·論著·

1,25-二羥維生素D3對(duì)人系膜細(xì)胞增殖作用的影響

楊銳,尹璇,張昊,陳建平,馬莉,張春江,楊曉萍

作者單位：832000新疆石河子市，石河子大學(xué)(楊銳,尹璇,張昊,陳建平,馬莉)；石河子大學(xué)第一附屬醫(yī)院腎病科(張春江,楊曉萍)

通信作者：楊曉萍，832000新疆石河子市，石河子大學(xué)第一附屬醫(yī)院腎病科；E-mail:sbkyxp@163.com

【摘要】目的通過(guò)觀察1,25-二羥維生素D3〔1,25(OH)2D3〕對(duì)Ki-67抗原表達(dá)的影響，探討其對(duì)人系膜細(xì)胞增殖的抑制作用。方法體外培養(yǎng)人腎小球系膜細(xì)胞，隨機(jī)分為正常對(duì)照組、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)組、1,25(OH)2D3組及EGF聯(lián)合1,25(OH)2D3組，培養(yǎng)48 h后，應(yīng)用免疫熒光技術(shù)和熒光定量PCR(RT-PCR)檢測(cè)Ki-67抗原及其mRNA的表達(dá)。結(jié)果正常對(duì)照組、EGF組、1,25(OH)2D3組和EGF聯(lián)合1,25(OH)2D3組細(xì)胞熒光強(qiáng)度分別為(35.958±2.563)、(49.872±2.745)、(22.415±2.277)和(36.567±2.270)，4組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=123.429，P<0.05)。其中，EGF組熒光強(qiáng)度高于正常對(duì)照組，1,25(OH)2D3組熒光強(qiáng)度低于正常對(duì)照組(P<0.05)；1,25(OH)2D3組和EGF聯(lián)合1,25(OH)2D3組熒光強(qiáng)度低于EGF組(P<0.05)。以正常對(duì)照組為基準(zhǔn)，EGF組、1,25(OH)2D3組和EGF聯(lián)合1,25(OH)2D3組Ki-67 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為(2.479±0.150)、(0.584±0.031)和(1.176±0.017)，4組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=51.107，P<0.05)。其中，EGF組Ki-67 mRNA相對(duì)表達(dá)量高于正常對(duì)照組，1,25(OH)2D3組Ki-67 mRNA相對(duì)表達(dá)量低于正常對(duì)照組(P<0.05)；1,25(OH)2D3組和EGF聯(lián)合1,25(OH)2D3組Ki-67 mRNA相對(duì)表達(dá)量低于EGF組(P<0.05)。結(jié)論1,25(OH)2D3可抑制人腎小球系膜細(xì)胞的增殖，并降低EGF對(duì)人腎小球系膜細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用。

【關(guān)鍵詞】人腎小球系膜細(xì)胞；1,25-二羥維生素D3；Ki-67抗原；表皮生長(zhǎng)因子；細(xì)胞增殖

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81160090)

【中圖分類(lèi)號(hào)】R 692.31

收稿日期：(2015-03-12；修回日期：2015-08-29)

楊銳,尹璇,張昊,等.1,25-二羥維生素D3對(duì)人系膜細(xì)胞增殖作用的影響[J].中國(guó)全科醫(yī)學(xué)，2015，18(35)：4330-4332.[www.chinagp.net]

Yang R,Yin X,Zhang H,et al.Effect of 1,25(OH)2D3on the proliferation of human glomerular mesangial cells[J].Chinese General Practice，2015，18(35)：4330-4332.

Effect of 1,25(OH)2D3on the Proliferation of Human Glomerular Mesangial CellsYANGRui,YINXuan,ZHANGHao,etal.MedicalCollegeofShiheziUniversity,Shihezi832000,China

Abstract【】ObjectiveTo investigate the effects of 1,25-dihydroxyvitamin D3〔1,25(OH)2D3〕 on Ki-67 antigen expression in human glomerular mesangial cells and its inhibitive effect on human glomerular mesangial cell proliferation.MethodsGlomerular mesangial cells were cultured in vitro and divided into normal control group,epidermal growth factor group(EGF group),1,25(OH)2D3group and combined group of EGF and 1,25(OH)2D3.After culture for 48 hours,the expression and the mRNA expression of Ki-67 antigen were measured using immunofluorescence technique and RT-PCR.ResultsThe cell fluorescence intensity was (35.958±2.563),(49.872±2.745),(22.415±2.277) and (36.567±2.270) for normal control group,EGF group,1,25(OH)2D3group and combined group respectively，with significant difference among them(F=123.429，P<0.05).EGF was higher than normal control group in fluorescence intensity(P<0.05),and 1,25(OH)2D3group was lower than normal control group in fluorescence intensity(P<0.05)；1，25(OH)2D3group and combined group were lower than EGF group in fluorescence intensity(P<0.05).With normal control group as standard,the relative expression levels of EGF group,1,25(OH)2D3group and combined group were(2.479±0.150),(0.584±0.031)and(1.176±0.017)respectively,with significant difference among them(F=51.107，P<0.05).EGF group was higher than normal control group in the mRNA relative expression level of Ki-67 antigen(P<0.05),1,25(OH)2D3group was lower than normal control group in the mRNA relative expression level(P<0.05);1,25(OH)2D3group and combined group were lower than EGF group in the mRNA relative expression level(P<0.05).Conclusion1,25(OH)2D3can inhibit the proliferation of human glomerular mesangial cell proliferation and reduce the facilitation of EGF for human glomerular mesangial cell proliferation.

【Key words】Human mesangial cells；1,25-Dihydroxyvitamin D3；Ki-67 antigen；Epidermal growth factor；Cell proliferation

系膜增生性腎小球腎炎(MsPGN)為臨床常見(jiàn)的原發(fā)性腎小球腎炎之一，其特征為系膜細(xì)胞(MC)的增殖和基質(zhì)積聚，最終導(dǎo)致終末期腎病。探討MsPGN的發(fā)病機(jī)制及相應(yīng)的治療措施，對(duì)改善患者的預(yù)后極為重要[1]。有研究表明，增殖的或非增殖的腎小球均有Ki-67抗原、增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)和拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ α等增殖標(biāo)志物表達(dá)[2]。其中，與細(xì)胞核增殖相關(guān)的Ki-67抗原可在神經(jīng)干細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、系膜細(xì)胞等多種細(xì)胞中表達(dá)，是被廣泛用于細(xì)胞增殖標(biāo)志物的蛋白質(zhì)[3-4]。新近研究表明，1,25-二羥維生素D3〔1,25(OH)2D3〕可抑制腎小球細(xì)胞增殖，調(diào)節(jié)系膜細(xì)胞免疫機(jī)制，拮抗Thy-1.1大鼠腎炎模型炎癥浸潤(rùn)，誘導(dǎo)相應(yīng)的凋亡反應(yīng)，促進(jìn)腎功能修復(fù)[5]。本研究探討1,25(OH)2D3對(duì)人腎小球系膜細(xì)胞增殖及Ki-67抗原表達(dá)的影響，為1,25(OH)2D3臨床的廣泛應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞株人腎小球系膜細(xì)胞株(4200)購(gòu)于湘雅醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2試劑及儀器低糖DMEM、胰蛋白酶購(gòu)于美國(guó)Gibco公司；胎牛血清購(gòu)于杭州四季青生物有限公司；青鏈霉素混合液、DMSO購(gòu)于北京索萊寶生物科技有限公司；1,25(OH)2D3、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；小鼠抗人β-actin單克隆抗體、兔抗人Ki-67抗原單克隆抗體購(gòu)于Cell Signaling公司；山羊抗兔IgG二抗、山羊抗小鼠IgG二抗購(gòu)于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；SybrGreen PCR Master Mix購(gòu)于美國(guó) ABI公司；Zeiss LSM510-META共聚焦顯微鏡購(gòu)于德國(guó)蔡司公司；定量PCR儀購(gòu)于瑞士羅氏公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及分組用含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基復(fù)蘇人腎小球系膜細(xì)胞，取傳代培養(yǎng)至第3～8代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)，采用隨機(jī)數(shù)字表法將其分為正常對(duì)照組、EGF組、1,25(OH)2D3組和EGF聯(lián)合1,25(OH)2D3組。正常對(duì)照組加含5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，EGF組加10 μg/L的EGF培養(yǎng)液(含5%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基)，1,25(OH)2D3組加10-8mol/L的1,25(OH)2D3培養(yǎng)液(含5%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基)，EGF聯(lián)合1,25(OH)2D3組加10 μg/L 的EGF及10-8mol/L的1,25(OH)2D3培養(yǎng)液(含5%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基)，48 h后收集細(xì)胞。

1.2.2細(xì)胞免疫熒光技術(shù)檢測(cè)Ki-67抗原表達(dá)將細(xì)胞種于蓋玻片上，置于6孔培養(yǎng)板，按照實(shí)驗(yàn)分組方法培養(yǎng)細(xì)胞，取出蓋玻片，吸棄培養(yǎng)液，4%多聚甲醛固定30 min，3‰ Triton破膜20 min，封閉后加一抗，置濕盒入4 ℃冰箱過(guò)夜，加熒光二抗避光孵育1 h，除封閉外，其余各步均需用0.01 mol/L PBS洗3次，每次5 min，甘油封固，激光共聚焦顯微鏡觀察并采圖，測(cè)定熒光強(qiáng)度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3熒光定量PCR檢測(cè)Ki-67抗原表達(dá)按照實(shí)驗(yàn)分組培養(yǎng)細(xì)胞，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄cDNA，引物序列：上游：5′-CCCCATTCACCCACCTTG-3′，下游:5′-TGATGTCACCTGGCTCCC-3′。β-actin內(nèi)參基因引物序列：上游：5′-TAGTTGCGTTACACCCTTTCTTG-3′,下游:5′-TCACCTTCACCGTTCCAGTTT-3′。PCR參數(shù)：95 ℃變性3 min，95 ℃退火15 s，60 ℃延伸40 s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。采用相對(duì)定量法計(jì)算Ki-67 mRNA相對(duì)表達(dá)量=2-ΔΔCt，其中ΔΔCt=(待測(cè)組目的基因Ct值-待測(cè)組內(nèi)參基因Ct值)-(基準(zhǔn)組目的基因Ct值-基準(zhǔn)組內(nèi)參基因Ct值)。

2結(jié)果

2.1人腎小球系膜細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)情況正常對(duì)照組細(xì)胞胞體透亮，形態(tài)呈梭形、不規(guī)則星形、樹(shù)枝狀，胞質(zhì)較清楚；EGF組細(xì)胞形態(tài)與正常對(duì)照組比較無(wú)明顯改變，但細(xì)胞數(shù)目增多；1,25(OH)2D3組呈現(xiàn)一定程度的細(xì)胞凋亡，胞核皺縮，形態(tài)不清晰，數(shù)目較正常對(duì)照組明顯減少；EGF聯(lián)合1,25(OH)2D3組細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)情況、數(shù)目與正常對(duì)照組大致相同。

2.2細(xì)胞免疫熒光技術(shù)檢測(cè)Ki-67抗原表達(dá)正常對(duì)照組、EGF組、1,25(OH)2D3組和EGF聯(lián)合1,25(OH)2D3組細(xì)胞熒光強(qiáng)度分別為(35.958±2.563)、(49.872±2.745)、(22.415±2.277)和(36.567±2.270)，4組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=123.429，P<0.05)。其中，EGF組熒光強(qiáng)度高于正常對(duì)照組，1,25(OH)2D3組熒光強(qiáng)度低于正常對(duì)照組(P<0.05)；1,25(OH)2D3組和EGF聯(lián)合1,25(OH)2D3組熒光強(qiáng)度低于EGF組(P<0.05，見(jiàn)圖1)。

2.3Ki-67 mRNA相對(duì)表達(dá)量以正常對(duì)照組為基準(zhǔn)，EGF組、1,25(OH)2D3組和EGF聯(lián)合1,25(OH)2D3組Ki-67 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為(2.479±0.150)、(0.584±0.031)和(1.176±0.017)，4組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=51.107，P<0.05)。其中，EGF組Ki-67 mRNA相對(duì)表達(dá)量高于正常對(duì)照組，1,25(OH)2D3組Ki-67 mRNA相對(duì)表達(dá)量低于正常對(duì)照組(P<0.05)；1,25(OH)2D3組和EGF聯(lián)合1,25(OH)2D3組Ki-67 mRNA相對(duì)表達(dá)量低于EGF組(P<0.05)。

注：A為正常對(duì)照組，B 為EGF組，C為1,25(OH)2D3組，D為EGF聯(lián)合1,25(OH)2D3組

圖1各組細(xì)胞Ki-67抗原表達(dá)的免疫熒光染色結(jié)果(×400)

Figure 1Results of immunofluorescent staining of the expression of Ki-67 antigen of each group

3討論

Ki-67抗原是細(xì)胞增殖的生物標(biāo)志物，存在于除有絲分裂G0期之外的細(xì)胞周期各階段，其陽(yáng)性表達(dá)預(yù)示細(xì)胞增殖進(jìn)入細(xì)胞周期[8]。研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌、賁門(mén)癌患者中Ki-67抗原表達(dá)增高，而抑制Ki-67 抗原的表達(dá)可改善患者預(yù)后[8-10]。因此，Ki-67抗原的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平可反映1,25(OH)2D3對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用。本研究結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，經(jīng)1,25(OH)2D3干預(yù)的人腎小球系膜細(xì)胞細(xì)胞核Ki-67抗原及其mRNA表達(dá)降低，提示1,25(OH)2D3不僅可從蛋白水平抑制Ki-67抗原的表達(dá)，也可從核酸水平抑制Ki-67抗原的表達(dá)，從而抑制人腎小球系膜細(xì)胞的增殖。

EGF在體內(nèi)外對(duì)多種組織細(xì)胞有強(qiáng)烈促分裂作用。Kumar等[11]研究發(fā)現(xiàn)，EGF可刺激系膜細(xì)胞的增殖。本研究采用EGF誘導(dǎo)人腎小球系膜細(xì)胞增殖的微環(huán)境，并用1,25(OH)2D3進(jìn)行干預(yù)，進(jìn)一步觀察在EGF誘導(dǎo)系膜細(xì)胞增殖的情況下，1,25(OH)2D3是否能抑制系膜細(xì)胞的生長(zhǎng)與增殖。結(jié)果顯示，與EGF組比較，1,25(OH)2D3聯(lián)合EGF組人腎小球系膜細(xì)胞細(xì)胞核Ki-67抗原及其mRNA表達(dá)降低，1,25(OH)2D3可以抑制EGF作用下的人腎小球系膜細(xì)胞中的Ki-67抗原的表達(dá)。

綜上所述，1,25(OH)2D3可抑制人腎小球系膜細(xì)胞的增殖，并降低EGF對(duì)人腎小球系膜細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用。本研究為體外實(shí)驗(yàn)，1,25(OH)2D3影響人腎小球系膜細(xì)胞增殖的具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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(本文編輯：吳立波)