miR-21在周圍神經(jīng)損傷時調控雪旺細胞凋亡*

陸新華，王輝△，寧昕杰，羅駿成，梁家驥

(中山大學附屬第三醫(yī)院神經(jīng)外科，廣東 廣州 510630)

[摘要]目的： 探討周圍神經(jīng)損傷時，微小RNA-21(microRNA-21,miR-21)與雪旺細胞(SC)凋亡的關系及相關分子機制。 方法: 采用實時熒光定量PCR(real-time PCR)檢測動物模型中miR-21以及人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因(phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome 10，PTEN)的表達情況；通過將miR-21類似物(miR-21-mimic)、miR-21抑制物(miR-21-inhibitor)和陰性對照miRNA(negative control miRNA，NC-miRNA)轉染入RSC96細胞中，構建出過表達miR-21的雪旺細胞株(MI-SC)、抑制miR-21表達的雪旺細胞株(IN-SC)及表達對照miRNA的雪旺細胞株(NC-SC)；采用流式細胞儀檢測3組細胞的凋亡情況； real-time PCR檢測3組細胞中miR-21以及PTEN的表達情況；Western blot檢測3組細胞中PTEN及凋亡相關蛋白激活型caspase-3(cleaved caspase-3)的表達情況。結果: 神經(jīng)損傷組miR-21的表達量與對照組相比明顯升高，神經(jīng)損傷組PTEN mRNA的表達水平與對照組相比明顯降低；與NC-SC相比，上調miR-21組細胞的凋亡比例減少，PTEN mRNA及蛋白的表達水平降低，cleaved caspase-3的表達水平降低，下調miR-21組細胞的凋亡比例增加，PTEN mRNA及蛋白的表達水平升高，cleaved caspase-3的表達水平升高(P<0.05)。結論: miR-21可能通過下調PTEN的表達抑制雪旺細胞的凋亡，從而可能在周圍神經(jīng)的損傷修復中發(fā)揮作用。

[關鍵詞]周圍神經(jīng)損傷； 微小RNA-21； 雪旺細胞； 細胞凋亡

[中圖分類號]R363[文獻標志碼]A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.11.020

[文章編號]1000-4718(2015)11-2053-06

[收稿日期]2015-04-29[修回日期] 2015-07-28

[基金項目]*國家自然科學基金資助項目(No. 81173580)

通訊作者△Tel: 0411-87586009; E-mail: jingxianyang@yahoo.com

miR-21 inhibits apoptosis of Schwann cells following peripheral nerve injuryLU Xin-hua, WANG Hui, NING Xin-jie, LUO Jun-cheng, LIANG Jia-ji

(DepartmentofNeurosurgery,TheThirdAffiliatedHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510630,China.E-mail:doctorwanghui@126.com)

ABSTRACT[]AIM: To explore the relationship and molecular mechanism between microRNA-21(miR-21) and Schwann cells (SC) following peripheral nerve injury. METHODS: The mRNA expression of miR-21 and phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome ten (PTEN) in animal model were detected by real-time PCR. The over-expression of miR-21 and inhibition of miR-21 expression in the Schwann cells according to transfection of lentiviral vectors were performed, the nonspecific miRNA was used as a negative control (NC). The cell apoptosis was measured by flow cytometry. The mRNA expression of miR-21 and PTEN in the cells was detected by real-time PCR. The protein expression of PTEN and cleaved caspase-3 was determined by Western blot. RESULTS: The level of miR-21 was significantly higher and the mRNA level of PTEN was significantly lower in the model of nerve injury than those in control group. miR-21 over-expression decreased the number of apoptotic Schwann cells compared with NC-SC. The mRNA expression of PTEN was down-regulated by over-expression of miR-21. The protein expression of PTEN and cleaved caspase-3 was down-regulated by over-expression of miR-21 (P<0.05). CONCLUSION: miR-21 may play an important role in the peripheral nerve injury through inhibiting apoptosis of Schwann cells by down-regulating the expression of PTEN.

[KEY WORDS]Peripheral nerve injury; MicroRNA-21; Schwann cells; Apoptosis

眾所周知，周圍神經(jīng)損傷后是可修復再生的，而作為周圍神經(jīng)系統(tǒng)的主體細胞，雪旺細胞(Schwann cells ，SC)在其中發(fā)揮了重要作用。周圍神經(jīng)損傷后,SC十分活躍[1-2]，包括增殖并趨化巨噬細胞、分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子及細胞外基質及與再生軸突形成縫隙連接和緊密連接等。這對于維持神經(jīng)元的存活，引導軸突再生，促進髓鞘成熟至關重要，從而在周圍神經(jīng)修復再生中發(fā)揮作用。然而由于內外環(huán)境因素的影響，以及對其修復再生的機制尚未完全清楚，加之周圍神經(jīng)特殊的解剖結構和功能，使得目前臨床采用的各種神經(jīng)修復及吻合技術效果都不十分理想，功能恢復欠佳[3]。為此，周圍神經(jīng)損傷后修復再生的影響因素及細胞分子機制還有待進一步研究。

微小RNA(microRNA,miRNA)是近年來新發(fā)現(xiàn)的一類非編碼小分子RNA，長度約為22～28個核苷酸，廣泛存在于真核生物中。miRNA通過與靶mRNA的3’UTR完全或不完全的互補結合，導致靶mRNA降解或翻譯抑制，從而調控靶基因的表達，影響細胞增殖、分化和凋亡[4]。有研究指出，在神經(jīng)系統(tǒng)領域，miRNA參與細胞生長、增殖、分化、遷移、凋亡[5]以及神經(jīng)突再生[6]。miRNA在周圍神經(jīng)再生中的作用近年來也受到關注[7-8]。有研究指出，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后，如脊髓挫裂傷、創(chuàng)傷性腦損傷以及腦缺血后，miR-21的表達量升高[9-14]，而在周圍神經(jīng)系統(tǒng)，切斷大鼠坐骨神經(jīng)后，miR-21的表達明顯升高，且能促進軸突再生[15-16]。我們前期的研究工作已證實miR-21可在SC中表達[17]。然而目前的研究均未對miR-21與SC的關系及分子機制進行深入探討。

本實驗中，我們旨在研究miR-21對SC凋亡的調控及分子機制。通過研究我們發(fā)現(xiàn)，miR-21可能通過下調人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因(phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome 10，PTEN)的表達抑制雪旺細胞的凋亡，從而可能在周圍神經(jīng)損傷的修復再生中發(fā)揮作用。

材料和方法

1材料

30只150～180 g雄性實驗用SD大鼠購自中山大學北校區(qū)動物實驗中心；RSC96雪旺細胞株購自中國科學院細胞庫；DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清(HyClone)；RNA抽提試劑、RNA逆轉錄試劑盒、SYBR Premix Ex TaqTM熒光定量PCR試劑盒(TaKaRa)；miR-21、U6、PTEN、GAPDH逆轉錄引物及引物對(上海吉瑪生物公司)；Lipofectamine 2000、miR-21類似物(mimic)、抑制物(inhibitor)及陰性對照序列(negative control miRNA， NC- miRNA)(Invitrogen)；細胞凋亡檢測試劑盒Annexin V-PE/7-AAD、全蛋白提取試劑盒、BCA蛋白含量檢測試劑盒、ECL檢測試劑盒(南京凱基生物公司)；PTEN和cleaved caspase-3兔抗鼠單克隆抗體(CST)；GAPDH兔抗鼠多克隆抗體(廣州杰特偉生物公司)；HRP標記羊抗兔IgG(北京博奧森生物公司)；0.22 μm PVDF膜(Millipore)。

2方法

2.1神經(jīng)損傷模型建立將30只雄性成年SD大鼠隨機分為神經(jīng)損傷組、假手術組和正常對照組。靜脈復合麻醉，左下肢做縱切口，逐層分離，暴露坐骨神經(jīng)上段。損傷模型組分離外膜后完全橫斷坐骨神經(jīng)后逐層縫合組織；假手術組逐層暴露坐骨神經(jīng)后縫合組織；正常對照組不做處理。7 d后檢測miR-21以及PTEN的mRNA表達水平。

2.2細胞培養(yǎng)RSC96細胞用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，含EDTA的0.25%胰酶消化傳代。

2.3細胞轉染將狀態(tài)良好、對數(shù)生長期RSC96細胞于轉染前24 h接種于6孔板中，培養(yǎng)至細胞達80%融合度時進行細胞轉染，嚴格按照操作說明將帶有綠色熒光蛋白的miR-21-mimic、miR-21-inhibitor和NC-miRNA轉染入RSC96細胞中，構建出過表達miR-21的SC株(MI-SC)、抑制miR-21表達的SC株(IN-SC)及表達對照miRNA的SC株(NC-SC)。37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，倒置相差顯微鏡觀察拍攝，采用Image J software進行GFP陽性細胞數(shù)檢測。

2.4流式細胞術檢測細胞凋亡用不含EDTA的胰酶消化收集細胞。用預冷的PBS洗滌細胞2次，每次均在2 000 r/min,離心5 min，收集(1～5)×105細胞。在50 μL的binding buffer中加入5 μL 7-AAD染液，混勻；收集細胞中加入上述7-AAD染液，混勻，室溫，避光反應5～15 min；反應后再加450 μL的binding buffer混勻；加入1 μL Annexin V-PE混勻，室溫，避光反應5～15 min；樣品在1 h 內用流式細胞儀檢測。結果用FlowJo軟件分析，Q2代表早期凋亡，Q3代表晚期凋亡。

2.5Real-time PCR檢測細胞中miR-21以及PTEN的表達提取RNA：用TRIzol提取細胞及組織總RNA，經(jīng)分光光度計檢測，A260/A280值為1.8～2.0的用于cDNA合成。逆轉錄反應:按說明進行，反應條件為：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。PCR按說明進行，反應條件為：95 ℃30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，擴增40個循環(huán)。miR-21以及PTEN的相對表達量采用2-ΔΔCt法計算。miR-21相對表達量：ΔCt=CtmiR-21-CtU6，ΔΔCt=ΔCt實驗組-ΔCt對照組；PTEN相對表達量：ΔCt=CtPTEN-CtGAPDH，ΔΔCt=ΔCt實驗組-ΔCt對照組。miR-21、PTEN、U6和GAPDH相應的逆轉錄引物以及PCR引物系列[10]見表1。

表1　miR-21、PTEN、U6和GAPDH的引物系列

2.6Western blot檢測PTEN及凋亡相關蛋白cleaved caspase- 3的表達收集細胞，用全蛋白提取試劑盒提取蛋白質樣品。用BCA法在酶標儀上用A562 nm波長測定總蛋白濃度。樣本經(jīng)過SDS-PAGE分離蛋白后，再用電轉儀以200 mA 恒流90 min轉印至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，TBST洗膜3次, 每次5 min,分別加入cleaved caspase-3、PTEN和GAPDH的 I 抗，4 ℃搖床孵育過夜，TBST洗膜3次，每次5 min。再加HRP標記的Ⅱ抗室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，每次5 min。ECL化學發(fā)光試劑盒顯影。

3統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，所得數(shù)據(jù)均采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行分析。3組之間均數(shù)的比較采用單因素方差分析及Bonferroni法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

1miR-21以及PTEN在神經(jīng)組織中的表達

Real-time PCR檢測結果顯示神經(jīng)損傷組中miR-21的表達量明顯高于假手術組和正常對照組(P<0.01)；但PTEN的表達量明顯低于假手術組和正常對照組(P<0.05)；假手術組和正常對照組中miR-21以及PTEN的表達量相近，見圖1。

Figure 1.The relative expression of miR-21 was higher but the mRNA relative expression of PTEN was lower in model group than those in control groups. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0. 01vsmodel group．

圖1Real-time PCR檢測神經(jīng)組織中miR-21以及PTEN的表達

2miR-21在3組細胞中的表達

倒置相差顯微鏡拍攝細胞轉染結果顯示，3 組細胞的轉染率均在90%以上，見圖2。MI-SC細胞中miR-21表達量明顯高于NC-SC細胞，IN-SC細胞中miR-21表達量明顯低于NC-SC細胞，(P<0.01)，見圖3。

Figure 2.Transfection efficiency of miR-21 in NC-SC cells, MI-SC cells and IN-SC cells(×100).

圖2NC-SC、MI-SC和IN-SC 3組細胞的轉染情況

Figure 3.The relative expression of miR-21 in NC-SC, MI-SC and IN-SC cells was detected by real-time PCR. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsNC-SC group．

圖3Real-time PCR檢測NC-SC、MI-SC和IN-SC 3組細胞中miR-21的表達

3miR-21對SC凋亡的影響

流式細胞術檢測細胞凋亡的結果顯示，IN-SC細胞凋亡比例明顯高于NC-SC細胞，MI-SC細胞凋亡比例明顯低于NC-SC細胞(P<0.05)，見圖4。

4miR-21對細胞中PTEN mRNA表達水平的影響

MI-SC細胞中PTEN的表達量明顯低于NC-SC細胞(P<0.01)，而IN-SC細胞中PTEN的表達量高于NC-SC細胞(P<0.05),見圖5。

5miR-21對細胞中PTEN及cleaved caspase- 3蛋白表達水平的影響

Western blot 檢測結果顯示，與NC-SC組細胞相比，MI-SC組細胞中的PTEN和cleaved caspase-3 蛋白表達量明顯下降(P<0.01)；與NC-SC組細胞相比，IN-SC組細胞中的PTEN和cleaved caspase-3 蛋白表達量明顯升高(P<0.05)，見圖6。

討論

周圍神經(jīng)損傷后修復再生是神經(jīng)科學的重點也是難點[18]。SC作為周圍神經(jīng)系統(tǒng)的主體細胞，在周圍神經(jīng)損傷修復再生中發(fā)揮著重要作用[1-2]，可以說，周圍神經(jīng)修復再生的研究在相當程度上是對SC的研究。然而目前對于SC的認識仍比較膚淺，如SC凋亡的分子調控機制如何?其下游的具體信號通路如何?這些都還有待進一步研究。

有研究指出，miRNA可能在周圍神經(jīng)的損傷修復中發(fā)揮重要作用，坐骨神經(jīng)損傷后，損傷處miR-21的表達量升高最明顯[15-16]。miR-21是一種位于17q23.2染色體FRA17B脆性區(qū)域上,且具有自主轉錄單位的miRNA[19]，大量實驗證明在多種腫瘤細胞中miR-21的表達均出現(xiàn)顯著異常，參與調控多種抑癌基因的表達，提示miR-21作為一個致癌miRNA，在多種腫瘤疾病的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用[20]。此外，也有研究指出，miR-21可能在心血管疾病、腎臟疾病以及免疫系統(tǒng)疾病中發(fā)揮作用[21]。然而它是如何在周圍神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮作用以及作用機制如何尚不清楚。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)過表達miR-21能夠抑制SC的凋亡，這或許是它在周圍神經(jīng)修復再生中發(fā)揮作用的關鍵。

進一步研究我們發(fā)現(xiàn)，miR-21可能通過下調PTEN的表達從而抑制SC的凋亡。有研究指出，大約有2/3的miR-21的潛在靶基因與細胞凋亡的信號通路相關[22]。利用miRander、PicTar和TargetScan 3種miRNA常用靶基因預測軟件對miR-21的靶基因進行預測，查閱相關文獻，以及利用KEGG信號通路數(shù)據(jù)庫對預測基因進行分析，我們發(fā)現(xiàn)，PTEN與細胞的生長及凋亡關系密切。PTEN基因是第1個具有雙特異性磷酸酶活性的抑癌基因，不僅參與細胞周期的調控，而且調節(jié)細胞的正常生長和發(fā)育，最終促進細胞凋亡。大量的研究已證明PTEN主要通過使3,4,5,-三磷酸脂酰肌醇去磷酸化，達到阻止細胞生長和促進細胞凋亡的目的。PTEN基因是繼p53之后,另一個在腫瘤細胞中突變與缺失較為廣泛，與細胞的生長及凋亡關系密切的抑癌基因。近來有研究指出，在結直腸癌中，過表達PTEN聯(lián)合鋰可以促進細胞凋亡[23]。本研究中，過表達miR-21后PTEN的mRNA及蛋白表達水平明顯降低，其下游的細胞凋亡相關蛋白cleaved caspase-3的表達量也明顯降低，而下調miR-21后PTEN的mRNA及蛋白表達水平明顯升高，其下游的細胞凋亡相關蛋白cleaved caspase-3的表達量也明顯升高。

Figure 4.The effects of miR-21 transfection on the apoptosis of Schwann cells detected by flow cytometry．Mean±SD.n=3.*P<0.05vsNC-SC group.

圖4流式細胞術檢測3組細胞的凋亡情況

Figure 5.The relative expression of PTEN in NC-SC, MI-SC and IN-SC cells was detected by real-time PCR. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsNC-SC group．

圖5Real-time PCR檢測NC-SC、MI-SC和IN-SC 3組細胞中PTEN的表達

Figure 6.The relative expression of PTEN and cleaved caspase-3 in NC-SC, MI-SC and IN-SC cells detected by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsNC-SC group．

圖6Western blot檢測NC-SC、MI-SC和IN-SC 3組細胞中PTEN及cleaved caspase-3的蛋白表達

總之，通過實驗我們發(fā)現(xiàn)，miR-21可以通過下調PTEN的表達減少雪旺細胞的凋亡，從而可能在周圍神經(jīng)修復再生中發(fā)揮作用。由于目前尚處于體外實驗階段，對于miR-21能否在體內促進神經(jīng)修復再生，還有待實驗進一步驗證。

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(責任編輯： 陳妙玲， 余小慧)