丹紅注射液對(duì)阿霉素大鼠心肌損傷的保護(hù)作用

彭小平陳璿瑛1李文娟2王夢(mèng)洪鄭澤琪

(南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科，江西南昌330006)

摘要〔〕目的探討丹紅注射液(DH)對(duì)阿霉素(ADR)所致大鼠心肌損傷的影響及作用機(jī)制。方法腹腔注射ADR建立大鼠心肌損傷模型，隨機(jī)分為對(duì)照組、DH組、ADR組、DH+ADR組，各10只。觀察大鼠生理狀況，比色法測(cè)定乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)及超氧化物歧化酶(SOD)的活性及丙二醛(MDA)的含量，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞線粒體膜電位。結(jié)果與ADR組相比，DH預(yù)處理能顯著改善ADR所致的體重下降，降低LDH、CK的活性和MDA的含量，增強(qiáng)SOD、CAT和GSH-Px的活性。線粒體膜電位數(shù)據(jù)顯示，與ADR組相比，DH顯著增加心肌細(xì)胞線粒體膜電位。結(jié)論DH對(duì)ADR所致大鼠心肌損傷具有顯著的保護(hù)作用，其保護(hù)作用與降低心肌氧化應(yīng)激，提高抗氧化防御和穩(wěn)定線粒體膜電位有關(guān)。

關(guān)鍵詞〔〕丹紅注射液；心肌損傷；氧化應(yīng)激；阿霉素

中圖分類號(hào)〔〕R544.1〔

基金項(xiàng)目：江西省衛(wèi)生廳課題(No.20081026);南昌大學(xué)校基金(2009)

1南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科

2南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

第一作者：彭小平(1975-)，男，副教授，在職博士，副主任醫(yī)師，主要從事冠心病治療研究。

臨床發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期使用阿霉素(ADR)可產(chǎn)生嚴(yán)重的心臟毒性。因此，研究ADR所致心肌損傷的作用機(jī)制及尋找有效的防治措施，已成為當(dāng)今醫(yī)學(xué)界迫在眉睫的問題〔1，2〕。 研究表明ADR所致心臟毒性機(jī)制頗為復(fù)雜，目前較為深入并被廣泛認(rèn)可的作用機(jī)制是ADR過量產(chǎn)生自由基導(dǎo)致心肌損傷。ADR進(jìn)入心肌細(xì)胞后，在微粒體中經(jīng)過還原型輔酶Ⅱ(NADPH)及細(xì)胞色素P450還原酶催化并提供一個(gè)電子變?yōu)閹б粋€(gè)剩余電子的半醌自由基，經(jīng)過一系列的電子傳遞，進(jìn)而形成氧化應(yīng)激，最后導(dǎo)致了組織的損傷〔3，4〕。研究證實(shí)丹紅注射液(DH)具有抑制氧化應(yīng)激和提高機(jī)體抗氧化防御能力，且對(duì)缺血性心肌損傷有保護(hù)作用，但對(duì)抗腫瘤ADR引起心肌損傷的影響尚不清楚〔5，6〕。本研究探討DH對(duì)阿霉素所致大鼠心肌損傷的保護(hù)作用及機(jī)制。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和試劑健康SD大鼠40只，體重(200±20) g，由南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部提供〔許可證號(hào)：SCXK(贛)2006-2001〕。DH 購自菏澤步長(zhǎng)制藥有限公司。ADR由深圳萬樂藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。過氧化氫酶(CAT)試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒。細(xì)胞乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒、肌酸激酶(CK)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所；羅丹明123(Rho 123)購自美國Molecular Probes公司。本研究中其余化學(xué)試劑均為分析純產(chǎn)品。

1.2儀器設(shè)備流式細(xì)胞分析系統(tǒng)(Beckman Coulter公司，美國)；移液器(Eppendorf公司 德國)；紫外分光光度計(jì)(中國北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；離心機(jī)(中國上海安亭科學(xué)儀器廠)；超純水凈化系統(tǒng)(Millipore公司，美國)；電子天平(中國上海梅特勒-托利多儀器有限公司)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法采用隨機(jī)平行同期對(duì)照的方法，建立大鼠ADR心肌損傷模型，40只大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、DH組、ADR組、DH+ADR組，各10只。對(duì)照組：連續(xù)8 d腹腔注射生理鹽水0.2 ml；DH組：連續(xù)7 d腹腔注射DH 0.2 ml，第8天腹腔注射等體積的生理鹽水；ADR組連續(xù)7 d腹腔注射生理鹽水0.2 ml，第8天腹腔注射等體積的ADR 20 mg/kg；DH+ADR組：連續(xù)7 d腹腔注射DH 0.2 ml，第8天腹腔注射等體積的ADR 20 mg/kg。所有的動(dòng)物飼養(yǎng)于環(huán)境溫度(20±2)℃，濕度(50±10)%，按照12 h光照/12 h黑暗，自由取食，并且于第14天處理大鼠〔7〕。

1.4實(shí)驗(yàn)樣本的收集大鼠稱重，固定大鼠，摘取眼球取血，制備血清。采血后脫臼處死，迅速開胸取出心臟，稱重，分離部分心臟，用于生化分析。

1.5檢測(cè)指標(biāo)與方法

1.5.1小鼠癥狀與體征觀察大鼠的精神狀況、飲食、體表和體重等。

1.5.2心肌組織中LDH和CK活性的測(cè)定稱取部分心肌組織加預(yù)冷的生理鹽水，制備5%的心肌組織勻漿。將組織樣品在冰浴下剪碎，保持低溫環(huán)境使用組織粉碎機(jī)分3次粉碎組織，20 s/次，并用預(yù)冷的生理鹽水沖洗粉碎機(jī)的攪拌器，盡可能減少組織損耗；然后用超聲波組織細(xì)胞粉碎機(jī)再進(jìn)行2次粉碎，8 s/次；最后按比例補(bǔ)充預(yù)冷的生理鹽水，4℃離心5 min，吸取上清得終濃度5%的組織勻漿。使用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定組織勻漿中的蛋白含量。使用LDH和CK試劑盒，并參照說明書方法測(cè)定并換算LDH、CK的活力(U/mg)。

1.5.3心肌組織中SOD、GSH-Px、CAT活性和MDA含量的測(cè)定按照以上方法，將組織勻漿，離心，收集上清，最終制備5%的組織勻漿，測(cè)定蛋白質(zhì)的含量。使用SOD、GSH-Px、CAT和MDA試劑盒，參照說明書檢測(cè)組織勻漿并換算其SOD、GSH-Px、CAT活性和MDA含量。

1.5.4細(xì)胞線粒體膜電位(△Ψm)的檢測(cè)分離心肌組織，剪碎，胰酶消化，含血清的完全培養(yǎng)基終止消化，離心5 min制備并收集心肌細(xì)胞。100 μl PBS重懸細(xì)胞，加入0.5 mg/ml羅丹明123母液5 μl，37℃孵育30 min，離心5 min，棄上清，500 μl PBS洗2次后重懸細(xì)胞，避光，立即應(yīng)用流式細(xì)胞分析系統(tǒng)進(jìn)行定量檢測(cè)。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2結(jié)果

2.1大鼠的生理狀況在進(jìn)行ADR腹腔注射前，對(duì)照組、DH組、ADR組、DH+ADR組中大鼠攝食、活動(dòng)、糞便等一般情況良好，皮毛光滑。各組間體重?zé)o顯著差異。開始給予ADR 5 d后，發(fā)現(xiàn)ADR組中大鼠均出現(xiàn)不同程度的脫毛、腹瀉的狀況，大鼠進(jìn)食進(jìn)水量大量減少，然而與DH預(yù)處理組相比，體重顯著增加(P<0.01)。表明，DH對(duì)ADR引起的生理狀況變化具有保護(hù)作用。見圖1。

2.2大鼠心肌組織中LDH和CK的變化大鼠經(jīng)ADR處理后，其LDH、CK活性明顯增加，大鼠經(jīng)DH預(yù)處理組的LDH、CK活性明顯減低。表明DH對(duì)ADR引起的心肌細(xì)胞損傷有很強(qiáng)的保護(hù)作用。見表1。

2.3大鼠心肌組織中MDA含量的變化與對(duì)照組相比，ADR處理組心肌細(xì)胞內(nèi)的MDA 含量顯著增高。DH預(yù)處理大鼠后，細(xì)胞內(nèi)MDA的含量顯著降低。表明DH預(yù)處理抑制ADR引起的氧化應(yīng)激。見表1。

與對(duì)照組比較：1)P<0.01；與ADR組比較：2)P<0.01 圖1　DH對(duì)ADR處理大鼠體重的影響

表1DH對(duì)ADR處理大鼠心肌組織中各項(xiàng)指標(biāo)的影響

指標(biāo)對(duì)照組DH組ADR組DH+ADR組LDH(U/mg)43.51±2.1543.37±2.4289.19±5.251)54.56±3.171)3)CK(U/mg)3.57±0.623.28±0.316.07±0.791)3.23±0.351)3)MDA(nmol/mg)11.01±1.0610.87±0.9220.17±1.561)14.78±1.111)2)SOD(U/mg)117.78±6.87109.99±6.2550.68±4.231)83.79±7.121)2)CAT(U/mg)131.07±7.99129.82±8.1039.78±4.641)76.09±6.691)2)GSH-Px(U/mg)353.78±20.31360.37±19.16134.78±6.891)291.78±11.151)2)Δψm381.78±16.89372.86±17.41173.13±7.361)298.87±11.621)2)

與對(duì)照組比較：1)P<0.01；與ADR組比較：2)P<0.05，3)P<0.01

2.4大鼠心肌組織中SOD、CAT和GSH-Px活性的變化與對(duì)照組相比，模型組中SOD、CAT和GSH-Px的活性顯著降低。DH預(yù)處理組與模型組相比，各酶活性均有升高，SOD、CAT和GSH-Px的活性顯著增加。表明DH能增強(qiáng)ADR處理大鼠的心肌抗氧化能力。見表1。

2.5大鼠心肌組織中△Ψm的變化模型組線粒體膜電位△Ψm顯著下降，而DH+ADR組中△Ψm顯著增加。表明DH減輕ADR引起的心肌損傷，與其保護(hù)△Ψm有關(guān)，見表1。

3討論

自由基是人體正常的代謝產(chǎn)物，正常情況下機(jī)體內(nèi)的自由基是處于不斷產(chǎn)生與消除的動(dòng)態(tài)平衡中。過量產(chǎn)生氧自由基所導(dǎo)致的氧化損傷是ADR引起心臟毒性的主要原因，而線粒體呼吸鏈又是自由基產(chǎn)生的主要部位，故其本身易成為自由基損傷的主要靶點(diǎn)〔8〕。本研究采用急性ADR心肌損傷大鼠模型，考察了DH對(duì)ADR心肌損傷的影響，進(jìn)一步研究其對(duì)氧化損傷和線粒體的保護(hù)作用〔9〕。

SOD、CAT、GSH-Px 是機(jī)體內(nèi)清除氧自由基的重要抗氧化酶，兩者活力的高低分別反映了機(jī)體內(nèi)源性清除超氧陰離子及過氧化氫的能力，而過氧化氫在ADR心肌毒性中似乎起著更突出的作用〔10，11〕。SOD 是體內(nèi)清除自由基的關(guān)鍵酶，也是重要的抗氧化酶之一，研究表明，隨著年齡的增長(zhǎng)，SOD清除氧自由基的能力逐漸下降，引起不飽和脂肪酸氧化生成過氧化物，使DNA、蛋白質(zhì)和酶等改變、破壞從而加速衰老。SOD 通過催化超氧陰離子歧化為H2O和O2，從而達(dá)到清除自由基，抗衰老的作用〔12〕。一般認(rèn)為，SOD對(duì)維護(hù)機(jī)體活性氧ROS的低水平是必要的，而GSH-Px則對(duì)防止體內(nèi)自由基引起的膜脂質(zhì)過氧化尤其重要〔13〕。GSH-Px 是機(jī)體一種抗氧化的重要酶，它特異地催化還原型谷胱甘肽(GSH)對(duì)過氧化物的還原反應(yīng)。GSH-Px不直接清除自由基，其作用在于阻斷由過氧化物引發(fā)的自由基對(duì)肌體的損害，保護(hù)細(xì)胞膜免受過氧化的損傷。GSH-Px 亦可與CAT 協(xié)同作用，催化對(duì)生物體有害的H2O2的分解，以減少自由基和過氧化脂質(zhì)的形成〔14〕。盡管CAT 不能直接清除·OH，但其可以降低過氧化氫的濃度，從而起到減輕氧化應(yīng)激損傷〔15〕。因此檢測(cè)心肌組織中的這些抗氧化物酶(SOD、CAT、GSH-Px)的活性可以反映組織中抗氧化防御能力的變化。理論上，氧自由基理論中的ADR引起的心臟毒性必然導(dǎo)致過氧化物酶的過量消耗，繼而組織內(nèi)酶的活力可能會(huì)明顯下降〔16〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)表明DH處理對(duì)ADR引起的大鼠心肌損傷具有保護(hù)作用，且進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)該保護(hù)作用與其提高大鼠心肌組織抗氧化防御能力有關(guān)。

本研究中發(fā)現(xiàn)，DH的發(fā)揮心肌保護(hù)作用的同時(shí)，對(duì)心肌的線粒體具有保護(hù)作用。ADR急性心臟毒性還有一個(gè)機(jī)制就是線粒體途徑，通過線粒體膜電位Δψm的降低，繼而誘導(dǎo)線粒體鈣離子通透性轉(zhuǎn)換通道(mPTP)孔的開放，從線粒體基質(zhì)將鈣釋放，導(dǎo)致線粒體生物能量衰竭而心肌細(xì)胞嚴(yán)重?fù)p傷甚至凋亡〔17，18〕。本實(shí)驗(yàn)印證了ADR能引起心肌細(xì)胞線粒體的膜電位Δψm的下降，同時(shí)，DH能顯著抑制Δψm的下降。由此可知，DH對(duì)心臟毒性的保護(hù)作用可能與保護(hù)線粒體功能，穩(wěn)定Δψm有關(guān)。本研究說明DH能通過提高抗氧化防御能力對(duì)ADR引起的心臟毒性具有保護(hù)作用。

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〔2012-12-01修回〕

(編輯安冉冉/曹夢(mèng)園)