類葉升麻苷在體內(nèi)誘導(dǎo)血紅素加氧酶-1的表達(dá)

王洪權(quán)王玉敏1崔其福趙偉麗1王麗娜

(赤峰學(xué)院醫(yī)學(xué)院赤峰學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，內(nèi)蒙古赤峰024005)

摘要〔〕目的探討類葉升麻苷(AS) 是否在體內(nèi)誘導(dǎo)血紅素加氧酶-1(HO-1)的表達(dá)。方法AS 12.5 mg/kg 和25 mg/kg以腹腔注射的方式給予SD大鼠，在特定時間處死大鼠，取大腦皮層和紋狀體組織以及腎臟和肝臟組織。提取組織蛋白，Western印跡方法檢測HO-1。結(jié)果與正常對照組相比,AS可在皮層和紋狀體中劑量依賴性誘導(dǎo)HO-1的表達(dá)上調(diào)，在外周腎臟和肝臟組織中AS劑量依賴誘導(dǎo)HO-1的表達(dá)上調(diào)。結(jié)論AS可在體內(nèi)誘導(dǎo)HO-1的表達(dá)。

關(guān)鍵詞〔〕類葉升麻苷；血紅素加氧酶-1；神經(jīng)退行性疾病；蛋白表達(dá)

中圖分類號〔〕R741.05〔

基金項目：國家自然科學(xué)

Acteoside induced heme oxygenase-1 expression in vivo

WANG Hong-Quan，WANG Yu-Min，CUI Qi-Fu,etal.

Chifeng Medical College,Chifeng University,Chifeng 024005,Inner Mongolia,China

Abstract【】ObjectiveTo investigate whether Acteoide(AS) induce Heme oxygenase-1(HO-1) expression in vivo.MethodsMale Sprague-Dawley rats(220～250 g) were treated with a single injection with 12.5,25 mg/kg body weight AS . Animals brain tissue were removed，and immunohistochemistry was carried out. Fresh brain，kidney and liver tissue were homogenized in lysis buffer，then the HO-1 levels were determined by Western blot.ResultsAS induced the expression of HO-1 in a concentration-dependent in rat cortex and striatum,also in liver and kidney.ConclusionsAS could induce Heme HO-1 expression in vivo.

【Key words】Acteoside;Heme oxygenase-1;Neurodegenerative disease;Protein expression

1腫瘤內(nèi)科

第一作者：王洪權(quán)(1979-)，男，博士,副教授，主治醫(yī)師，主要從事神經(jīng)退行疾病發(fā)病機制及其防治的臨床與基礎(chǔ)研究。

血紅素加氧酶-1(HO-1)通過抗氧化損傷作用而發(fā)揮其神經(jīng)保護(hù)作用〔1〕。大量研究表明，體內(nèi)活性氧(ROS)產(chǎn)生增加或ROS清除能力的減低，從而破壞氧化還原穩(wěn)態(tài)，最終導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)總的ROS增加或氧化應(yīng)激(OS)的發(fā)生。在OS狀態(tài)下，過多的ROS持續(xù)不斷地攻擊脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA，導(dǎo)致嚴(yán)重不可逆的氧化損傷。OS參與許多疾病的病理機制。包括神經(jīng)退行性疾病〔2〕。 因此目前篩選出能夠上調(diào)HO-1表達(dá)的天然化合物成為氧化應(yīng)激損傷的研究熱點〔3，4〕。本研究探討天然抗氧化劑類葉升麻苷(AS)是否能夠在體內(nèi)上調(diào)HO-1的表達(dá)。為探討AS作為治療神經(jīng)退行性疾病治療奠定了基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料與儀器HO-1抗體(#SPA895) 購自Stressgen公司,AS購自Winherb Medical Technology Inc，免疫印跡化學(xué)發(fā)光試劑(ECL)購自Santa cruz公司，聚偏氟乙烯(PVDF)膜購自Millpore公司。Western印跡電泳儀(Bio-Rad公司),酶標(biāo)儀(Bio-Rad公司),多用脫色搖床(上海新波無線電廠),超純水凈化儀(Millipore公司) ,倒置相差顯微鏡(日本Nikon公司)。

1.2Western印跡按照文獻(xiàn)方法進(jìn)行〔4,5〕用冷磷酸鹽緩沖液(PBS)收集處理好的培養(yǎng)細(xì)胞，用RIPA 裂解液勻漿提取蛋白為總蛋白。10%+二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠(SDS-PAGE)凝膠電泳，將蛋白質(zhì)從SDS-PAGE凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，放入含5%脫脂奶粉的鹽酸緩沖液(TBS)中平衡2 h；在膜上滴加一抗，室溫，翻轉(zhuǎn)搖床上作用2 h，然后移至4℃冰箱中過夜；TBST漂洗3次，15 min/次；在膜上滴加抗兔辣根過氧化物酶-IgG二抗(1∶5 000)，室溫，翻轉(zhuǎn)搖床上作用1 h；TBST漂洗3次，15 min/次；ECL熒光顯影液加膜上反應(yīng)，暗室內(nèi)正面朝下蓋于X線膠片上，分別曝光，膠片顯影，定影。結(jié)果用圖像分析軟件(Quantity One) 進(jìn)行灰度值定量分析。以β肌動蛋白作為內(nèi)參照，計算待測蛋白條帶積分吸光度與β肌動蛋白的比值，表示待測蛋白的相對表達(dá)水平。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法采用GraphPad Prism 4.0 software軟件進(jìn)行t檢驗及單因素方差分析。

2結(jié)果

2.1AS在皮層和紋狀體上調(diào)HO-1蛋白的表達(dá)動物腹腔注射AS(25 mg/kg) 6 h后處死動物，提取大腦皮層和紋狀體組織，提取蛋白。免疫印記顯示，AS可在大腦皮層和紋狀體組織誘導(dǎo)HO-1的表達(dá)。AS可以在神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)誘導(dǎo)HO-1的表達(dá)，同時也表明AS可通過血腦屏障進(jìn)入大腦內(nèi)。見圖1，圖2。

2.2AS在肝臟和腎臟誘導(dǎo)HO-1蛋白的表達(dá)動物腹腔注射AS(25 mg/kg)6 h后處死動物，提取肝臟和腎臟組織蛋白。免疫印記顯示，AS同樣也可在肝臟和腎臟組織誘導(dǎo)HO-1的表達(dá)。這表明，AS也可在外周組織中上調(diào)HO-1的表達(dá)。見圖3，圖4。

圖1　AS誘導(dǎo)大腦皮層HO-1表達(dá)

圖2　AS誘導(dǎo)紋狀體HO-1表達(dá)

圖3　AS誘導(dǎo)肝臟HO-1表達(dá)

圖4　AS誘導(dǎo)腎臟HO-1表達(dá)

3討論

HO-1在體外培養(yǎng)細(xì)胞和體內(nèi)均具有神經(jīng)保護(hù)作用。 各種毒性刺激因素作用于神經(jīng)或非神經(jīng)腦細(xì)胞后，HO-1的表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而參與對氧化應(yīng)激損傷的抑制作用。因此，篩選出能夠上調(diào)HO-1表達(dá)的天然抗氧化劑成為近年的研究熱點。研究顯示AS具有許多藥理學(xué)活性，具有肝保護(hù)活性、抗凋亡活性和抗氧化活性〔6～8〕。最近研究表明AS具有神經(jīng)保護(hù)活性，其可以抑制1-甲基-4-苯基吡啶(MPP+)和谷氨酸誘導(dǎo)的神經(jīng)損傷〔9,10〕。另外，AS也可抑制魚藤酮致SH-SY5Y細(xì)胞損傷〔11〕，并在MPTP所致的帕金森病小鼠模型具有神經(jīng)保護(hù)作用〔12〕。AS可降低tau蛋白的磷酸化而在岡田酸誘導(dǎo)的阿爾茨海默病細(xì)胞模型中發(fā)揮其神經(jīng)保護(hù)作用〔13〕。目前AS的保護(hù)作用機制主要集中在其抗氧化〔14〕、抗凋亡活性〔7〕。其藥理學(xué)活性機制有待于進(jìn)一步深入研究。本研究表明，AS可以在神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)誘導(dǎo)HO-1的表達(dá)，同時也表明AS可通過血腦屏障進(jìn)入大腦內(nèi)。而且AS也可在外周組織中上調(diào)HO-1的表達(dá)。

綜上所述，鑒定出AS為一個新的誘導(dǎo)HO-1表達(dá)的化合物。本研究闡明了AS的新的藥理作用，為進(jìn)一步探討其神經(jīng)保護(hù)作用機制奠定了前期的基礎(chǔ)。

4參考文獻(xiàn)

1Takahashi T,Morita K,Akagi R,etal.Heme oxygenase-1:a novel therapeutic target in oxidative tissue injuries〔J〕.Curr Med Chem,2004;11(12):1545-61.

2Valko M,Leibfritz D,Moncol J,etal.Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease〔J〕.Int J Biochem Cell Biol,2007;39(1):44-84.

3石曉東,尹聞科,張雄,等.姜黃素對SH-SY5Y細(xì)胞血紅素加氧酶同工酶表達(dá)的影響〔J〕.中國藥理學(xué)通報,2010;26(6):740-4.

4王洪權(quán),王玉敏,趙偉麗,等.蝦青素通過ERK1/2通路誘導(dǎo)血紅素加氧酶-1表達(dá)〔J〕.中國老年學(xué)雜志,2013;33(24):6210-2.

5Wang H,Xu Y,Yan J,etal.Acteoside protects human neuroblastoma SH-SY5Y cells against beta-amyloid-induced cell injury〔J〕.Brain Res,2009;1283(2):139-47.

6Xiong Q,Hase K,Tezuka Y,etal.Acteoside inhibits apoptosis in D-galactosamine and lipopolysaccharide-induced liver injury〔J〕.Life Sci,1999;65(4):421-30.

7Pu X,Song Z,Li Y,etal.Acteoside from Cistanche salsa inhibits apoptosis by 1-methyl-4-phenylpyridinium ion in cerebellar granule neurons〔J〕.Planta Med,2003;69(1):65-6.

8Chiou WF,Lin LC,Chen CF.Acteoside protects endothelial cells against free radical-induced oxidative stress〔J〕.J Pharm Pharmacol,2004;56(6):743-8.

9Li YY,Lu JH,Li Q,etal.Pedicularioside A from Buddleia lindleyana inhibits cell death induced by 1-methyl-4-phenylpyridinium ions(MPP+) in primary cultures of rat mesencephalic neurons〔J〕.Eur J Pharmacol,2008;579(1-3):134-40.

10Koo KA,Kim SH,Oh THetal.Acteoside and its aglycones protect primary cultures of rat cortical cells from glutamate-induced excitotoxicity〔J〕.Life Sci,2006;79(7):709-16.

11高燕,蒲小平.類葉升麻苷抗魚藤酮致SH-SY5Y細(xì)胞損傷機制的研究〔J〕.中國藥理學(xué)通報,2007;23(2):161-5.

12趙磊,蒲小平.類葉升麻苷對MPTP所致帕金森病小鼠模型的神經(jīng)保護(hù)作用〔J〕.中國藥理學(xué)通報,2007;23(1):42-6.

13白鵬,彭曉明,高莉,等.類葉升麻苷對岡田酸誘導(dǎo)的阿爾茨海默病細(xì)胞模型的保護(hù)作用研究〔J〕.中國中藥雜志,2013;38(9):1323-6.

14彭曉明,高莉,甘萍,等.類葉升麻苷抗H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用〔J〕.中藥藥理與臨床,2013;29(3):35-8.

〔2013-09-15修回〕

(編輯袁左鳴)