曾源，賈興，韋良東，王乃富

(安徽農(nóng)業(yè)大學茶與食品科技學院，安徽合肥，230000)

牛干巴是云南回族的一種傳統(tǒng)民族肉制品，它以屠宰黃牛后腿肉為主要原料，并輔以其他香料，經(jīng)腌制、晾曬、擠壓、風干、切片、真空包裝而成［1］。油炸是加工牛干巴最常見的方式，雖然牛干巴以獨特的風味，豐富的營養(yǎng)深受人們的喜愛，但其中丙烯酰胺對人體的危害不容忽視。Tornquist等發(fā)現(xiàn)，一些普通食品在經(jīng)過煎、炸、烤等高溫加工處理時產(chǎn)生丙烯酰胺［1］，它是一種公認的神經(jīng)毒素，可以引起人體和動物神經(jīng)系統(tǒng)(主要是外周神經(jīng))的損害，并具有較強的組織滲透性，可以通過未破損的皮膚、黏膜、肺和消化道進入人體，經(jīng)口攝入被認為是人體吸收丙烯酰胺最快速和最完整的途徑［2］，且其含量會隨加工溫度的升高而增加［3］。

目前抑制丙烯酰胺產(chǎn)生的方法有很多，主要有控制丙烯酰胺前體物天冬酰胺以及還原糖的含量，改善熱加工條件及方法，以及使用添加劑，在針對那些還原糖以及天冬酰胺含量較少的食物中(主要是肉類食物)，使用合適的天然抗氧化劑是抑制丙烯酰胺產(chǎn)生的一個最重要的途徑，尤其是香辛料精油，它以其獨特的香氣以及抗氧化活性在抑制丙烯酰胺生成方面有很大的優(yōu)勢［4］。

目前科研人員對丙烯酰胺的研究主要針對植物淀粉類食品，對動物類食品的研究很少，因此對油炸肉類食品中丙烯酰胺的研究顯得很有必要。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 牛干巴樣品

購于云南省昆明市沃爾瑪超市(牛干巴成熟1個月)。

1.1.2 煎炸用油

香滿園大豆油，購于云南省昆明市沃爾瑪超市。

1.1.3 香辛料精油

迷迭香精油，水蒸氣蒸餾法提取。

1.1.4 試劑

L-天冬酰胺，聚乙二醇，丙烯酰胺標準樣品，F(xiàn)e-SO4，水楊酸鈉，H2O2，HCl，鄰苯三酚，Tris-HCl緩沖液，無水 Na2SO4，體積分數(shù)95%乙醇、KOH、NaOH、酚酞、KI、三氯甲烷、冰乙酸、Na2S2O3、EDTA、淀粉等試劑，均為分析純。

1.1.5 主要儀器與設備

Agilent1210高效液相色譜儀，美國安捷倫公司;ICS2500型離子色譜儀，美國戴安公司;micrOTOF-Q II高分辨質(zhì)譜儀(配電噴霧離子源)，德國Bruker公司;UNICO 7200紫外可見分光光度計，美國;中興牌101電熱鼓風干燥箱，上海實驗儀器廠有限公司;TGL-16C高速離心機，上海安亭科學儀器廠;DS-1高速組織搗碎機，上海啟前電子科技有限公司;HH-1恒溫油浴鍋，常州澳華儀器有限公司;SHA-BA恒溫振蕩器:常州澳華儀器有限公司;METTLER TOLEDO-FE20 pH計，瑞士;DENVER INSTRUMENT TD-114電子分析天平，美國丹佛儀器公司;DRAGON LAB均質(zhì)機，上海人和科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 油炸牛干巴的制作

新鮮水牛肉→修割整理→稱重→擦腌制料→搓揉→入盆壓實→封口→入庫腌制→出庫→風干→生牛干巴→切片(1cm×2cm×1cm)→油炸(恒溫油浴鍋調(diào)控特定時間，特定溫度)

腌制料配方:鹽3%，糖0.5%，亞硝酸鹽0.006%。

1.2.2 不同濃度的迷迭香精油對牛干巴丙烯酰胺含量的影響

將濃度分別為0%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%的迷迭香精油添加至煎炸大豆油中，牛干巴油炸時間2.5 min，油炸溫度170℃。

1.2.3 不同濃度的迷迭香精油溶液的配制

迷迭香精油濃度梯度為0.0%，0.1%，0.2%，0.3%，0.4%即采用微量進樣器在25 mL的無水乙醇溶液中分別加入0，0.025，0.05，0.075，0.1 mL 的迷迭香精油，混勻。

1.2.4 香辛料精油體外抗氧化活性的測定

1.2.4.1 清除DPPH自由基能力的測定

取0.4 mL一定濃度的樣品溶液，加入2 mL 0.1 mmol/L DPPH乙醇溶液，混勻，暗處放置30 min，并不斷振蕩，在517 nm處測定其吸光度，0.4 mL樣品溶液+2 mL乙醇為樣品對照，0.4 mL蒸餾水+2 mL乙醇為空白調(diào)零，0.4 mL蒸餾水+DPPH乙醇溶液為對照［5］。清除率計算公式為:

清除率/%=［A對照-(A樣品-A樣品對照)/A對照］×100

1.2.4.2 清除羥自由基能力的測定

在9支試管中加入濃度均為0.15 mol/L FeSO4，2 mmol/L水楊酸鈉1 mL，在其4支試管中分別加入不同濃度的樣品溶液1 mL，最后加6 mmol/L H2O21 mL啟動反應，定容至10 mL，37℃水浴反應1 h，以蒸餾水為參比，測定510 nm處的吸光值［6］。

抑制率/%=［A0-(Ai-Ai0)］/A0×100

式中，A0，用蒸餾水代替樣品的對照值;Ai，加樣后的吸光度;Ai0，樣品本身的吸光度。

1.2.4.3 清除超氧陰離子能力的測定

取4.5 mL pH 8的2.5 mmol/L Tris-HCl緩沖液，1.0 mL不同濃度的樣品溶液，2.4 mL蒸餾水，混勻后在25℃水浴中保溫20 min，取出后立即加入在25℃預熱過后的3 mmol的鄰苯三酚0.1 mL，迅速搖勻后倒入比色杯，于325 nm下每隔30 s測定吸光度，計算線性范圍內(nèi)每分鐘吸光度的增加，并計算抑制率［7］。

抑制率/%=(DA0-DA)/DA0×100

式中:DA0，產(chǎn)鄰苯三酚的自氧化速率;DA，加入精油溶液后鄰苯三酚的自氧化速率。

單位均為吸光度每分鐘的增值。

1.2.5 迷迭香精油抑制牛干巴丙烯酰胺生機理分析

1.2.5.1 迷迭香精油直接對丙烯酰胺含量的影響

3 mL不同濃度精油乙醇溶液與1 mL 200 mg/L的丙烯酰胺乙醇溶液反應(添加0.1%H2O2溶液做為對照)在聚乙二醇浴160℃反應10 min，立即冰浴，0.45 μm微孔濾膜過濾，HPLC法測定體系中丙烯酰胺的生成量［8］。

1.2.5.2 迷迭香精油對天門冬酰胺含量的影響

5 mL不同濃度樣品溶液(添加0.1%H2O2溶液做為對照)分別加入在1 mmol天門冬酰胺的模擬體系中(在不銹鋼試管發(fā)生反應)，并在160℃聚乙二醇浴下反應20 min，0.45 μm微孔濾膜過濾，計算天門冬酰胺生成量［9］。

1.2.5.3 迷迭香精油對煎炸大豆油體系羰基化合物含量的影響

將濃度分別為 0.0%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%的迷迭香精油5 mL添加至170℃煎炸大豆油中，并反應3 min，分別取其5種油樣，測其羰基化合物含量，測定方法參照GB/T 5009.37-2003食用植物油衛(wèi)生標準的分析方法。

1.2.6 單因素實驗

選擇影響牛干巴丙烯酰胺含量的3個主要因素進行單因素實驗。

牛干巴浸泡溶液pH的選擇:0.5%檸檬酸，蒸餾水，0.1%NaOH 調(diào)節(jié) pH 值為 5.5、6、6.5、7、7.5(油炸溫度170℃，油炸時間2.5 min)。油炸溫度的選擇:120、150、170、200、220 ℃(浸泡溶液 pH 6.5，油炸時間 2.5 min)。油炸時間的選擇:1.5、2、2.5、3、3.5 min(浸泡溶液pH 6.5，油炸溫度170℃)。

1.2.7 響應面實驗

采用Box-Behnken法，根據(jù)單因素實驗選擇最佳的因素和水平，以牛干巴丙烯酰胺含量為響應值，選擇最適浸泡溶液，油炸溫度及油炸時間。

1.2.8 牛干巴樣品前處理條件

稱取粉碎后的牛干巴樣品2 g，置于30 mL離心管，加10 mL甲醇，均質(zhì)3 min，取上清液5 mL，離心10 min，取上清液加卡瑞試劑1，2 各100 μL，離心15 min(10 000 r/min)，取2.5 mL上清液，(若除油，加7.5 mL正己烷，振蕩2 min，移去上層正己烷)，氮吹干，加0.5 mL蒸餾水振蕩2 min，過C18小柱(過柱前先經(jīng)過1 mL甲醇和1 mL水活化小柱)，舍棄前5滴后，收集過濾后的樣液，并用1.5 mL蒸餾水洗脫，收集洗脫液，最后過0.45微孔濾膜，即可進樣。

1.2.9 丙烯酰胺含量的測定(LC-MS/MS)

色譜條件:色譜柱為ZORBAX SB-Aq C18(150 mm×4.6 mm);流動相為0.1甲酸水溶液;檢測波長為198 nm;流速為0.6 mL/min;柱溫為25℃;進樣量為 10 μL。

質(zhì)譜條件:檢測方式:選擇反應監(jiān)測EIC;離子源溫度:室溫;掃描模式:ESI+;噴霧電壓:4 500 V;鞘氣電壓(N2)(bar):0.4;輔助氣(N2):4 L/min碰撞氣Ar:8×105Pa;毛細管溫度:180℃;離子源溫度:室溫;丙烯酰胺定量離子為m/z 72、55，定性離子為m/z 72、27;同位素內(nèi)標［D3］-丙烯酰胺定量離子為 m/z 75、58，定性離子為 m/z 75、30，碰撞能量(E/V):40。

1.2.10 天門冬酰胺的測定

參考歐仕益的方法［10］。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度的香辛料精油對牛干巴丙烯酰胺含量的影響

圖1顯示，隨著迷迭香精油濃度的升高，牛干巴丙烯酰胺的含量呈明顯下降的趨勢，濃度達到0.4%以上時，丙烯酰胺的含量趨于穩(wěn)定，因此可以推斷，迷迭香精油可以作為抑制丙烯酰胺生成的添加劑。

圖1 不同濃度的迷迭香對牛干巴丙烯酰胺含量的影響Fig.1 Effects of different concentrations of rosemary on acrylamide levels in dried beef

2.2 迷迭香精油清除自由基能力與其丙烯酰胺抑制率的關系(表1)

表1 迷迭香精油清除自由基能力與其丙烯酰胺抑制率的關系Table 1 Rosemary essential oil and its ability to clear the relationship between acrylamide radical inhibition rate

2.3 迷迭香精油清除自由基能力與其丙烯酰胺抑制率的相關性分析

由表2可知，迷迭香精油對超氧陰離子自由基清除率與丙烯酰胺抑制率的相關性最高(r=為0.909)，其次是羥自由基清除率(r=0.884)而與DPPH自由基清除率相關性最小(r=0.836)，由此可以推斷迷迭香精油的體外抗氧化活性與其丙烯酰胺抑制率存在很顯著的相關性。

表2 迷迭香精油清除自由基能力與其丙烯酰胺抑制率的相關性分析Table 2 The correlation analysis of rosemary essential oils to clear free radicals and their ability to inhibit the rate of acrylamide

2.4 香辛料精油抑制牛干巴丙烯酰胺產(chǎn)生機理分析

由表3可知，不同濃度的的迷迭香精油直接與丙烯酰胺反應后，丙烯酰胺的含量并沒有發(fā)生太大的變化，說明迷迭香精油并不直接與丙烯酰胺反應，另一方面不同濃度的香辛料精油在與0.1%H2O2混合后，再與丙烯酰胺直接反應，丙烯酰胺的含量都有不同程度的減少，說明迷迭香精油的氧化產(chǎn)物可以通過直接破壞丙烯酰胺達到抑制的目的。隨著迷迭香濃度的升高，與之反應的天冬酰胺的含量逐漸減少，說明迷迭香精油可通過競爭丙烯酰胺的前體物質(zhì)即天冬酰胺，而減少丙烯酰胺的含量。羰基價反映的是煎炸油在高溫下產(chǎn)生的總羰基類化合物含量，從表3可以看出，羰基價與迷迭香精油的添加量呈良好的線性趨勢，可以推測迷迭香精油對丙烯酰胺的另一個抑制機理可能是其含有可以捕捉羰基類化合物的物質(zhì)［11］。

表3 香辛料精油抑制牛干巴丙烯酰胺產(chǎn)生機理分析Table 3 Theanalysis of the formation mechanism of acrylamide that sim feed oils inhibit it in dried beef

2.5 油炸溫度，油炸時間以及浸泡溶液pH的單因素實驗

由圖2可知，在120～170℃內(nèi)，隨著溫度的升高，丙烯酰胺的含量逐漸升高，170～200℃內(nèi)，隨著溫度的升高，丙烯酰胺的含量逐漸減少，在200℃以后，丙烯酰胺含量有輕微的上升趨勢。在溫度高于120℃的煎炸大豆油中，不飽和脂肪酸和飽和脂肪酸都會被氧化分解，不飽和脂肪酸氧化先產(chǎn)生一級氧化產(chǎn)物氫過氧化物，而氫過氧化物不穩(wěn)定會產(chǎn)生次級代謝產(chǎn)物如醛、酮、醇類化合物，這些含有羰基的化合物可能形成丙烯酰胺，飽和脂肪酸氧化反應的大多數(shù)的分解產(chǎn)物為醛和甲基酮以及少量的醇與γ-內(nèi)酯，而這些產(chǎn)物也有重新合成形成AA的可能性，但當溫度過高時，生成的丙烯酰胺會發(fā)生一定程度的降解［12］。

圖2 油炸溫度與牛干巴丙烯酰胺含量的關系Fig.2 Relationship between frying temperature and acrylamide levels in dried beef

由圖3可知，在1.5～2.5 min內(nèi)，隨著油炸時間的增加，丙烯酰胺的含量逐漸升高，在2.5～3 min內(nèi)，隨著油炸時間的增加，丙烯酰胺的含量逐漸減少，3 min以后又有增長的趨勢。除了上述煎炸大豆油降解產(chǎn)物生成丙烯酰胺以外，通過丙烯醛、丙烯酸生成丙烯酰胺也是一個主要途徑［13］，牛干巴中的蛋白質(zhì)和碳水化合物在高溫分解反應中，都會產(chǎn)生大量的小分子醛類物質(zhì)，而丙烯醛經(jīng)由直接氧化反應生成丙烯酸，丙烯酸再與氨反應，最終生成AA;丙烯醛也可直接與Asn反應形成N-糖苷，而后轉(zhuǎn)化成AA，重新化合生成丙烯醛，進而生成丙烯酰胺［14］。

圖3 油炸時間與牛干巴丙烯酰胺含量的關系Fig.3 Relationship between frying time and acrylamide levels in dried beef

由圖4可知，浸泡溶液在弱酸性的條件下，牛干巴丙烯酰胺的含量最少，在弱堿性條件下，丙烯酰胺含量達到最高。適當調(diào)節(jié)牛干巴基質(zhì)的pH值可以抑制丙烯酰胺的形成降低食品體系的pH值可使天冬酰胺分子中的α-氨基質(zhì)子化［15］，降低了與碳水化合物發(fā)生親核加成反應的可能性，從而阻止了丙烯酰胺的形成通過降低pH值，檸檬酸可能使牛干巴中游離的非質(zhì)子化的胺(—NH2)轉(zhuǎn)換成質(zhì)子化的胺離子(—NH3+)，從而在第一步就阻止了美拉德反應中丙烯酰胺的形成［16］。

圖4 浸泡溶液pH值與牛干巴丙烯酰胺含量的關系Fig.4 Relationship between pH of the solution soak and acrylamide levels in dried beef

2.6 響應面實驗優(yōu)化最佳加工條件

以牛干巴丙烯酰胺的含量為響應值，以單因素試驗結(jié)果為基礎，擬定試驗因素水平見表4，試驗結(jié)果見表5。經(jīng)回歸擬合后，試驗因子對響應值的影響可以用以下回歸方程表示:

表4 Box-Behnken Design實驗因素與水平Table 4 Levels of the variables in the Box-Behnken design

表5 Box-Behnken Design實驗設計與結(jié)果Table 5 Experimental design and results of Box-Benhnken Design

Y=57.28-1.10A+0.75B+2.50C-0.20AB-0.20AC+0.52BC-4.71A2-1.27B2-0.75C2

由表6可知，所選模型的不同處理間差異極顯著(P＜0.01)，說明用回歸方程描述各因子與響應值之間的關系時，其應變量與全體自變量之間的線性關系顯著，即該試驗方法可靠。失擬項0.721 8＞0.05，說明該方程對試驗擬合情況好，試驗誤差比較小。單一因素pH，油炸溫度，油炸時間對丙烯酰胺含量的影響是極顯著的，交互項中BC，影響顯著，說明油炸時間和油炸溫度之間的交互作用顯著，能顯著影響油炸薯條中丙烯酰胺的生成量;AB，AC的影響不顯著，說明浸泡溶液pH和油炸時間之間、浸泡溶液pH和油炸溫度之間都沒有交互作用。

表6 響應面二次回歸模型方差分析Table 6 ANOVA for response surface quadratic model

該方程的決定系數(shù)R2=99.37%，表示方程擬合度良好。C·V表示試驗的精確度，本實驗C·V=0.74%，試驗可靠。

2.7 響應面圖與等高面圖分析

根據(jù)上述回歸方程及回歸模型方差分析表繪出響應面圖和等高圖，見圖5～圖7。從響應面立體分析圖可知，響應面立體分析圖開口向下，當響應值增大到極值以后，隨著各因素的增大，響應值逐漸減少，經(jīng)過修正，選擇浸泡溶液pH 6.90，油炸溫度198℃，油炸時間1.6 min，在此條件下，牛干巴丙烯酰胺含量達到了 48.5 μg/kg。

圖5 油炸溫度和pH對牛干巴中丙烯酰胺含量影響的響應面圖和相應等高圖Fig.5 Frying temperature and pH on acrylamide levels in dried beef on the response surface map and the corresponding contour map

圖6 油炸時間和pH對牛干巴中丙烯酰胺含量影響的響應面圖和相應等高圖Fig.6 Frying time and pH on acrylamide levels in dried beef on the response surface map and the corresponding contour map

圖7 油炸溫度和油炸時間對牛干巴中丙烯酰胺含量影響的響應面圖和相應等高圖Fig.7 Frying time and Frying temperature on acrylamide levels in dried beef on the response surface map and the corresponding contour map

3 結(jié)論與討論

牛干巴丙烯酰胺含量會隨著迷迭香精油濃度的升高而逐漸降低，迷迭香精油的體外抗氧化活性與牛干巴丙烯酰胺含量有著很顯著的相關性，且DPPH自由基的清除率與丙烯酰胺抑制率的相關性最高(相關系數(shù)為0.909)，迷迭香精油并不直接與丙烯酰胺反應，但其氧化產(chǎn)物可以通過直接破壞丙烯酰胺達到抑制的目的，迷迭香精油也可以通過競爭丙烯酰胺的前體物質(zhì)即天冬酰胺，從而減少丙烯酰胺的含量，另一個對丙烯酰胺的抑制機理可能是其含有可以捕捉羰基類化合物的物質(zhì)。響應面法優(yōu)化得出最適處理方法:浸泡溶液pH 6.90，油炸溫度198℃，油炸時間1.6 min，在此條件下，牛干巴丙烯酰胺含量達到了48.5 μg/kg。

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