叔丁基過氧化氫體外誘導人腎小球系膜細胞的衰老

周紅麗魏琳琳

(遼寧醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院，遼寧錦州121000)

摘要〔〕目的通過觀察不同濃度叔丁基過氧化氫(t-BHP)作用不同時間后對人腎小球系膜細胞(HGMC)衰老指標的影響，探討t-BHP在HGMC衰老過程中的作用。方法應用10、30、50、100 μmol/L tBHP刺激細胞，每天刺激1 h，連續(xù)5 d，刺激結束后48 h檢測細胞增殖情況、衰老相關β半乳糖苷酶(SA β-gal)染色陽性細胞百分率、細胞周期變化及細胞形態(tài)改變確定t-BHP誘導HGMC衰老的最佳濃度。結果30 μmol/L tBHP刺激HGMC，每天1 h連續(xù)作用5次后可抑制HGMC增殖，且84%的HGMC SAβ-gal染色陽性，90%HGMC進入G0～G1期；光鏡表現(xiàn)細胞體積增大、胞體扁平、胞質顆粒增多；電鏡下細胞核膜內陷，染色質凝集、邊集，細胞質空泡增多，出現(xiàn)髓樣溶酶體。結論30 μmol/L tBHP刺激HGMC后每天1 h連續(xù)作用5次，可作為誘導HGMC發(fā)生衰老的刺激因素。

關鍵詞〔〕叔丁基過氧化氫(t-BHp)；腎小球系膜細胞

中圖分類號〔〕R692.3〔

基金項目：遼寧省自然科學

第一作者：周紅麗(1977-),女，博士，副教授，副主任醫(yī)師，碩士生導師，主要從事腎小球疾病分子機制研究。

腎臟是人體器官和系統(tǒng)中衰老最明顯的器官。目前關于腎臟衰老的機制尚不十分明確。衰老腎臟的改變主要是由于腎小球系膜細胞(GMC)的衰老引起的。GMC表型和功能的改變在腎臟衰老進程中發(fā)揮著重要的作用。目前研究表明叔丁基過氧化氫(tBHP)可促進細胞衰老〔1～3〕，但對人GMC(HGMC)衰老的研究報道甚少。衰老的細胞喪失增殖能力，細胞周期不可逆地阻滯于G0～G1期，喪失了對有絲分裂原的反應能力，不能進行DNA合成，不能進入S期，β半乳糖苷酶(SAβ-gal)活性增高〔4〕。本研究旨在探討t-BHP在HGMC衰老過程中的作用。

1材料與方法

1.1細胞系HGMC系購于美國Sciencell公司。

1.2主要藥品和試劑HGMC培養(yǎng)基(美國Sciencell公司)，SAβ-gal半乳糖苷酶染色試劑盒(上海杰美基因有限公司)，四甲基偶氮唑藍、叔丁基過氧化氫(美國Sigma公司)，胎牛血清、RPMI-1640(美國Gibco公司)，PI(上海晶美生物公司)。

1.3HGMC的傳代培養(yǎng)HGMC貼壁生長于含2%胎牛血清的專用HGMC培養(yǎng)液中，在5%CO2、37 ℃和完全飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3 d換液1次。用0.25%胰蛋白酶進行消化、傳代。取5～8代細胞用于實驗。

1.4tBHP誘導HGMC衰老濃度的確定①衰老組：10、30、50、100 μmol/L tBHP刺激細胞，每天刺激1 h，連續(xù)5 d，刺激結束后48 h進行指標檢測。②對照組：細胞在不含tBHP的HGMC培養(yǎng)液中培養(yǎng)。

1.5MTT法檢測細胞增殖情況取密度為103個/孔的GMC接種于96孔板中，待細胞貼壁后，換無血清培養(yǎng)基使細胞同步化12 h。對照組(6孔)每孔加入100 μl培養(yǎng)液，實驗組(6孔)每孔加入含不同濃度tBHP(10，30，50，100 μmol/L)培養(yǎng)液100 μl刺激1 h，PBS液清洗2次后，換完全培養(yǎng)基。連續(xù)作用5次，作用結束后恢復48 h。于最后4 h加入5 mg/ml的MTT 10 μl/孔，放入培養(yǎng)箱中4 h。最后加DMSO 150 μl/孔裂解細胞，震蕩10 min后酶標儀570 nm波長檢測，結果用吸光度值表示。以實驗組與對照組光吸收值的百分比代表存活細胞百分數(shù)。

1.6流式細胞儀檢測細胞周期用0.25%的胰蛋白酶消化制成單細胞懸液。800 r/min離心5 min，棄去培養(yǎng)液，PBS液清洗2次。加入70%冷乙醇4 ℃固定過夜，離心去乙醇。PBS液清洗2次后，懸浮于0.5 ml PBS中，分別加入RnaseP 14 ℃避光顯色30 min，上流式細胞儀對細胞周期進行檢測及分析。

1.7細胞衰老SAβ-gal染色PBS液清洗細胞一次，按細胞衰老染色試劑盒說明書進行操作，染色后37℃無CO2培養(yǎng)3～12 h，細胞出現(xiàn)藍綠色沉淀。衰老的細胞染色后呈藍綠色，鏡下隨機選取6個視野分別計數(shù)衰老細胞數(shù)和總細胞數(shù)，計算SAβ-gal陽性細胞的百分率。

1.8倒置顯微鏡及透射電鏡下觀察細胞形態(tài)及超微結構改變細胞PBS液清洗2次后，置于倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)改變。0.25%胰酶消化后收集細胞，用4 ℃預冷的PBS(pH7.4)離心洗細胞2次，棄上清液，加入4 ℃預冷的2.5%戊二醛固定4 h以上，PBS液漂洗3次，每次10 min，1%鋨酸4 ℃后固定2 h，漂洗3次。室溫下用乙醇、丙酮逐級脫水，環(huán)氧樹脂618浸透、包埋。超薄切片用醋酸鈾、枸櫞酸鉛雙染色各10 min，透射電鏡觀察細胞超微結構改變。

1.9統(tǒng)計學處理采用SPSS13.0軟件進行單因素方差分析。

2結果

2.1細胞增殖情況30 μmol/L tBHP作用后，存活的細胞數(shù)為對照組的(80.12±3.25)%(P<0.05)，10 μmol/L組細胞存活率與對照組相比無顯著性差異。50 μmol/L和100 μmol/L t-BHP組細胞存活明顯下降，分別為對照組的(51.34±4.12)%，(49.56±3.45)%(P<0.01)。故本實驗選擇30 μmol/L tBHP誘導細胞衰老。

2.2SAβ-gal染色結果10、30、50 μmol/L tBHP每天1 h連續(xù)作用5次后，SAβ-gal陽性率分別為(25.22±1.23)%、(84.52±5.86)%、(90.30±6.25)%。30 μmol/L tBHP作用后，80%以上的細胞為SAβ-gal染色陽性，與對照組存在顯著差異〔(23.03±0.91)%，P<0.01〕。而50 μmol/L tBHP作用后SAβ-gal染色陽性率達90%，但大部分細胞發(fā)生死亡(圖1)。

2.3細胞周期檢測10、30、50 μmol/L tBHP作用后G0～G1期細胞比例分別為(72.33±3.83)%，(90.01±5.62)%，(95.32±6.03)%；30 μmol/L tBHP作用后80%以上的細胞進入G0～G1期，與對照組存在顯著差異〔(68.82±4.13)%,P<0.05〕。50 μmol/L tBHP雖然80%以上的細胞也進入G0～G1期，但凋亡的細胞及細胞碎屑增多。

2.4衰老HGMC光鏡及電鏡超微結構改變正常HGMC光鏡下呈單核、梭形生長，細胞排列規(guī)則；電鏡下細胞核膜平整、光滑，染色質分布均勻。30 μmol/L tBHP誘導的衰老HGMC光鏡下體積增大、胞體扁平、胞質顆粒增多；電鏡下細胞核膜內陷，染色質凝集、邊集，細胞質空泡增多，出現(xiàn)髓樣溶酶體。見圖2，圖3。

對照組

10 μmol/L tBHP組

30 μmol/L tBHP組

50 μmol/L tBHP組

圖1不同濃度tBHP作用后SAβ-gal染色結果(×200)

圖2　細胞光鏡表現(xiàn)(×200)

圖3　電鏡超微結構改變(×6 000)

3討論

在腎臟的衰老過程中，可出現(xiàn)各種形態(tài)、結構和功能上的變化，從而在臨床上出現(xiàn)腎功能減退，腎儲備能力下降及對應激的耐受能力降低等改變。目前尚無國際公認的GMC衰老模型，氧化應激是衰老的主要決定因素，活性氧在衰老相關大鼠腎變化中起重要作用，抗氧化治療能防止衰老大鼠相關腎臟形態(tài)和功能改變。過氧化氫作為促進細胞衰老的刺激因素已在許多細胞上得到了證實，用過氧化氫或tBHP處理的成纖維細胞、臍靜脈血管內皮細胞表現(xiàn)為細胞周期抑制、SAβ-gal染色陽性率增高等衰老表型〔5〕。本研究證實，應用tBHP作為刺激因素，可以誘導HGMC發(fā)生衰老，為臨床進一步研究防治腎臟衰老提供新思路。

4參考文獻

1Dumont P,Burton M,Chen QM,etal.Induction of replicative senescence biomarkers by sublethal oxidative stresses in normal human fibroblast〔J〕.Free Radical Biol Med,2000;28(3):361-73.

2Unterluggauer H,Hampel B,Zwerschke W.Senescence-associated cell death of human endothelial cells:the role of oxidative stress〔J〕.Exp Gerontol,2003;38(10):1149-60.

3Chen QM,Liu J,Merrett JB,etal.Apoptosis or senescence-like growth arrest:influence of cell-cycle position，p53，p21 and bax in H2O2response of normal human fibroblasts〔J〕.Biochem J,2000;347(pt2):543-51.

4Debacq CF,Erusalimsky JD,Campisi J,etal.Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase(SA-beta gal)activity,a biomarker of senescent cells in culture and in vivo〔J〕.Nat Protoc,2009;4(12):1798-806.

5Spitelle G.Peroxidation of linoleic acid and its relation to aging and age dependent diseases〔J〕.Mech Ageing Dev,2001;122(7):617-57.

〔2013-07-13修回〕

(編輯趙慧玲)