·藥物分析·

一測(cè)多評(píng)法測(cè)定杜麻顆粒中5種成分的含量

楊東亮1，馬桂芝2，王 娟2，岳佳琪2，滕 亮1*，于富生3

(1.新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，烏魯木齊 830054；2.新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，烏魯木齊830011；3.新疆華圣元醫(yī)藥科技有限公司，烏魯木齊830011)

摘要：目的建立杜麻顆粒中香豆酸、綠原酸、金絲桃苷、異槲皮素、香豆素5種成分一測(cè)多評(píng)的含量測(cè)定方法。方法以綠原酸為指標(biāo)，建立該成分與香豆酸、金絲桃苷、異槲皮素、香豆素的相對(duì)校正因子，通過(guò)相對(duì)校正因子計(jì)算各成分的質(zhì)量濃度，同時(shí)對(duì)10批杜麻顆粒一測(cè)多評(píng)計(jì)算值與外標(biāo)法實(shí)測(cè)值進(jìn)行比較。結(jié)果建立了杜麻顆粒中5種成分一測(cè)多評(píng)法的含量測(cè)定方法，10批樣品中各成分計(jì)算值與實(shí)測(cè)值之間無(wú)顯著性差異(P>0.05)。結(jié)論同時(shí)測(cè)定杜麻顆粒中5種成分的一測(cè)多評(píng)法方法可靠，結(jié)果準(zhǔn)確，可用于控制杜麻顆粒的質(zhì)量。

關(guān)鍵詞:綠原酸;一測(cè)多評(píng)；相對(duì)校正因子；杜麻顆粒

doi:10.3969/j.issn.1004-2407.2015.03.009

中圖分類號(hào)：R927.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1004-2407(2015)03-0247-05

Abstract:ObjectiveTo establish a quantitative analysis method of multi-components by single marker (QAMS) for determination of the components in Duma Granules， a traditional Chinese medicine preparation. Methods Chlorogenic acid was selected as an index， chlorogenic acid relative correction factors (RCF) of coumaric acid， hyperin， isoquercetin and coumarin were calculated under the chromatographic condition for determination of the five components in Duma Granules. The accuracy of the new method was evaluated by comparing the calculated contents with the contents which were determined by external reference method. Results The analysis method was established and it has no significant difference between the calculated contents and the contents which were determined by external reference method in 10 batches of samples. Conclusion The QAMS method is feasible and accurate to evaluate the contents of the 5 constituents in Duma Granules.

作者簡(jiǎn)介：楊東亮，男，藥師，碩士

收稿日期：(2014-11-14)

Quantitative analysis of multi-components with single marker for determination of components in Duma Granules

YANG Dongliang1， MA Guizhi2， WANG Juan2， YUE Jiaqi2， TENG Liang1*， YU Fusheng3(1.Department of Pharmacy， the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University， Urumqi 830054， China； 2.College of Pharmacy， Xinjiang Medical University， Urumqi 830011， China； 3.Xinjiang Huashengyuan Medical Technology Limited Company， Urumqi 830011，China)

Key words: chlorogenic acid;quantitative analysis multi-components by single marker (QAMS)； related correction factor (RCF)； Duma Granules

*通信作者：滕亮，男，博士，教授

中藥復(fù)方以其多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，決定了單一成分難以代表中藥復(fù)方的質(zhì)量，多成分同步質(zhì)量控制、指紋圖譜等方法應(yīng)運(yùn)而生。然而，對(duì)照品供需矛盾和多指標(biāo)質(zhì)量控制的檢測(cè)成本限制了多成分質(zhì)量控制模式在實(shí)際生產(chǎn)、科研和質(zhì)量監(jiān)督中的應(yīng)用。在傳統(tǒng)的多成分質(zhì)量控制模式中，需要用足夠的化學(xué)對(duì)照品來(lái)完成質(zhì)量評(píng)價(jià)。但由于中藥的化學(xué)對(duì)照品分離難度大，或單體不穩(wěn)定，或供應(yīng)價(jià)格過(guò)高，使得中藥制劑中的單組分測(cè)定尚存在一定的難度，多組分的質(zhì)量控制更是難以進(jìn)行[1]。王智民[2]提出了一測(cè)多評(píng)的方法，即只測(cè)定一個(gè)成分，來(lái)實(shí)現(xiàn)多個(gè)成分的同步測(cè)定。本文嘗試將一測(cè)多評(píng)法首次應(yīng)用于中藥復(fù)方制劑杜麻顆粒的質(zhì)量控制中。

杜麻顆粒由杜仲、羅布麻葉等藥材組成，用于治療高脂血癥。課題組根據(jù)臨床實(shí)踐與文獻(xiàn)調(diào)研結(jié)果，采用均勻設(shè)計(jì)優(yōu)選了處方中羅布麻與杜仲的用量配比[3]。在此基礎(chǔ)上優(yōu)選了其制劑工藝，將其研發(fā)成利于臨床用藥、便于攜帶的顆粒劑。顆粒中的香豆酸、綠原酸[4]、金絲桃苷、異槲皮素、香豆素等均為活性成分，其中綠原酸對(duì)照品較易得到，且穩(wěn)定性高，在樣品中含量較高。本文以綠原酸對(duì)照品為指標(biāo)成分，建立杜麻顆粒中該成分與香豆酸、金絲桃苷、異槲皮素、香豆素的相對(duì)校正因子，用相對(duì)校正因子計(jì)算這4種成分的含量，同時(shí)對(duì)一測(cè)多評(píng)法得到的計(jì)算值與外標(biāo)法得到的測(cè)定值進(jìn)行比較。在此基礎(chǔ)上，對(duì)不同品牌色譜柱和儀器、流速、溫度進(jìn)行了考察，以評(píng)價(jià)該測(cè)定方法的準(zhǔn)確性和科學(xué)性，為該制劑的質(zhì)量控制奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1儀器與試藥

1.1儀器高效液相色譜儀(LC-20AB，島津；1525，Waters；e2695，Waters)。電子天平(BS110S，北京賽多利斯天平有限公司，d=0.01 mg)。

1.2試藥乙腈為色譜純(Fisher公司)；水為超純水；其他試劑均為分析純；綠原酸對(duì)照品(132-101018，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99.0%)、異槲皮素對(duì)照品(Y32-110518，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99.0%)、金絲桃苷對(duì)照品(1157-091208，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99.0%)、香豆素對(duì)照品(X11-111012，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99.0%),均購(gòu)自中國(guó)固體制劑制造技術(shù)國(guó)家工程研究中心；香豆酸對(duì)照品(Sigma公司，MKBD9024V，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99.0%)；杜麻顆粒由新疆華圣元醫(yī)藥科技有限公司提供(批號(hào)分別為20131209，20131210，20131211，20131212，20131213，20131214，20131215，20131216，20131217，20131218)。

2方法與結(jié)果

2.1色譜條件分析柱 Agilent TC-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；保護(hù)柱Shim-pack GVP-ODS(10 mm×4.6 mm)；流速為1.0 mL·min-1；流動(dòng)相A：乙腈；流動(dòng)相B：2 mL·L-1磷酸溶液，梯度洗脫，洗脫程序?yàn)椋?~5 min，95%~90%A；5~25 min，90%~82%A；25~55 min，82%~82%A；55~60 min，82%~95%A；柱溫40 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)256 nm；進(jìn)樣量10 μL。

2.2混合對(duì)照品溶液的制備精密稱取各對(duì)照品適量，用甲醇溶解，制成含香豆酸38.440 μg·mL-1、綠原酸658.80 μg·mL-1、金絲桃苷270.80 μg·mL-1、異槲皮素213.20 μg·mL-1、香豆素47.20 μg·mL-1的混合對(duì)照品溶液，4 ℃冰箱保存。

2.3供試品溶液的制備取顆粒適量，研細(xì)，稱取約0.5 g，精密稱定，置于50 mL量瓶中，加入體積分?jǐn)?shù)40%乙醇適量，超聲處理(功率250 W，頻率33 kHz)40 min，放冷，定容至刻度，搖勻，微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.4陰性樣品溶液的制備按照處方比例稱取除去羅布麻葉外的其他藥材適量，按照杜麻顆粒的制法和供試品溶液的制備方法制備陰性樣品溶液，即得。色譜圖顯示，陰性樣品在金絲桃苷、異槲皮素、香豆素各指標(biāo)成分相對(duì)應(yīng)的保留時(shí)間無(wú)干擾，綠原酸、香豆酸為羅布麻葉和杜仲共有峰，測(cè)定的是顆粒中綠原酸與香豆酸總含量，見(jiàn)圖1。

2.5標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍分別精密移取混合對(duì)照品溶液0.25，0.5，1.0，2.0，4.0，6.0，8.0和10.0 mL，甲醇定容至10.0 mL，即得到質(zhì)量濃度分別為：香豆酸0.961，1.922，3.844，7.688，15.376，23.064，30.752和38.440 μg·mL-1，綠原酸16.47，32.94，65.88，131.76，263.52，395.28，527.04和658.80 μg·mL-1，金絲桃苷6.77，13.54，27.08，54.16，108.32，162.48，216.64和270.80 μg·mL-1，異槲皮素5.33，10.66，21.32，42.64，85.28，127.92，170.56和213.20 μg·mL-1，香豆素1.18，2.36，4.72，9.44，18.88，28.32，37.76和47.20 μg·mL-1系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，按2.1色譜條件進(jìn)行HPLC分析。以峰面積X和質(zhì)量濃度Y進(jìn)行回歸，香豆酸、綠原酸、金絲桃苷、異槲皮素、香豆素線性回歸方程見(jiàn)表1。

圖1HPLC圖

A.混合對(duì)照品色譜圖；B.樣品溶液色譜圖；C.羅布麻葉陰性色譜圖；1.香豆酸；2.綠原酸；3.金絲桃苷；4.異槲皮素；5.香豆素

Fig.1 HPLC chromatograms

A.mixture of reference substances； B.sample； C.negative sample；1. coumaric acid； 2. chlorogenic acid； 3. hyperin； 4. isoquercetin； 5. coumarin

表1香豆酸、綠原酸、金絲桃苷、異槲皮素、香豆素的標(biāo)準(zhǔn)曲線

Tab.1 Standard curve of coumaric acid， chlorogenic acid， hyperin， isoquercetin and coumarin

成分標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍/μg·mL-1r香豆酸Y=4.1964×10-5X-0.04460.961~38.4400.9998綠原酸Y=1.0362×10-4X-1.000916.47~658.800.9999金絲桃苷Y=4.0245×10-5X-0.65636.77~270.800.9999異槲皮素Y=3.6018×10-5X-0.53305.33~213.200.9999香豆素Y=5.5171×10-5X-0.14811.18~47.200.9999

2.6精密度實(shí)驗(yàn)精密吸取同一質(zhì)量濃度對(duì)照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，計(jì)算香豆酸、綠原酸、金絲桃苷、異槲皮素、香豆素峰面積的RSD分別為1.42%，1.26%，1.24%，1.21%和1.23%。結(jié)果表明精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果良好。

2.7重復(fù)性實(shí)驗(yàn)取同一批號(hào)(批號(hào)20131209)樣品6份，每份0.50 g，精密稱定，按2.3項(xiàng)下平行制備樣品，進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算香豆酸、綠原酸、金絲桃苷、異槲皮素、香豆素峰面積的RSD分別為1.12%，1.76%，1.65%，1.43%和1.54%。

2.8穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)精密吸取同一供試品溶液，室溫放置。分別于配制后的0，2，4，8，12，24和48 h 測(cè)定并記錄香豆酸、綠原酸、金絲桃苷、異槲皮素、香豆素峰面積，并計(jì)算其RSD,分別為0.98%，0.76%，1.69%，1.35%和0.95%，表明處理后的供試品溶液在 48 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.9加樣回收率實(shí)驗(yàn)取已知含量的供試品6份，分別加入含香豆酸、綠原酸、金絲桃苷、異槲皮素、香豆酸的對(duì)照溶液5 mL，按上述供試品制備方法和色譜條件，制備加樣回收供試品溶液并注入液相色譜儀，測(cè)定，計(jì)算香豆酸、綠原酸、金絲桃苷、異槲皮素、香豆素回收率，結(jié)果見(jiàn)表2。

表25種成分的加樣回收率

Tab.2 The recoveries of 5 components

成分原有量/mg加入量/mg測(cè)得量/mg回收率/%x/%RSD/%香豆酸0.04250.037450.0788997.20.04250.037450.0788497.00.04270.037450.0794298.10.04260.037450.0794398.30.04270.037450.0794698.20.04240.037450.0789897.797.70.55綠原酸0.85590.74691.59098.30.85580.74691.60199.80.85990.74691.616101.20.85800.74691.60399.80.85990.74691.58396.80.85390.74691.59298.899.11.52金絲桃苷0.24900.26730.507796.80.24900.26730.506596.30.25020.26730.508196.50.24960.26730.509997.40.25020.26730.508496.60.24840.26730.513199.097.11.04異槲皮素0.24190.21060.4527100.10.24190.21060.4581102.70.24300.21060.4553100.80.24240.21060.4633104.90.24300.21060.4616103.80.24130.21060.4565102.2102.41.75香豆素0.033830.036670.07073100.60.033830.036510.0696498.10.033990.036510.0707100.50.033910.036510.07093101.40.033990.036510.07171103.30.033750.036510.07031100.1100.71.69

2.10校正因子的計(jì)算以綠原酸為內(nèi)標(biāo)物，按公式：fs/k=(Ws×Ak)/(Wk×As)計(jì)算內(nèi)標(biāo)綠原酸與香豆酸、金絲桃苷、異槲皮素、香豆素之間的相對(duì)校正因子(RCF)。fs/k為內(nèi)標(biāo)綠原酸與組分k之間的RCF，As為內(nèi)標(biāo)綠原酸的峰面積，Ws為內(nèi)標(biāo)綠原酸的質(zhì)量(或質(zhì)量濃度)，Ak為組分k的峰面積，Wk為組分k的質(zhì)量(或質(zhì)量濃度)[5]。

以綠原酸為內(nèi)標(biāo)物，按公式fs/k=(Ws×Ak)/(Wk×As)計(jì)算內(nèi)標(biāo)綠原酸與香豆酸、金絲桃苷、異槲皮素、香豆素之間的相對(duì)校正因子(RCF)[6]，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3樣品中4種組分的RCF

Tab. 3 The relative correction factor of 4 components in samples

進(jìn)樣體積/μLRCFf綠原酸/香豆酸f綠原酸/金絲桃苷f(shuō)綠原酸/異槲皮素f綠原酸/香豆素17.7988.1189.1066.07227.7178.2049.1785.99647.6698.0779.0195.86567.6988.0528.9965.86487.8438.1079.0525.951107.6958.0759.0305.885均值7.7378.1069.0645.939RSD/%0.880.660.741.41

2.11相對(duì)校正因子耐用性和系統(tǒng)適用性考察

2.11.1高效液相色譜儀和色譜柱對(duì)相對(duì)校正因子的影響分別考察3種色譜儀和3種色譜柱對(duì)綠原酸相對(duì)校正因子的影響[7]，按2.1項(xiàng)下色譜條件操作，得到相對(duì)校正因子重復(fù)性良好，RSD小于2%，結(jié)果見(jiàn)表4。

2.11.2流速對(duì)相對(duì)校正因子的影響采用島津LC-20AB高效液相色譜儀和Kromasil C18色譜柱，柱溫40 ℃，分別考察流速0.9，1.0和1.1 mL·min-1對(duì)相對(duì)校正因子的影響，重復(fù)性良好，RSD小于2%，結(jié)果見(jiàn)表5。

表4色譜儀和色譜柱對(duì)RCF的影響

Tab.4 The influence of chromatographic column and chromatograph on the relative correction factors

儀器色譜柱RCFf綠原酸/香豆酸f綠原酸/ 金絲桃苷f(shuō)綠原酸/ 異槲皮素f綠原酸/香豆素島津 LC-20ABAgilentTC-C187.7808.1669.0356.088KromasilC187.7958.1669.1446.078AmethystC187.8088.1679.0825.921Waters1525AgilentTC-C187.8108.1649.0496.094KromasilC187.8178.1679.0186.044AmethystC187.8098.1659.0396.096Waterse2695AgilentTC-C187.8188.1639.0166.042KromasilC187.8188.1669.1026.042AmethystC187.8178.1669.0426.039均值7.8088.1669.0586.050RSD(%)0.160.020.051.00

表5流速對(duì)RCF的影響

Tab.5 The influence of flow rate on the relative correction factor

進(jìn)樣體積/mL·min-1RCFf綠原酸/香豆酸f綠原酸/金絲桃苷f(shuō)綠原酸/異槲皮素f綠原酸/香豆素0.97.7848.1589.0386.2311.07.7998.1748.7886.2181.17.8088.1669.0586.050均值7.7978.1668.9616.166RSD/%0.150.091.681.64

2.11.3柱溫對(duì)相對(duì)校正因子的影響采用島津LC-20AB高效液相色譜儀和Kromasil C18色譜柱，流速1.0 mL·min-1，分別考察溫度30，35和40 ℃對(duì)相對(duì)校正因子的影響，結(jié)果重復(fù)性良好，RSD小于2%，結(jié)果見(jiàn)表6。

表6柱溫對(duì)RCF的影響

Tab. 6 The influence of column temperature on the relative correction factor

柱溫/℃RCFf綠原酸/香豆酸f綠原酸/金絲桃苷f(shuō)綠原酸/異槲皮素f綠原酸/香豆素307.7968.1689.1086.254357.7958.1649.0236.240407.8088.1669.0586.050均值7.8008.1669.0636.181RSD/%0.090.030.461.84

2.12外標(biāo)法和一測(cè)多評(píng)法結(jié)果比較分別精密吸取不同批次樣品10 μL，測(cè)定。采用外標(biāo)法和一測(cè)多評(píng)法計(jì)算樣品中香豆酸、綠原酸、金絲桃苷、異槲皮素、香豆素的含量，結(jié)果見(jiàn)表7。結(jié)果表明一測(cè)多評(píng)法和外標(biāo)法測(cè)定結(jié)果并無(wú)顯著性差異(P>0.05)，表明一測(cè)多評(píng)法可以用于杜麻顆粒中5種成分的含量測(cè)定。

表7外標(biāo)法和一測(cè)多評(píng)法測(cè)定樣品中目標(biāo)成分的含量

Tab.7 Contents of target compound by QAMS and external reference method(mg·mL-1)

編號(hào)香豆酸綠原酸金絲桃苷異槲皮素香豆素ABAABABAB10.52820.528946.484.9474.9524.9134.9110.26700.267220.51030.510445.864.8674.8824.8794.8820.26370.263530.51160.511347.955.1375.1415.1035.1010.26880.270841.52901.529026.45010.84010.8308.5308.5261.8781.871052.3142.314039.8716.3116.2912.8412.8302.8362.830063.1233.123052.8021.7221.7117.0117.0803.8053.798070.52910.528846.404.9384.9374.9824.9800.26730.268280.52980.530547.704.9875.0014.9915.0020.25980.260390.74900.749112.875.3465.3554.2134.2180.93070.9310100.51950.519646.734.8774.8834.8874.8900.25680.2572

注：A.外標(biāo)法實(shí)測(cè)含量；B.一測(cè)多評(píng)法測(cè)得含量。

3討論

利用一測(cè)多評(píng)法可以實(shí)現(xiàn)通過(guò)測(cè)定一個(gè)成分的含量達(dá)到多指標(biāo)控制的目的。目前，一測(cè)多評(píng)法的研究思路已成功應(yīng)用于一些藥材和中藥復(fù)方制劑的質(zhì)量評(píng)價(jià)，包括白木通、人參、三七、黃芩、雙黃連、雙青咽喉片、麥貞花顆粒、芩暴紅止咳膠囊等[8-13]。在本文中，綠原酸是杜麻方的主要活性成分，含量高，且該對(duì)照品價(jià)廉易得、穩(wěn)定，因此重點(diǎn)考察了綠原酸的含量。但是綠原酸在忍冬科、菊科植物中普遍存在，提取純化方法較為成熟，若在工藝中非法添加，能很容易滿足質(zhì)量監(jiān)管部門的檢查要求[14]，因此僅控制綠原酸的含量，無(wú)法真實(shí)地控制杜麻顆粒的內(nèi)在質(zhì)量。而本實(shí)驗(yàn)采用一測(cè)多評(píng)的方法，僅使用綠原酸一種對(duì)照品就能夠同時(shí)測(cè)定5種成分的含量，能夠較全面真實(shí)地評(píng)價(jià)杜麻顆粒的質(zhì)量。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，一測(cè)多評(píng)所得含量與外標(biāo)法所得的各成分之間含量并無(wú)顯著性差異(P>0.05)。在不同的實(shí)驗(yàn)條件下，各成分之間的相對(duì)校正因子重復(fù)性好，說(shuō)明在對(duì)照品缺乏的條件下，一測(cè)多評(píng)法可以作為一種快捷、準(zhǔn)確的方法來(lái)評(píng)價(jià)杜麻顆粒的質(zhì)量。

在色譜條件的優(yōu)化中，所建立的含量測(cè)定方法應(yīng)該具有普遍適用性。本文考察了3種型號(hào)的高效液相色譜儀和3種型號(hào)的色譜柱對(duì)綠原酸相對(duì)校正因子的影響，結(jié)果顯示，樣品溶液5種成分在不同型號(hào)的儀器和色譜柱上分離效果較好，對(duì)難以分離的綠原酸雜質(zhì)峰分離度均大于1.5，各成分的理論板數(shù)均高于3 000，校正因子重復(fù)性良好，在一定范圍內(nèi)，流速與柱溫對(duì)校正因子影響不大，提示該方法具有較好的耐用性。

本文采用綠原酸作為內(nèi)標(biāo)進(jìn)行一測(cè)多評(píng)，是由于綠原酸是杜麻方的主要有效成分，且該對(duì)照品廉價(jià)易得、穩(wěn)定。香豆酸、香豆素具有抗菌、降脂和抗凝作用，高血壓患者常伴有高血脂，故將其納入含量測(cè)定的指標(biāo)之一。而綠原酸、金絲桃苷、異槲皮素是杜麻方的主要有效物質(zhì)，而且在藥材中含量較高，因此選擇其作為杜麻顆粒質(zhì)量評(píng)價(jià)的指標(biāo)成分。

致謝：感謝新疆華圣元醫(yī)藥科技有限公司對(duì)本課題的資助與支持。

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