·論著·

高原低氧環(huán)境下急性壞死性胰腺炎大鼠胰腺及肝臟損害的研究

朱海宏袁冬林吳新民郭亞民葉謝智華葉成杰

【摘要】目的觀察高原低氧環(huán)境下急性壞死性胰腺炎(ANP)大鼠胰腺及肝功能損害程度，為臨床更好地診治高原地區(qū)重癥急性胰腺炎(SAP)患者提供參考。方法96只SPF級雄性Wistar大鼠分別在海拔1 500、3 300、4 300 m高度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。采用胰腺被膜下注射牛磺膽酸鈉的方法制備ANP模型，以僅翻動胰腺數(shù)次后關(guān)腹的大鼠作為假手術(shù)組。假手術(shù)組在術(shù)后6 h處死，ANP組在造模后6、12、24 h分批處死。取血檢測血清淀粉酶活性，取胰腺及肝臟常規(guī)行組織病理學(xué)檢查，并進(jìn)行病理評分。結(jié)果假手術(shù)組大鼠的血清淀粉酶活性無明顯變化，胰腺及肝臟無明顯組織病理改變。同一海拔高度，ANP組各時間點(diǎn)大鼠的血清淀粉酶活性、胰腺及肝臟病理評分均顯著高于假手術(shù)組，ANP 12、24 h組大鼠的血清淀粉酶活性、胰腺及肝臟病理評分均顯著高于ANP 6 h組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)。海拔3 300、4 300 m高度的ANP各時間點(diǎn)組大鼠的胰腺及肝臟病理評分均顯著高于海拔1 500 m高度的同時間點(diǎn)組大鼠，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)，但血清淀粉酶活性的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論隨著海拔高度的增加，ANP大鼠的胰腺及肝臟的病理損害呈持續(xù)性加重。

【關(guān)鍵詞】胰腺炎，急性壞死性；高原；缺氧；大鼠；肝損傷

DOI:10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2015.02.008

基金項(xiàng)目：青海省科技廳資助項(xiàng)目(2002-N-122)；青海省科技廳應(yīng)用基礎(chǔ)資助項(xiàng)目(2014-ZJ-745)

收稿日期：(2014-12-17)

Pancreas and liver damage of acute necrotizing pancreatitis rats under hypoxia plateauZhuHaihong,YuanDonglin,WuXinmin,GuoYanmin,YeXiezhihua,YeChengjie.DepartmentofGeneralSurgery,People′sHospitalofQinghaiProvice,Xining810007,China

Correspondingauthor:WuXinmin,Email:zhuhaihong1214@126.com

Abstract【〗ObjectiveTo investigate the extent of pancreatic and liver function damage of acute necrotizing pancreatitis (ANP) rats under altitude hypoxia environment, and to provide a reference for better diagnosis and treatment of severe acute pancreatitis (SAP) in the plateau region. MethodsNinety-six specific pathogen free (SPF) Wistar male rats were involved in 1 500 meters, 3 300 meters and 4 300 meters altitude. The model of ANP was established by using pancreatic capsule injection of sodium taurocholate (Na-Tc). In the sham operation group, the rats′ belly was opened and closed after only flipping its pancreas several times. Rats in sham group were sacrificed at 6 h, and ANP group were sacrificed at 6, 12, 24 h after modeling. Serum amylase activity was measured, and pancreas and liver tissue were harvested for pathological examination and score. ResultsSerum amylase activity in sham operation group rats was not remarkably changed, and pathological changes of pancreas and liver were not obvious. At same altitude, serum amylase activity, pancreas and liver pathology score of ANP rats at each time point were significantly higher than those in the sham operation group; and serum amylase activity, pancreas and liver pathology scores of ANP 12, 24 h group rats were significantly higher than those of ANP 6h group; and the difference was statistically significant (P<0.05). At 3 300 meters, 4 300 meters altitude, the pancreas and liver pathology scores of ANP rats at each time point were significantly higher than those at 1 500meters altitude, and the differences were statistically significant (P<0.05), but the difference in serum amylase activity was not statistically significant.

作者單位：810007西寧，青海省人民醫(yī)院普外科(朱海宏、吳新民、郭亞民、葉謝智華、葉成杰)；青海省格爾木市藥品管理中心(袁冬林)

通信作者：吳新民，Email: zhuhaihong1214@126.com

ConclusionsWith the increase of altitude, pancreatic and liver pathological damage of ANP rats shows continuing aggravation.

【Key words】Pancreatitis, acute necrotizing;Plateau;Anoxia;Rats;Liver injury

急性胰腺炎(acute pancreatitis, AP)是常見的消化系急癥，多數(shù)屬自限性。約15%～30%患者臨床經(jīng)過兇險，發(fā)展為重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis, SAP),死亡率極高[1]。急性肝、腎、肺損傷是SAP最常見且嚴(yán)重的并發(fā)癥, 但其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明[2]。 高原地區(qū)受缺氧、低氣壓等綜合暴露因素影響，更增加了該病的許多不確定因素。為此，本研究在高原地區(qū)制備急性壞死性胰腺炎(acute necrotizing pancreatitis, ANP)大鼠模型，檢測大鼠血清淀粉酶水平，觀察大鼠胰腺及肝臟組織病理學(xué)的改變，探討高原低氧環(huán)境下ANP大鼠的特征，為更好地診治高原地區(qū)SAP患者提供參考。

資料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動物及ANP模型制備

SPF級健康雄性Wistar大鼠96只，3～4月齡，體質(zhì)量(200±20)g，由甘肅中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供。實(shí)驗(yàn)動物許可證號SCXK2004-0006，編號0000886。大鼠用北京科奧協(xié)力飼料有限公司提供的專用飼料喂養(yǎng)，自由攝食和飲水。按數(shù)字表法隨機(jī)將大鼠置于3個海拔高度，即海拔1 500、3 300、4 300 m進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。每個海拔高度的大鼠再按數(shù)字表法隨機(jī)分成假手術(shù)組及ANP 6、12、24 h組，每組8只。在海拔3 300、4 300 m實(shí)驗(yàn)的大鼠先在該高度適應(yīng)20 d后再進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

各組大鼠術(shù)前禁食12 h，自由飲水。用22%烏拉坦(4 ml/kg體質(zhì)量)腹腔注射麻醉。將大鼠仰臥固定于手術(shù)臺上，消毒手術(shù)域。進(jìn)入腹腔，分別在胰頭、胰體以及胰尾部多點(diǎn)緩慢注射5%牛黃膽酸鈉，總量為1 ml/kg體質(zhì)量。假手術(shù)組在打開腹腔后僅翻動胰腺數(shù)次后關(guān)腹。大鼠清醒后自由飲水。保持環(huán)境溫度>37℃。假手術(shù)組于術(shù)后6 h全部處死，ANP各組在相應(yīng)時間點(diǎn)處死。解剖大鼠，觀察胰腺、肝臟大體病理變化；經(jīng)腹主動脈采血3 ml注入密封的促凝采血管中靜置1 h，以3 000 r/min低溫離心10 min，收集血清；取部分胰腺和肝臟組織浸泡于10%甲醛液固定備用。

二、檢測指標(biāo)

1．血清淀粉酶活性測定：應(yīng)用日立7600全自動生化分析儀測定各組大鼠血清淀粉酶活性。

2．大鼠胰腺及肝臟組織病理學(xué)檢查：固定的胰腺及肝臟組織常規(guī)石蠟包埋、切片，行HE染色。由兩位病理科醫(yī)師采用雙盲法讀片，并采用改良Grewal評分從水腫、壞死、炎癥、出血4個方面對胰腺組織進(jìn)行評分[3]。參考文獻(xiàn)[4]的標(biāo)準(zhǔn)，在高倍鏡下隨機(jī)選取2個視野，觀察肝細(xì)胞有無氣球變性、脂肪變性、胞質(zhì)凝聚、水樣變性和細(xì)胞壞死等病變。肝細(xì)胞大致正常為0分，病變肝細(xì)胞占整個視野的1/4為1 分，占整個視野的2/4為2分，占整個視野的3/4為3分，占整個視野為4分。累計(jì)所觀察視野的病變總分，其中肝細(xì)胞壞死以2倍評分計(jì)算[4]。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié)　　果

一、血清淀粉酶活性變化

同一海拔高度，ANP各時間點(diǎn)組大鼠的血清淀粉酶活性均顯著高于假手術(shù)組，ANP 12、24 h組大鼠的血清淀粉酶活性均顯著高于ANP 6 h組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05，表1)。但假手術(shù)組及ANP各時間點(diǎn)組大鼠的血清淀粉酶活性在不同海拔高度的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05，表1)。

二、胰腺組織病理改變

1．大體觀察：假手術(shù)組大鼠胰腺光澤度良好，無水腫，胃腸無擴(kuò)張，腹腔內(nèi)無腹水。ANP 6 h組大鼠胰腺呈暗紅色，無光澤，表面水腫，有的大鼠胰腺有出血，有腹水； 12 h組大鼠胰腺水腫、出血明顯，胰腺及網(wǎng)膜組織有少量皂化斑，血性腹水形成； 24 h組大鼠有大量血性腹水，胰腺廣泛出血、壞死，胰腺及網(wǎng)膜組織多處皂化斑，胃腸擴(kuò)張，明顯充血，腸內(nèi)滯留大量液體。

2．組織病理學(xué)改變：假手術(shù)組大鼠胰腺腺泡結(jié)構(gòu)正常，排列緊密；海拔1 500 m高度ANP 24 h組大鼠胰腺的葉間隙、腺泡間隙、細(xì)胞間隙均增寬，血管內(nèi)充血，血管周圍有炎細(xì)胞滲出；海拔3 300 m高度ANP 24 h組大鼠胰腺腺泡細(xì)胞空泡樣變性，腺小葉結(jié)構(gòu)破壞，大片出血，胰腺實(shí)質(zhì)內(nèi)可見散在的點(diǎn)片狀壞死，腺泡間大量炎細(xì)胞浸潤；海拔4 300 m高度ANP 24 h組大鼠胰腺大片壞死，有的整個小葉壞死，壞死區(qū)域腺泡結(jié)構(gòu)消失，細(xì)胞玻璃樣變、核溶解消失，胰周脂肪壞死(圖1)。

表1　假手術(shù)組和ANP組大鼠不同海拔高度的血清淀粉酶活性變化 ± s)

注：與假手術(shù)組比較，aP<0.05；與同海拔高度ANP 6 h組比較，bP<0.05

圖1　假手術(shù)組(1A)及海拔1 500(1B)、3 300(1C)、4 300 m(1D)高度ANP 24 h組大鼠的胰腺組織病理表現(xiàn)(HE　×100)

同一海拔高度，ANP各時間點(diǎn)組大鼠的胰腺病理評分均顯著高于假手術(shù)組，ANP 12、24 h組大鼠的胰腺病理評分均顯著高于ANP 6 h組；海拔3 300、4 300 m高度的ANP各時間點(diǎn)組大鼠的胰腺病理評分均顯著高于海拔1 500 m高度的同時間點(diǎn)組大鼠，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05，表2)。

三、肝臟組織病理改變

1．大體觀察：假手術(shù)組大鼠肝臟外觀無明顯變化。ANP 6 h組大鼠肝臟充血，部分肝臟出血；12 h組大鼠肝臟充血、出血加重；24 h組大鼠肝表面可見散在、可疑的壞死灶。

2．組織病理學(xué)改變：假手術(shù)組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞形態(tài)正常；海拔1 500 m高度ANP 24 h組大鼠肝竇大致正常，肝細(xì)胞胞質(zhì)伊紅染色變淡，范圍略擴(kuò)張，偶見嗜酸小體，部分肝細(xì)胞胞質(zhì)出現(xiàn)小圓形空泡樣變性(似脂肪變性)；海拔3 300 m高度ANP 24 h組大鼠肝細(xì)胞腫脹，個別小葉中央靜脈周圍肝細(xì)胞呈缺血樣改變；海拔4 300 m高度ANP 24 h組大鼠肝臟出現(xiàn)壞死灶，灶內(nèi)可見嗜酸性變肝細(xì)胞及腫脹巨噬細(xì)胞(圖2)。

同一海拔高度，ANP各時間點(diǎn)組大鼠的肝臟病理評分均顯著高于假手術(shù)組，ANP 12、24 h組大鼠的肝臟病理評分均顯著高于ANP 6 h組；海拔3 300、4 300 m高度的ANP各時間點(diǎn)組大鼠的肝臟病理評分均顯著高于海拔1 500 m高度的同時間點(diǎn)組大鼠，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05，表3)。

表2　假手術(shù)組和ANP組大鼠胰腺組織的病理評分 ± s)

注：與假手術(shù)組比較，aP<0.05；與同海拔高度ANP 6 h組比較，bP<0.05；與海拔1 500 m高度的同組比較，cP<0.05

圖2　假手術(shù)組(2A)及海拔1 500(2B)、3 300(2C)、4 300(2D)高度ANP 24 h組大鼠的肝組織病理表現(xiàn)(HE　×400)

組 別海拔1500m海拔3300m海拔4300mF值P值假手術(shù)組0.40±0.090.42±0.110.50±0.091.960.175ANP 6h組0.95±0.05a1.27±0.20ac1.39±0.20ac11.270.005 12h組1.94±0.09ab2.34±0.35abc2.85±0.13abc25.17<0.005 24h組2.69±0.32ab3.32±0.31abc3.82±0.99abc27.54<0.005F值204.66140.70701.86P值<0.05<0.05<0.05

注：與假手術(shù)組比較，aP<0.05；與同海拔高度ANP 6 h組比較，bP<0.05；與海拔1 500 m高度的同組比較，cP<0.05

討　　論

AP時，在各種致病因子的作用下，胰消化酶原，如彈力蛋白酶、激肽酶、脂肪酶等被激活，可破壞血管壁、擴(kuò)張血管及增加血管壁通透性，引起出血、血栓形成及微循環(huán)障礙，導(dǎo)致胰腺缺血缺氧。微循環(huán)的改變是SAP早期重要的病理生理過程，它不僅僅發(fā)生于胰腺，而且涉及到眾多器官諸如肝臟、肺臟和腸道等，肝臟的微循環(huán)的變化參與了肝組織損傷的發(fā)生發(fā)展過程[5]。

高原氣候的主要特點(diǎn)是低氣壓、低氧分壓、寒冷、干旱、多風(fēng)、輻射強(qiáng)和溫差大。在高原，大氣壓和氧分壓隨著海拔高度的增加而逐級降低[6]。高原低氧可激活凝血通路，抑制纖溶酶原活性，使血液呈高凝和低纖溶狀態(tài)[7-8]。高原低氧可促使兒茶酚胺及腎素分泌增多，加之血液黏稠、無形失水較多和血液重分布等因素將加劇上述病理生理變化[9-10]。本研究結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠血清淀粉酶活性及胰腺組織結(jié)構(gòu)并未隨海拔高度的增高而發(fā)生變化。然而AP組大鼠的胰腺損傷卻隨著海拔高度的增高而加重，這與空氣中氧含量的明顯下降有關(guān)。

肝臟是人體內(nèi)最重要的生物轉(zhuǎn)化器官，其許多功能均需耗氧，缺氧必然影響其正常功能發(fā)揮。有研究報道[11]，海拔3 800～4 080 m地區(qū)的土生狗或藏系綿羊肝臟的肝細(xì)胞呈輕中度腫脹，部分肝細(xì)胞見脂肪變性或點(diǎn)狀與小灶性肝細(xì)胞壞死，另外部分肝細(xì)胞內(nèi)有膽色素沉著，電鏡下除見肝細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)腫脹與變性外，還可見貯脂細(xì)胞脂質(zhì)有較多脂滴，部分呈空泡樣或空圈化變，且隨海拔的升高愈趨明顯。此外，內(nèi)毒素還可介導(dǎo)炎性因子的產(chǎn)生，激活凝血系統(tǒng)或使門靜脈強(qiáng)烈收縮，使肝臟血灌流不足，肝細(xì)胞嚴(yán)重缺氧，肝臟正常代謝和解毒功能發(fā)生嚴(yán)重障礙[12]。本研究結(jié)果顯示，AP組大鼠的肝臟損傷也隨海拔高度的增高而加重。

因此，在高原環(huán)境下特別是隨著海拔梯度的升高，人類全身各系統(tǒng)炎癥反應(yīng)明顯加重。在高原環(huán)境下發(fā)生的AP尤其是SAP亦更加嚴(yán)重，應(yīng)引起臨床醫(yī)師的重視。

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(本文編輯：呂芳萍)

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