異丙酚對CO2氣腹后大鼠肺缺血再灌注損傷的保護作用及機制

鄒海波，張巍麗，施鵬，孫曉峰

(沈陽醫(yī)學院附屬中心醫(yī)院，沈陽110024)

摘要：目的觀察異丙酚對CO2氣腹后大鼠肺缺血再灌注損傷的保護作用，并探討其作用機制。方法選擇雄性大鼠48只，隨機分為A、B、C、D組，每組12只。A、B、C組經尾靜脈泵注生理鹽水、D組經尾靜脈泵注異丙酚。A組不做其他處理，B組經CO2氣腹建立大鼠肺缺血模型，C、D組經CO2氣腹建立大鼠肺血再灌注模型。各組造模后處死大鼠，取肺組織檢測丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)，計算肺濕干質量比(W/D)，采用免疫組化法、Real-time PCR法、Western blotting法分別檢測肺組織中HO-1陽性細胞數、蛋白表達及mRNA水平。結果B、C組SOD、MDA、W/D與A組比較差異有統計學意義(P均<0.05)，D組SOD、MDA、W/D與A組比較差異無統計學意義(P均>0.05)。D組肺組織中HO-1蛋白表達陽性細胞數、蛋白相對表達量、mRNA相對表達量高于其他三組(P均<0.01)。結論 異丙酚在CO2氣腹后大鼠肺臟血再灌注損傷中具有保護作用，其機制可能與HO-1表達增加有關。

關鍵詞：肺缺血；再灌注損傷；異丙酚；二氧化碳氣腹；大鼠

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.41.010

中圖分類號：R563

文獻標志碼：A

文章編號：1002-266X(2015)41-0028-03

收稿日期：(2015-07-14)

腹腔鏡在臨床外科的應用越來越廣泛，但CO2氣腹帶來的諸多不良反應也引起了關注。異丙酚作為一種臨床麻醉常用藥，具有抗氧化應激作用，其對肺缺血再灌注損傷的保護作用及其機制目前還存在爭議[1]。2014年4月~2015年5月本實驗以大鼠為實驗對象，觀察異丙酚在CO2氣腹后大鼠肺缺血再灌注損傷中的保護作用，并探討其作用機制。

1材料與方法

1.1動物分組及模型制備成年Wistar雄性大鼠48只,體質量280~320 g。將其隨機分成A、B、C、D組4組，每組12只。實驗前大鼠禁食12 h，自由飲水。參照Pringle法造模的麻醉劑量，10%水合氯醛(3 mL/kg)經大鼠腹腔麻醉。皮膚消毒后，腹部插入氣腹針(壓力20 mmHg)，剖開頸動脈，插管檢測平均動脈壓(MAP)。A組不做其他處理，僅尾靜脈泵注生理鹽水1 h(10 mL/kg)；B組在A組基礎上給予氣腹(壓力20 mmHg)1 h；C組在A組基礎上，氣腹1 h后放開0.5 h；D組在C組基礎上，用異丙酚代替生理鹽水，經尾靜脈泵注異丙酚1.5 h[10 mg/(kg·h)](異丙酚原液用生理鹽水10倍稀釋)，氣腹(壓力20 mmHg)1 h后放開0.5 h。各組于造模后即刻處死大鼠。

1.2肺組織丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)檢測大鼠處死后取肺組織10 mg，置于液氮中冷凍。用硫代巴比妥酸比色法測定肺組織中MDA，黃嘌呤氧化酶法測定肺組織中SOD，均嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.3肺濕干質量比(W/D)計算模型制備成功后處死大鼠，取右上肺葉稱濕質量，置于80 ℃烘箱中烘烤48 h至恒重，取出后稱干質量，計算肺W/D。

1.4肺組織中HO-1表達檢測

1.4.1HO-1蛋白表達陽性細胞檢測采用免疫組化法。處死大鼠后取右肺組織置于10%甲醛中固定，石蠟包埋，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。光鏡下觀察，陽性細胞的細胞核染色為棕色，計數3個視野陽性細胞數，取平均值。

1.4.2HO-1蛋白半定量檢測采用Western blotting法。取各組右肺組織10 mg，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。以β-actin為內參，顯影后曝光沖片，膠片經凝膠成像分析系統掃描、成像后測定單位吸光度，并將各組吸光度值分別與β-actin密度值相比得出HO-1蛋白相對表達量。

1.4.3HO-1 mRNA檢測采用Real-time PCR法。取各組凍存肺組織50 mg，以TRIzol法勻漿后提取漿液中總RNA，應用紫外分光光度法測定其表達水平。取1 μg總RNA，嚴格按照Prime Script RT Master Mix試劑盒說明書的要求逆轉錄為cDNA，并置于-30 ℃保存，以目的基因與內參基因的差值作為目的基因的相對表達量。

1.5統計學方法采用SPSS17.0統計軟件。計量資料用±s表示，多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1各組肺組織SOD、MDA及W/D比較見表1。

表1　各組肺組織SOD、MDA及W/D比較( ± s)

表1　各組肺組織SOD、MDA及W/D比較( ± s)

組別nSOD(U/mg)MDA(nmol/mg)W/DA組12625.41±85.314.02±0.753.75±0.38B組12383.75±35.15*△3.15±0.73*△4.84±0.45*△C組12303.51±70.23*5.91±0.52*5.85±0.89*D組12474.57±101.283.65±1.434.11±0.61

注：與A組、D組比較，*P<0.05；與C組比較，△P<0.05。

2.2各組肺組織中HO-1蛋白表達陽性細胞計數經免疫組化法檢測A、B、C、D組肺組織中HO-1蛋白表達陽性細胞數分別為(5±1)、(11±2)、(17±1)、(25±2)個。與A組比較，B、C組陽性細胞數增多(P均<0．05)；與B、C組比較，D組陽性細胞數增多 (P均<0.01)。

2.3各組肺組織中HO-1蛋白相對表達量A、B、C、D組HO-1蛋白相對表達水平分別為0.02±0.003、0.31±0.07、0.49±0.06、0.62±0.03；與A組比較，B、C組HO-1蛋白表達水平升高，且C組高于B組(P均<0.05);與B、C組比較，D組HO-1蛋白表達水平升高(P均<0.05)。

2.4各組肺組織中HO-1 mRNA水平A、B、C、D組肺組織中HO-1 mRNA的相對表達量分別為0.23±0.09、0.58±0.13、0.71±0.16、0.93±0.15；與A組比較，B、C組中HO-1 mRNA表達水平升高(P均<0．05)；與B、C組比較，D組HO-1 mRNA表達水平升高(P均<0.01)。

3討論

腹腔鏡CO2氣腹后所產生的機體各個器官缺血再灌注損傷是當前研究的熱點[2]。液體復蘇可導致全身炎癥反應綜合征和多器官功能障礙綜合征,其中肺最易受累[3]。嚴重的肺缺血再灌注損傷是遠期急慢性炎癥反應的危險因素[4]，其特征性病理變化為：凋亡細胞以肺毛細血管內皮細胞和肺泡上皮細胞為主[5]，肺毛細血管內皮細胞受損后，肺泡-毛細血管屏障功能障礙，使炎癥細胞和炎性介質滲出，肺泡及肺泡間質水腫，組織細胞死亡[6、7]。肺缺血再灌注損傷是由缺血的直接損傷及鈣離子超載、中性粒細胞活化[8]引發(fā)“呼吸爆發(fā)”，產生大量自由基和促炎癥細胞因子、內皮細胞等多種因素介導的多臟器功能受損的復雜病理生理過程[9]。Kupffer細胞激活產生大量氧自由基(OFR)和炎癥介質被公認為是缺血再灌注損傷早期最主要的致傷原因[10]。生理狀態(tài)下，體內OFR的生成與清除處于動態(tài)平衡，但在某些病理狀態(tài)下，如肺臟再灌注損傷時通過吞噬細胞系統、線粒體呼吸鏈、兒茶酚胺的自身氧化等途徑產生大量OFR，OFR是缺血器官再灌注后致組織損傷最早、最重要的有害物質之一[11]。特別是肺缺血再灌注致大量OFR生成，可激活轉錄因子蛋白(NF-κB)，使炎癥因子釋放增多[12]。

MDA是OFR與細胞膜不飽和脂肪酸發(fā)生過氧化反應(LP)過程中毒性最大的過氧化產物(LPO)。由于LPO具有活性高、氧化性能強和極不穩(wěn)定的特點，直接測定器官中的含量比較困難。MDA是自由基攻擊生物膜引發(fā)的脂質LPO，其水平可反映脂質過氧化程度，間接地反映出細胞受自由基攻擊和損傷的程度[13]。SOD是體內最主要的自由基清除劑，可清除OFR。在缺血再灌注過程中過氧化-抗氧化狀態(tài)失衡時，LP呈病理性增強，抗氧化防御體系被嚴重破壞，自由基可以與細胞膜磷脂、蛋白質、核酸等反應，并進一步導致細胞的代謝功能發(fā)生障礙。當體內OFR生成增多時，SOD與超氧陰離子反應生成過氧化氫，再由過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶轉變?yōu)樗瑥亩宄杂苫?，保護細胞免受損傷。MDA和SOD的變化表明缺血和再灌注是兩個不同的階段，CO2氣腹造成的缺血過程中對肺臟造成了損傷，當氣腹壓力解除后這種損傷不但沒有停止反而繼續(xù)加重，即再灌注損傷。在本次實驗中，高氣腹壓力壓迫大鼠肺門部血管造成肺組織缺血性損傷，此時大鼠肺組織內的MDA含量升高，SOD含量降低。當放開氣腹后，肺組織經歷了再灌注過程，但此時損傷不但未減輕反而由于再灌注繼續(xù)加重，MDA顯著升高，SOD顯著降低，但是應用異丙酚后，MDA含量明顯下降，SOD含量明顯升高?？梢姡邭飧箟簩Υ笫蠓谓M織造成了缺血再灌注損傷，異丙酚對其具有保護性作用。

HO-1又稱熱休克蛋白32，是一種限速酶，正常生理情況下存在于多個臟器與組織中，表達較少。但在應激情況下HO-1的表達便會反應性的增強，以減少應激狀態(tài)帶來的損傷。HO-1可催化血紅素生成一氧化碳、鐵離子和膽綠素，在抗氧化應激、抗炎、抑制細胞凋亡等方面發(fā)揮重要作用；有研究結果表明，HO-1的保護作用還可能與減輕脂質LP、降低半胱氨酸蛋白酶活性以對抗細胞凋亡和腫瘤壞死因子水平有關。本研究結果證明，HO-1在A組、B組、C組、D組中的表達逐漸升高，特別是D組升高最為明顯，也充分證明異丙酚在肺臟缺血再灌注損傷過程中，可通過誘導HO-1的表達而發(fā)揮對肺臟的保護作用。

丙泊酚用于止血帶所致缺血再灌注損傷時，能減少OFR生成，減輕脂質過氧化。異丙酚的保護性作用的機制表現為：清除OFR，降低OFR水平，減輕脂質LP，增強體內SOD、谷胱甘肽過氧化物酶活性，減弱中性粒細胞“呼吸爆發(fā)”，穩(wěn)定細胞膜。異丙酚可直接與自由基反應，生成2,6-二異丙基苯氧基團，使自由基滅活，清除體內OFR，使脂質LP減弱；增加NO的含量，改善微循環(huán)障礙。此外，異丙酚良好的脂溶性亦使其更容易積聚在細胞的脂質雙分子層上，從而提高細胞抗氧化損傷的能力。很多實驗也表明，異丙酚具有增強SOD活性的作用，異丙酚不但減少脂質過氧化產物MDA的產生而且還能保持自由基清除劑的活性。本研究結果顯示，異丙酚可增加HO-1的蛋白表達，增強機體的抗氧化能力，降低OFR水平，糾正缺血再灌注損傷中過氧化-抗氧化失衡狀態(tài)。另外，有研究表明，細胞內鈣離子濃度的增高和線粒體鈣超載能夠通過激活鈣調節(jié)蛋白依賴性激酶-13和卡配因而誘導細胞自噬[14]；缺血再灌注損傷發(fā)生后，MDA、LPO和NF-κB水平明顯升高，可作為肺損傷炎癥反應和肺損傷程度的指標[15]；異丙酚阻斷細胞內鈣超載，增加抗炎性細胞因子，減少促炎性細胞因子的產生，減少多巴胺積聚等也可能參與了異丙酚對肺的保護作用。因而，異丙酚可以通過增加HO-1蛋白的表達減輕大鼠的肺缺血再灌注的損傷。

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