Ther,2009;20(4):314-24.

18Sun RR,Noble ML,Sun SS,etal.Development of therapeutic microbubbles for enhancing ultrasound-mediated gene delivery〔J〕.J Control Release,2014;182:111-20.

19Alejandro F,Josep ML,Jordi B,etal.Hepatocellular carcinoma〔J〕.Lancet,2012; 379(11):1245-55.

20Samuele DM,Tatiana K,Heather F,etal.Liver carcinogenesis:rodent models of hepatocarcinoma and cholangiocarcinoma〔J〕.Dig Liver Dis,2013;45(6):450-9.

21陳懿，王曉波，張俊勇,等.超聲微泡攜MAGL-shRNA靶向釋放對大鼠肝細(xì)胞肝癌轉(zhuǎn)移作用的實驗研究〔J〕.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2013:35(16)：1709-11.

〔2013-10-17修回〕

(編輯徐杰)