邢兆國，常軍英，賈東昭，王彥志，李　炎，李琦軍

(河北省石家莊市第三醫(yī)院創(chuàng)傷一科，河北 石家莊 050011)

維生素C對(duì)擠壓傷缺血/再灌注引起的心肌功能損傷的影響

邢兆國，常軍英，賈東昭，王彥志，李炎，李琦軍*

(河北省石家莊市第三醫(yī)院創(chuàng)傷一科，河北 石家莊 050011)

[摘要]目的觀察維生素C(vitamin C，VitC)對(duì)大鼠擠壓綜合征(crush syndrome,CS)模型缺血/再灌注引起心肌損傷的改善情況，以及對(duì)生存率的影響。方法SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、CS組、CS+VitC-10組、CS+VitC-20組、CS+VitC-40組，復(fù)制CS模型，大鼠雙側(cè)后肢擠壓6 h，然后再灌注生理鹽水以及不同劑量VitC(10、20、40 mg/kg)6 h，收集血液用于生化分析，同時(shí)收集組織樣品用于RT-PCR與Western Blot分析。結(jié)果擠壓傷后CS組血鉀(K+)、尿素氮(urea nitrogen,BUN)、肌酐(creatinine,Cr)、肌酸激酶(creatine kinase,CK)、肌鈣蛋白I(cardiac troponin I，cTnI)、肌酸激酶心肌同功酶(creatine kinase MB,CK-MB)、血漿心鈉素(atrial natriuretic factor，ANP)較對(duì)照組升高，但CS組血鈣(Ca2+)、內(nèi)皮素1(endothelin-1,ET-1)較對(duì)照組下降(P<0.05)；與CS組相比，CS+VitC-10、20、40組K+、BUN、Cr、CK的含量顯著降低，Ca2+、ET-1含量顯著升高(P<0.05)。VitC-20組和VitC-40組的生存率高于CS組(P<0.05)。結(jié)論VitC對(duì)CS模型缺血/再灌注引起的心肌損傷具有細(xì)胞保護(hù)作用，并有助于提高大鼠CS模型的生存率。

[關(guān)鍵詞]擠壓綜合征;心肌再灌注損傷;抗壞血酸;大鼠

doi:10.3969/j.issn.1007-3205.2015.07.012

擠壓綜合征(crush syndrome,CS)是交通事故、地震、戰(zhàn)爭(zhēng)和恐怖襲擊等災(zāi)害中的主要致死原因[1]。當(dāng)大腿壓迫(缺血)1 h以上，然后解除壓力(再灌注)后引起肌細(xì)胞破裂即橫紋肌溶解[2]。外傷性橫紋肌溶解患者往往伴隨著血容量不足和血管通透性增加，有時(shí)會(huì)誘發(fā)高血壓和代謝性酸中毒。肢體擠壓傷對(duì)機(jī)體產(chǎn)生的影響是廣泛而復(fù)雜的[3]，在肢體缺血/再灌注時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的鉀離子通過破壞的細(xì)胞膜大量進(jìn)入體循環(huán)，導(dǎo)致心臟驟停，高血鉀對(duì)心臟的損害最為嚴(yán)重，可直接導(dǎo)致心電紊亂，是CS常見的死因之一。在大鼠擠壓傷的早期，心肌細(xì)胞就存在一定程度的損傷[4]，這種損傷可能與血漿兒茶酚胺、血管緊張素(angiotensin，Ang)Ⅱ升高，血漿心鈉素(atrial natriuretic factor,ANP)、內(nèi)皮素(endothelin,ET)-1濃度的改變有密切關(guān)系。目前，CS的推薦治療方案是生理鹽水及時(shí)補(bǔ)液，加入碳酸氫鹽和甘露醇糾正高鉀血癥。有研究報(bào)道，抗氧化劑和自由基清除劑[如維生素C(vitamin C，VitC)]可以治療和預(yù)防缺血/再灌注引起心律失常與全身性炎癥反應(yīng)，但是明確的作用效果與作用機(jī)制還不十分清楚。本研究采用大鼠擠壓傷致股骨干骨折模型，系統(tǒng)比較擠壓傷大鼠與正常大鼠心功能指標(biāo)的變化，觀察生理鹽水聯(lián)合VitC治療對(duì)擠壓傷后心臟損傷的改善情況，以便能更好地指導(dǎo)臨床。報(bào)告如下。

1材料與方法

1.1動(dòng)物模型的建立與分組雄性SD大鼠140只購于河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，體質(zhì)量250～300 g。其中40只隨機(jī)分為對(duì)照組、CS組、CS+VitC-10組、CS+VitC-20組、CS+VitC-40組各8只。對(duì)照組不擠壓；CS組、CS+VitC-10組、CS+VitC-20組、CS+VitC-40組均采用自制擠壓器械，壓力為3 kg，連續(xù)擠壓雙下肢6 h造成肢體擠壓傷后，再分別灌注生理鹽水以及不同劑量VitC(10、20、40 mg/kg)。另100例用于生存率的研究。

1.2血液和組織取樣分別從各組股動(dòng)脈取血2 mL，應(yīng)用全自動(dòng)生化檢測(cè)儀，檢測(cè)血鉀(K+)、血鈣(Ca2+)、肌酐(creatinine,Cr)、尿素氮(urea nitrogen,BUN)以及肌酸激酶(creatine kinase,CK)的改變。應(yīng)用ACS-180型自動(dòng)化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)，檢測(cè)肌鈣蛋白I(cardiac troponin I，cTnI)及肌酸激酶心肌同功酶(creatine kinase MB,CK-MB)濃度；應(yīng)用放射免疫法檢測(cè)血漿內(nèi)活性物質(zhì)ANP、ET-1濃度。各組大鼠在取血后處死，打開胸腔，在心臟仍跳動(dòng)時(shí)剪開心臟，取部分心肌應(yīng)用光學(xué)顯微鏡觀察擠壓傷后不同時(shí)間段心肌組織光學(xué)病理變化情況；用RT-PCR和Western Blot技術(shù)，觀察心功能相關(guān)指標(biāo)(如ANP和ET-1)的變化。

1.3心肌組織形態(tài)學(xué)觀察取部分心肌組織置于冷 PBS 中洗凈殘留血液，放入 10% 福爾馬林中固定至少24 h，乙醇梯度脫水，低溫石蠟垂直定向包埋，5 μm厚度連續(xù)切片，常規(guī) HE 染色。并于光鏡下觀察、照相，進(jìn)行圖像學(xué)分析。

1.4RT-PCR用異硫氰酸胍-酚-氯仿一步法提取總RNA，以此為模板，以O(shè)ligo(dT)16為引物，按照PE公司Taqman反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成互補(bǔ)脫氧核糖核酸 (complementary deoxyribonucleic acid，cDNA)。以cDNA為模板，分別加入大鼠ANP、ET-1和c-Fos基因的引物，以GAPDH為內(nèi)參照，按照PCR Kit說明書進(jìn)行PCR。所用引物序列如下：ANP上游引物為5′-GGCTCCTTCTCCA-TCACCAA-3′，下游引物為5′-TGTTATCTTCGG-TACCG-3′；ET-1上游引物為5′-AACCATGGA-TTATTTGTCCATG-3′，下游引物為5′-AGTG-TTGACCCAAATGATGTCC-3′；c-Fos上游引物為 5′-CAGCCTTTCCTACTACCAT-3′，下游引物為5′-CCTATTCCTTTCCCTTCG-3′；GAPDH上游引物為5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′，下游引物為5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′。

1.5Western印跡分析按常規(guī)方法收集和裂解細(xì)胞,取上清,用改良Lowry法進(jìn)行蛋白定量。取等量的蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE),半干法將分離膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜上; 以5%脫脂奶粉37 ℃封閉2 h,加入一抗4 ℃過夜,Tris鹽酸緩沖液洗膜后，以辣根過氧化物酶標(biāo)記的IgG二抗37 ℃封閉2 h,增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法發(fā)光成像。

1.6生存率分析CS組、CS+VitC-10組、CS+VitC-20組、CS+VitC-40組大鼠各25只分別擠壓6 h后，觀察48 h再灌注的生存率。

2結(jié)果

2.1各組主要生化指標(biāo)的變化擠壓傷后血清K+、BUN、Cr、CK較對(duì)照組升高(P<0.05)；與CS組相比，CS+VitC-10、-20、-40組血清K+、BUN、Cr、CK的含量顯著降低(P<0.05)，并且呈劑量依賴關(guān)系。Ca2+則在解壓后與對(duì)照組比較有所下降，CS+VitC-10、-20、-40組血清 Ca2+的含量顯著升高，并且呈劑量依賴關(guān)系。見表1。

表1各組大鼠血清K+、Ca2+、BUN、Cr、CK比較

Table 1Serum K+,Ca2+,BUN,Cr and CK in rats of different groups

組別K+(mmol/L)Ca2+(mmol/L)BUN(mmol/L)Cr(μmol/L)CK(U/L)對(duì)照組5.28±0.372.96±0.478.652±1.18 64.96±10.222102.35±621.41 CS組11.27±1.97*1.49±0.59*29.47±6.21*199.98±24.03*15745.52±2643.36*CS+VitC-10組7.98±1.38*#1.89±0.38*#17.39±7.26*#102.72±20.14*#4576.63±1252.94*#CS+VitC-20組6.18±1.49*#△2.37±0.57*#△10.71±6.64#△89.68±18.93*#△2793.48±712.31*#△CS+VitC-40組5.79±1.56#△2.69±0.37*#△☆9.93±5.89#△78.01±15.62*#△☆2418.36±684.85#△ F22.54012.03917.45568.476135.271 P0.0000.0000.0000.0000.000

*P<0.05與對(duì)照組比較#P<0.05與CS組比較△P<0.05與VitC-10組比較☆P<0.05與VitC-20組比較(q檢驗(yàn))

2.2各組血清中cTnI、CK-MB 水平的改變擠壓傷后血清cTnI、CK-MB水平明顯升高(P<0.05)；與CS組相比，CS+VitC-10、-20、-40組血清cTnI、CK-MB的含量顯著降低(P<0.05)。見表2。

表2各組大鼠血清cTnI、CK-MB比較

Table 2Serum cTnI and CK-MB in rats of different groups

組別cTnI(μg/L)CK-MB(U/L)對(duì)照組0.45±0.19 2338.30±613.70CS組9.47±4.56*8951.56±1023.24*CS+VitC-10組4.19±1.56*#4021.87±983.79*#CS+VitC-20組1.78±0.34*#△2228.39±820.17#△CS+VitC-40組1.15±0.27*#△☆1952.38±648.43#△ F22.96599.177 P0.0000.000

*P<0.05與對(duì)照組比較#P<0.05與CS組比較△P<0.05與VitC-10組比較☆P<0.05與VitC-20組比較(q檢驗(yàn))

2.3各組血漿、心肌組織中ANP、ET-1水平的改變大鼠血漿 ANP 含量在擠壓傷后上升，與對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而與CS組相比，CS+VitC-10、-20、-40組血清 ANP的含量顯著下降(P<0.05)。血清 ET-1 水平則在傷后 6 h 有所下降，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與CS組相比，CS+VitC-10、-20、-40組血清ET-1的含量顯著升高(P<0.05)。見表3。

RT-PCR和Western印跡分析結(jié)果顯示，擠壓傷后心肌組織ANP mRNA與蛋白質(zhì)水平較對(duì)照組均下降，而CS+VitC-10、-20、-40組心肌組織ANP mRNA與蛋白質(zhì)水平均顯著升高。擠壓傷后心肌組織ET-1 mRNA與蛋白質(zhì)水平較對(duì)照組均升高，而CS+VitC-10、-20、-40組心肌組織ET-1 mRNA與蛋白質(zhì)水平均顯著降低(圖1)。

表3各組大鼠血清ANP、ET-1比較

Table 3Serum ANP and ET-1 in rats of different groups

組別ANPET-1對(duì)照組31.79±21.47 458.38±40.18 CS組78.08±34.32*298.28±64.87*CS+VitC-10組56.04±27.89*349.08±77.14*CS+VitC-20組38.32±22.37#421.98±47.18#△CS+VitC-40組34.50±25.54#437.78±43.16#△☆ F4.22411.361 P0.0070.007

*P<0.05與對(duì)照組比較#P<0.05與CS組比較△P<0.05與VitC-10組比較☆P<0.05與VitC-20組比較(q檢驗(yàn))

圖1各組大鼠心肌組織中ANP與ET-1表達(dá)的變化

A.RT-PCR；B.Western Blot

Figure 1ANP and ET-1 expression in rat myocardium of different groups

2.4各組心肌光鏡 HE 染色結(jié)果對(duì)照組心肌組織正常，微細(xì)血管、心肌間質(zhì)完好，細(xì)胞核呈卵圓形，位于細(xì)胞中央，核膜完整；CS組心肌組織水腫改變、肌間水腫加重，炎癥細(xì)胞有所增多；CS+VitC-10組心肌纖維腫脹程度較輕，少許纖維斷裂，心肌結(jié)構(gòu)稍亂，出血，伴炎細(xì)胞浸潤；CS+VitC-20組，肌間水腫吸收，心肌纖維腫脹程度較輕，少許纖維斷裂，心肌結(jié)構(gòu)稍亂(圖2)。

圖2各組心肌HE染色結(jié)果

A.對(duì)照組；B.CS組；C.CS+VitC-10組；D.VitC-20組

Figure 2HE staining in myocardium of rats in different groups

2.5各組大鼠生存率比較VitC-20組和VitC-40組的生存率高于CS組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表4　各組大鼠生存率比較

*P<0.05與CS組比較#P<0.05與VitC-10組比較(χ2檢驗(yàn))

3討論

嚴(yán)重肢體擠壓傷后發(fā)生缺血/再灌注損傷，不僅造成擠壓部位的功能損傷，再灌注使擠壓部位的代謝毒性物質(zhì)進(jìn)入血液循環(huán)，影響循環(huán)系統(tǒng)血管內(nèi)皮及心肌組織，相應(yīng)可引起心臟功能損傷，可能有心力衰竭及其他改變。細(xì)胞內(nèi)容物大量釋放入血,產(chǎn)生高鉀血癥、腎功能障礙，表現(xiàn)為血清BUN、Cr、K+濃度明顯升高[5]。本研究結(jié)果表明，擠壓傷后血清K+、BUN、Cr較對(duì)照組升高，說明擠壓后的確發(fā)生心肌繼發(fā)性損傷；但CS+VitC-10、-20、-40組血清K+、BUN、Cr、CK的含量顯著降低，且呈劑量依賴關(guān)系，說明VitC可以改善缺血/再灌注誘導(dǎo)的心肌損傷。另外，損傷引起的胞膜通透性增加，大量Na+內(nèi)流，通過Na+-Ca2+交換，胞內(nèi)Ca2+明顯上升，使細(xì)胞Ca2+超載，加重細(xì)胞損傷，而血清Ca2+則明顯下降[6]。本研究結(jié)果表明，擠壓傷后血清Ca2+較對(duì)照組顯著下降，CS+VitC-10、-20、-40組血清 Ca2+的含量明顯升高，說明VitC可以緩解缺血/再灌注損傷引起的心肌損傷。

CK在肌細(xì)胞中含量豐富，而CK-MB以心肌細(xì)胞含量多[7]，cTnI為心肌肌鈣蛋白的組成成分之一，只在心肌中表達(dá)，具有高度的組織特異性。研究表明，心肌細(xì)胞損傷后，cTnI釋放入血，使血清濃度增加，血清cTnI升高的幅度與心肌損傷的程度具有明顯的一致性，可作為心肌損傷的特異指標(biāo)[8]。本研究結(jié)果顯示，擠壓傷后6 h大鼠血清CK-MB與cTnI升高，提示在擠壓傷的早期就可能有心肌損傷的存在；而CS+VitC-10、-20、-40組血清 CK-MB與cTnI的含量明顯降低，說明VitC可以緩解缺血/再灌注損傷引起的心肌損傷，導(dǎo)致生存率從28%(CS組)提高到64.0%(VitC-20組)和72.0%(VitC-40組)。

為了探討VitC緩解肢體擠壓傷后心肌繼發(fā)損傷的可能機(jī)制，本研究檢測(cè)了血漿ANP和ET-1濃度的變化。ANP是近年來發(fā)現(xiàn)的血管活性物質(zhì)，由心房肌細(xì)胞合成和分泌，具有血管舒張、外周阻力減少、腎排水排鈉增多等生理作用[9]。ANP也可存在于血漿和腦脊髓液中，血漿中的ANP來源于心臟心肌分泌[10]。本研究結(jié)果顯示，擠壓傷后血漿與心肌組織中ANF的水平較對(duì)照組均降低，而靜脈注射VitC后ET-1的水平均顯著升高。

ET-1主要由血管內(nèi)皮細(xì)胞合成和分泌，具有強(qiáng)烈的縮血管作用；在生理狀態(tài)下，ET-1能夠維持正常的血管張力和心肌收縮力，對(duì)心臟具有正性變力和正性變時(shí)效應(yīng)。ET-1在慢性心力衰竭、高血壓、腎臟疾病的發(fā)生中具有重要作用[11]。故心肌及血漿內(nèi)ET-1的水平是心肌損傷的一個(gè)重要活性物質(zhì)，可以作為臨床判定心肌損傷損害程度的指標(biāo)[12]。本研究結(jié)果顯示，擠壓傷后血漿與心肌組織中ET-1的水平較對(duì)照組均升高，而靜脈注射VitC后ET-1的水平均顯著降低，從而降低心肌損傷，并且改進(jìn)CS大鼠的生存率。

綜上所述，在CS大鼠模型中靜脈給藥VitC可以明顯降低缺血/再灌注誘發(fā)心肌損傷，并且可以提高生存率。

[參考文獻(xiàn)]

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(本文編輯：趙麗潔)

聲明

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特此聲明

《河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)》編輯部

·論著·

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四醫(yī)院副主任技師，醫(yī)學(xué)碩士，從事醫(yī)學(xué)影像學(xué)診斷研究。

[中圖分類號(hào)]R642

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[文章編號(hào)]1007-3205(2015)07-0787-05

[收稿日期]2014-12-02；[修回日期]2015-01-26

[作者簡(jiǎn)介]田志輝(1978-)，男，河北保定人，河北醫(yī)科大學(xué)第

*通訊作者。E-mail:annama@163.com

Vitamin C reduces ischemia/reperfusion-induced muscle damage in rat crush injury model

XING Zhao-guo，CHANG Jun-ying，JIA Dong-zhao，WANG Yan-zhi，LI Yan,LI Qi-jun*

(Department of Orthopedic Trauma，the Third Hospital of Shijiazhuang，

Hebei Province，Shijiazhuang 050011，China)

[Abstract]ObjectiveTo observe the effects of vitamin C (VitC) in ischemia/reperfusion-induced muscle damage and the survival rates in rat crush syndrome(CS) model.Methods SD rats were randomly divided into control group,CS group,CS+VitC-10 group,CS+VitC-20 group and CS+VitC-40 group.To create a crush injury model,SD rats were subjected to bilateral hind limb compression with rubber tourniquets for 6 h,followed by reperfusion for 6 h.Saline for the CS group or VitC(10,20 and 40 mg/kg) for the VitC-treated groups were intravenously administered immediately before reperfusion.Blood samples were collected for biochemical analysis,and tissue samples for RT-PCR and Western Blot assay.ResultsCompared with those of control group,K+,urea nitrogen(BUN),creatinine(Cr),creatine kinase(CK),cardiac troponin I(cTnI),creatine kinase MB(CK-MB) and atrial natriuretic factor(ANP) were significantly increased in CS group,but Ca2+and endothelin-1(ET-1) in CS group were significantly reduced(P<0.05).Compared with those of CS group,K+,BUN,Cr and CK were significantly decreased,while Ca2+and ET-1 in VitC-10,VitC-20 and VitC-40 group were significantly increased(P<0.05).The survival rate of VitC-20 and VitC-40 group were much higher than that of CS group(P<0.05).ConclusionVitC reduces ischemia/reperfusion-induced muscle necrosis through its cytoprotective action and contributes to improved survival rate in rat CS model.

[Key words]crush syndrome;myocardial reperfusion injury;ascorbic acid;rats