沉默G250基因?qū)δI癌786-0細(xì)胞移植瘤Skp2表達(dá)的影響

趙俊峰肖耀軍1姜耀東2趙善超2楊旭凱3鄭少斌2

(河南省中醫(yī)院河南中醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院泌尿外科，河南鄭州450002)

摘要〔〕目的探討沉默G250基因?qū)δI癌786-0細(xì)胞移植瘤S期激酶相關(guān)蛋白2(Skp2)表達(dá)的影響。方法構(gòu)建靶向G250的siRNA表達(dá)質(zhì)粒pshRNA-G250并轉(zhuǎn)染腎癌786-0細(xì)胞，12只BALB/c裸鼠分為陰性對(duì)照組和干擾成瘤組，干擾成瘤組每只裸鼠皮下接種5×106個(gè)G250基因沉默后的腎癌786-0細(xì)胞(786-0/si-G250-b)，以轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的細(xì)胞(786-0/si-G250-0)為對(duì)照。成瘤3 w后，處死裸鼠后切取瘤塊，采用組織芯片技術(shù)及免疫組化SP法檢測(cè)Skp2的表達(dá)。結(jié)果5×106個(gè)細(xì)胞皮下接種BALB/c裸鼠3 w后均成瘤，Skp2在陰性對(duì)照組和干擾成瘤組裸鼠的腫瘤組織中表達(dá)率分別為83.33%(5/6)和16.67%(1/6)，兩者有顯著性差異(P=0.04)。結(jié)論G250基因表達(dá)沉默抑制了腎癌細(xì)胞移植瘤Skp2的表達(dá)。

關(guān)鍵詞〔〕G250基因；S期激酶相關(guān)蛋白2；腫瘤相關(guān)抗原；RNA干擾；腎細(xì)胞癌；體內(nèi)

中圖分類(lèi)號(hào)〔〕R737.11〔

基金項(xiàng)目：鄭州市科技攻關(guān)項(xiàng)目(No.109TGS486-9)

通訊作者：楊旭凱(1970-),男,副主任醫(yī)師,主要從事腎癌的基礎(chǔ)及臨床研究。

1廣東省武警醫(yī)院泌尿外科

2南方醫(yī)科大學(xué)附屬南方醫(yī)院泌尿外科

3蘭州軍區(qū)總醫(yī)院泌尿外科

第一作者：趙俊峰(1966-)，男，主任醫(yī)師，主要從事腎臟腫瘤的RNA干擾以及臨床方面的研究。

腎癌是老年人常見(jiàn)的惡性腫瘤，其發(fā)生發(fā)展的分子生物學(xué)機(jī)制至今不清，多數(shù)研究顯示G250(又稱(chēng)MN/CAⅨ)基因可誘導(dǎo)細(xì)胞惡性表型〔1〕，并參與了腎臟腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移。也有研究顯示S期激酶相關(guān)蛋白2(Skp2)對(duì)腎臟腫瘤的形成有一定影響〔2〕。本研究在成功構(gòu)建腎癌相關(guān)抗原G250 siRNA表達(dá)載體〔3〕和完成G250基因沉默后裸鼠成瘤體內(nèi)實(shí)驗(yàn)〔4〕的基礎(chǔ)上，利用RNA干擾(RNAi)技術(shù)阻斷G250基因表達(dá)，觀察了G250基因沉默對(duì)腎癌786-0細(xì)胞體內(nèi)成瘤及生長(zhǎng)的影響。

1材料和方法

1.1材料與試劑人腎透明細(xì)胞癌786-0細(xì)胞株(以下稱(chēng)腎癌786-0細(xì)胞)及大腸桿菌(DH5α)由南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院泌尿外科保存。4～6 w的12只BALB/c裸鼠為SPF級(jí)，體重15～20 g，雌雄各半，購(gòu)自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，在南方醫(yī)院SPF實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)。OPTI-MEMⅠ培養(yǎng)基及RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清(GIBCO公司)，lipofectamineTM2000(Invitrogen 公司)，G418及DEPC(Sigma公司)，空質(zhì)粒pRNAT-U6.1/Neo (GenScript公司)，限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、Hind Ⅲ、KpnⅠ、T4 DNA連接酶、T4磷酸化酶、質(zhì)粒提取試劑盒、磷酸鹽緩沖液(PBS)(Promega公司)、鼠抗人Skp2 mAb、SP試劑盒及二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色劑(中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.2方法

1.2.1siRNA靶序列的設(shè)計(jì)和質(zhì)粒的構(gòu)建G250 mRNA的全長(zhǎng)序列從NCBI基因庫(kù)(Genebank登錄號(hào):AJ010588)檢索得出。應(yīng)用Primer express軟件按照siRNA的設(shè)計(jì)原則尋找含21個(gè)堿基的特異性序列。在前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇最有效的G250的siRNA片段，靶位點(diǎn)293～313，根據(jù)pRNAT-U6.1/Neo質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)，設(shè)計(jì)出特異性干擾片段的核苷酸序列：5′-GGATCCCATTTAGGCTTAACTTCAGGTATTGATATCCGTACCTGAAGTT AAGCCTAAATTTTTTTCCAAAAGCTT-3′，5′-AAGCTTTTGGAAA AAAATTTAGGCTTAACTTCAGGTACGGATATCAATACCTGAAGT TAAGCCTAAATGGGATCC-3′。序列送由南京金思特公司合成。將退火后shRNA寡核酸雙鏈和pRNAT-U6.1/Neo酶切產(chǎn)物按3∶1混合，T4DNA連接酶27℃連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α。然后提取待測(cè)的重組質(zhì)粒。酶切鑒定正確后取1 ml轉(zhuǎn)化菌液，送金思特公司測(cè)序。

1.2.2siRNA轉(zhuǎn)染及建立穩(wěn)定干擾G250基因抗性單克隆腎癌786-0細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的RPMI1640。轉(zhuǎn)染前24 h，傳代至24孔板，每孔1.5×105個(gè)細(xì)胞。用LipofectamineTM2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后6 h換成完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)72 h，加入選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，根據(jù)G418對(duì)腎癌786-0細(xì)胞在14 d內(nèi)的殺滅效果，選擇600 μg/ml作為篩選濃度。篩選培養(yǎng)2 w后可見(jiàn)抗性克隆長(zhǎng)出，挑取單克隆轉(zhuǎn)入24孔板逐漸擴(kuò)大培養(yǎng)，4 w左右可獲得穩(wěn)定干擾抗性單克隆。

1.2.3實(shí)驗(yàn)分組和建立腫瘤動(dòng)物模型將皮下注射轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的腎癌細(xì)胞的(786-0/si-G250-0)裸鼠作為對(duì)照組，轉(zhuǎn)染RNA干擾片斷細(xì)胞(786-0/si-G250-b)的為實(shí)驗(yàn)組，每組6只。對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的786-0/si-G250-0和786-0/si-G250-b細(xì)胞經(jīng)胰酶消化，離心收集，計(jì)數(shù)后分別重懸于無(wú)血清RPMI 1640培養(yǎng)基中，配制成每0.1 ml含5×106個(gè)腫瘤細(xì)胞的懸液，用1 ml注射器將0.1 ml細(xì)胞懸液皮下注射于BALB/c裸鼠背部皮下，每一個(gè)部位注射5×106個(gè)細(xì)胞的懸液。

1.2.4腫瘤生長(zhǎng)情況監(jiān)測(cè)自腫瘤細(xì)胞注射第10日起，每天觀察裸鼠成瘤情況，待腫瘤出現(xiàn)后每3 d用毫米游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)、寬、高最大垂直直徑(mm)，分別以a、b、c表示，依據(jù)腫瘤體積計(jì)算公式：V(mm3)=a×b×c/2〔5〕。在成瘤后的第3周處死裸鼠，切取腫瘤組織備用。

1.2.5組織芯片的制作

1.2.5.1制作組織蠟塊切取腫瘤組織，約1.0 cm×1.0 cm×0.5 cm。用10%中性甲醛固定，常規(guī)脫水石蠟包埋。對(duì)所有標(biāo)本組織蠟塊常規(guī)切片、蘇木素-伊紅HE染色并作形態(tài)學(xué)觀察，選擇有代表性的腫瘤區(qū)域，在相應(yīng)位置進(jìn)行標(biāo)記。

1.2.5.2制作包含120個(gè)點(diǎn)的組織芯片使用組織微陣列儀(MTA-1)制作受體空白蠟塊。大小2.0 cm×2.0 cm×1.0 cm，設(shè)計(jì)12×10點(diǎn)組織陣列。每個(gè)微陣列蠟塊包含120個(gè)標(biāo)本。根據(jù)各標(biāo)本HE染色切片標(biāo)記的部位。用直徑為0.6 mm的供體針在蠟塊相應(yīng)部位取樣。每例標(biāo)本選定2個(gè)不同取樣位點(diǎn)，將供體組織芯放入受體蠟塊，組織芯間距0.4 mm。在組織樣本填入蠟孔時(shí)記錄每個(gè)樣本在二維陣列中的具體位置。并在一定位置上標(biāo)記出組織微陣列的方位。置入烤箱低溫烘烤約1 h，封蠟，冷卻，制成兩個(gè)組織微陣列蠟塊。再以4 μm厚切片，裱于載玻片，制成組織芯片備用。

1.2.6免疫組化檢測(cè)SP免疫組化染色方法嚴(yán)格按SP試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。DAB溶液顯色。用已知乳腺癌標(biāo)本作陽(yáng)性對(duì)照，用TBS代替一抗作陰性對(duì)照。

1.2.7結(jié)果判定參考Langner等〔6〕的經(jīng)驗(yàn)制定判定標(biāo)準(zhǔn)：Skp2在胞核或胞核胞質(zhì)中均表達(dá)為陽(yáng)性，僅在胞質(zhì)中表達(dá)為陰性。隨機(jī)取5個(gè)高倍視野，計(jì)算每個(gè)高倍視野中陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占腫瘤細(xì)胞總數(shù)的百分比，最后計(jì)算5個(gè)高倍視野的平均百分比。Skp2陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<10%為陰性(-)，>10%為陽(yáng)性(+)。結(jié)果判定由兩人共同完成，取二者平均值。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)及方差分析。

2結(jié)果

2.1G250基因表達(dá)沉默對(duì)腎癌786-0細(xì)胞體內(nèi)成瘤的影響將786-0/si-G250-0和786-0/si-G250-b細(xì)胞接種6只裸鼠均成瘤，成瘤率分別為100%。實(shí)驗(yàn)組的成瘤時(shí)間(15±2.4)d較對(duì)照組延長(zhǎng)〔(11±1.5)d〕(t=3.381，P=0.007)，說(shuō)明G250基因表達(dá)水平降低后腎癌786-0細(xì)胞在動(dòng)物體內(nèi)的成瘤能力受到抑制。

2.2兩組腎細(xì)胞癌組織中Skp2的表達(dá)成瘤3 w后，處死裸鼠，切取腫塊用組織芯片技術(shù)及免疫組化SP法檢測(cè)Skp2的表達(dá)，Skp2主要在細(xì)胞核中表達(dá)，在細(xì)胞質(zhì)中也有部分表達(dá)。陽(yáng)性染色呈現(xiàn)粗大棕黃色顆粒，見(jiàn)圖1。Skp2在對(duì)照和實(shí)驗(yàn)組裸鼠的腫瘤組織中表達(dá)率分別為83.33%(5/6)和16.67%(1/6)差異顯著(P=0.04)。

實(shí)驗(yàn)組

對(duì)照組

圖1兩組裸鼠腫瘤組織中Skp2表達(dá)(DAB，×400)3討論

腎腫瘤是泌尿系最常見(jiàn)的惡性腫瘤，死亡率高〔7〕。2013年美國(guó)統(tǒng)計(jì)新發(fā)腎腫瘤占所有新發(fā)實(shí)體腫瘤的3%〔8〕。腎癌的發(fā)生發(fā)展與多種癌基因及抑癌基因的異常激活、表達(dá)有關(guān)。G250基因表達(dá)在腎透明細(xì)胞癌發(fā)病中的作用尚不明確，研究顯示G250基因可能是一種癌基因，而且對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移有促進(jìn)作用〔9〕。為進(jìn)一步了解該基因在腎癌發(fā)生、發(fā)展中的作用，在成功設(shè)計(jì)構(gòu)建、篩選及鑒定G250基因有效siRNA干擾序列基礎(chǔ)上，通過(guò)人工誘導(dǎo)RNA干擾(RNAi)技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對(duì)G250基因持續(xù)穩(wěn)定的抑制，觀察到G250基因表達(dá)沉默后，腎癌786-0細(xì)胞成瘤時(shí)間較對(duì)照組明顯延長(zhǎng)，同一時(shí)期腫瘤體積較對(duì)照組明顯減小，說(shuō)明G250基因沉默能有效抑制腎癌786-0細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤的生長(zhǎng)，不僅進(jìn)一步證實(shí)G250基因在促進(jìn)細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)化方面有重要的作用〔10〕，也提示該基因的作用可能比目前了解的要多，需要進(jìn)一步探討。

惡性腫瘤的發(fā)生也與細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制出現(xiàn)紊亂從而導(dǎo)致細(xì)胞的失控性生長(zhǎng)有關(guān)。而細(xì)胞周期主要由正負(fù)調(diào)控因子調(diào)控。其中細(xì)胞周期負(fù)性調(diào)控因子能夠抑制多種G1期cyclin-CDK激酶活性，使細(xì)胞不能通過(guò)G1期，從而防止細(xì)胞過(guò)度增殖形成腫瘤，其缺失與腫瘤的發(fā)生及發(fā)展有關(guān)。Skp2是一種泛素-蛋白酶體途徑的底物識(shí)別序列。能特異作用于磷酸化的細(xì)胞周期負(fù)性調(diào)控因子，可使其通過(guò)泛素-蛋白酶體途徑降解〔2〕。本研究提示在腎細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，Skp2的高表達(dá)可能提示細(xì)胞周期負(fù)性調(diào)控因子的降解減少，這時(shí)細(xì)胞異常增殖不能得到有效抑制〔11〕，從而促進(jìn)了腎細(xì)胞癌的發(fā)生和發(fā)展。因此，Skp2蛋白表達(dá)水平對(duì)判斷腎細(xì)胞癌的發(fā)展和預(yù)后也可能具有重要意義。

由于觀察到G250基因表達(dá)沉默后，體內(nèi)腫瘤細(xì)胞成瘤能力明顯下降，造成腫瘤生長(zhǎng)速度減慢，說(shuō)明本文設(shè)計(jì)的小分子干擾RNA在體內(nèi)穩(wěn)定的發(fā)揮了作用，導(dǎo)致G250基因沉默，同時(shí)Skp2也出現(xiàn)表達(dá)降低，不僅證實(shí)了siRNA技術(shù)的持久、高度特異和高效的抑制靶基因表達(dá)的優(yōu)勢(shì)〔12〕，也提示G250和Skp2在腎腫瘤的發(fā)生發(fā)展中可能有更多的作用。

4參考文獻(xiàn)

1Li G，F(xiàn)eng G，Gentil-Perret A，etal.CA9 gene expression in conventional renal cell carcinoma:a potential marker for prediction of early metastasis after nephrectomy〔J〕.Clin Exp Metastasis，2007；24(3):149-55.

2Langner C，von Wasielewski R，Ratschek M，etal.Biological significance of p27 and Skp2 expresion in renal cell carcinoma〔J〕.Virchows Arch，2004;445(6):631-6.

3趙俊峰，鄭少斌，姜耀東，等.G250基因siRNA表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定〔J〕.山東醫(yī)藥，2008;48(6):23-5.

4趙俊峰，鄭少斌，姜耀東，等.沉默G250基因?qū)δI癌786-0細(xì)胞體內(nèi)成瘤及生長(zhǎng)的影響〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志，2012;32(19):3775-7.

5Agrawal N，Dasaradhi PV，Mohmmed A，etal.RNA interference: biology，mechanism，and applications〔J〕.Microbiol Mol Biol Rev，2003;67(4):657-85.

6Langner C，von Wasielewski K，Ratschek M，etal.Expression of p27 and its ubiquitin ligase subunit Skp2 in upper urinary tract transitional cell carcinoma〔J〕.Urology，2004;64(3):611-6.

7Mulders P，F(xiàn)iglin R，deKernion JB，etal.Renal cell carcinoma: recent progress and future directions〔J〕.Cancer Res，1997;57(22):5189-95.

8Siegel R，Ma J，Zou Z，etal.Cancer statistics，2014〔J〕.CA Cancer J Clin，2014;64(1):9-29.

9Ivanov S，Liao SY，Ivanova A，etal.Expression of hypoxia-inducible cell-surface transmem-brane carbonic anhydrases in human cancer〔J〕.Am J Pathol.2001;158(3):905-19.

10Zavada J，Zavadova Z，Pastorek J，etal.Human tumor-associated cell adhension protein MN/CA IX:identification of M75 eptope and of the region mediating cell adhension〔J〕.Br J Cancer，2000;82(11):1808-13.

11Sui L，Dong Y，Watanabe Y，etal.Clinical significance of skp2 expression，alone and combined with Jab l and p27 in epithelial ovarian tumors〔J〕.Oncol Rep，2006;15(4):765-71.

12Wullner U，Neef I，Tur MK，etal.Targeted delivery of short interfering RNAs-strategies for in vivo delivery〔J〕.Recent Pat Anticancer Drug Discov，2009;4(1):1-8.

〔2013-11-15修回〕

(編輯袁左鳴)