朱軍 馮鳳兆 劉敏 鮑時翔 孫前光 黃惠琴

摘 要 鏈霉菌Da07210能產(chǎn)生對香蕉枯萎病病原菌有強(qiáng)烈抑制作用的活性物質(zhì)。采用單因子實驗和正交試驗對其發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基為：葡萄糖1.0%、甘油1.0%、大豆粉1.5%、硫酸銨0.5%。優(yōu)化后的培養(yǎng)條件為：初始pH值7.0、培養(yǎng)溫度28 ℃、種齡48 h、接種量8%、培養(yǎng)時間144 h、搖床轉(zhuǎn)速200 r/min。

關(guān)鍵詞 鏈霉菌；抗菌活性物質(zhì)；發(fā)酵

中圖分類號：S482.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B 文章編號：1673-890X（2015）36--02

香蕉鐮刀菌枯萎病是由尖孢鐮刀菌古巴?；停‵usarium oxysporum f.sp. cubense，F(xiàn)OC）引起的維管束壞死的系統(tǒng)性病害，嚴(yán)重影響了香蕉的生產(chǎn)和發(fā)展[1]。目前，尚未有效防治該病的方法[2]。國外關(guān)于香蕉枯萎病生物防治的研究主要集中于香蕉枯萎病拮抗菌的篩選及其室內(nèi)盆栽防治試驗。因此，篩選FOC拮抗菌株，開發(fā)新型農(nóng)用抗生素對香蕉鐮刀菌枯萎病的防治具有重要的意義。

大多數(shù)抗生素是由放線菌產(chǎn)生的。放線菌Da07210是從海南省鸚哥嶺原始森林土壤中分離到得一株放線菌。通過多項分類，確定菌株Da07210隸屬鏈霉菌屬（Streptomyces）。該菌株的發(fā)酵產(chǎn)物能抑制包括FOC在內(nèi)的多種土傳真菌病害的病原菌，如辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici）、立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）、瓜果腐霉菌（Pythium aphanidermatum）等。因此，Streptomyces sp.Da07210可以作為有潛在開發(fā)價值的抗生素產(chǎn)生菌。本文就其發(fā)酵條件進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

放線菌Da07210分離自海南省鸚哥嶺原始森林土壤中。

1.1.2 測試菌株

古巴尖孢鐮刀菌4號生理小種分離自海南省澄邁縣發(fā)病蕉園。

1.1.3 培養(yǎng)基

用于抑菌活性測定指示菌培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基；斜面培養(yǎng)基：高氏一號合成培養(yǎng)基，蒸餾水配制，pH7.2～7.4；種子培養(yǎng)基（1 000 mL）：葡萄糖10.0 g，可溶性淀粉5.0 g，酵母膏10.0 g，大豆粉10.0 g，磷酸二氫鉀0.5 g，pH7.2。發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基（1 000 mL）：葡萄糖5.0 g，大豆粉10.0 g，磷酸二氫鉀0.5 g，pH7.2。

1.2 方法

1.2.1 菌株培養(yǎng)

菌種活化：將保存的菌株Da07210接種于斜面培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)5 d。種子液培養(yǎng)：挑取活化的菌種接入裝有50 mL種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，200 r/min、28 ℃下振蕩培養(yǎng)3 d作為種子液；搖瓶培養(yǎng)：取10 mL種子液接入裝有100 mL培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，28 ℃、200 r/min下恒溫振蕩培養(yǎng)4 d。發(fā)酵液離心收集上清用于抑菌活性測定和物理化學(xué)特性實驗。

1.2.2 抗菌活性物質(zhì)的生物測定

以古巴尖孢鐮刀菌4號生理小種為指示菌，用紙片擴(kuò)散法進(jìn)行抗菌活性物質(zhì)的生物測定[3]。

1.2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

首先采用單因子試驗，對碳源、氮源進(jìn)行優(yōu)化，然后在單因子試驗的基礎(chǔ)上用正交設(shè)計實驗[4]對發(fā)酵培養(yǎng)基做進(jìn)一步優(yōu)化。

1.2.4 發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化

用經(jīng)過優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)基，分別對不同發(fā)酵溫度、pH值、接種量、搖瓶裝量、搖床轉(zhuǎn)速、種齡及發(fā)酵時間進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，測定發(fā)酵液抑菌活性，確定最佳發(fā)酵條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

2.1.1 碳源的優(yōu)化

在其他成分不變基礎(chǔ)上，改變碳源的種類，分別以葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、甘油、可溶性淀粉作為碳源進(jìn)行單因素實驗，取0.5%、1.0%、1.5%這3個濃度水平，每個處理重復(fù)3次，測定發(fā)酵液抗菌活性。結(jié)果表明，菌株Da07210以葡萄糖、甘油為碳源，當(dāng)2種碳源濃度達(dá)到1.0%時，發(fā)酵液抑菌活性最好（見表1）。

2.1.2 氮源的優(yōu)化

在氮源濃度一定（1%）的前提下，分別添加大豆粉、玉米粉、蛋白胨、酵母粉、硫酸銨為氮源進(jìn)行單因素實驗，取0.5%、1.0%、1.5%和2.0%這4個濃度水平，每個處理重復(fù)3次，測定發(fā)酵液抑菌活性。菌株Da07210當(dāng)大豆粉濃度為1.5%，硫酸銨濃度為1.0%時，抑菌圈直徑達(dá)到最大值（見表2）。

2.1.3 碳氮源正交優(yōu)化實驗

根據(jù)單因素實驗結(jié)果，菌株Da07210以甘油、葡萄糖、硫酸銨、大豆粉作為碳氮源，采用L9（34）正交表進(jìn)行碳氮源配比優(yōu)化實驗，每個處理重復(fù)3次。實驗結(jié)果見表3。結(jié)果表明，碳氮源對菌株Da07210合成活性物質(zhì)的影響順序為：葡萄糖>甘油>大豆粉>硫酸銨；最佳碳氮源濃度為：葡萄糖1.0%，甘油1.0%，大豆粉1.5%，硫酸銨0.5%。

2.2 發(fā)酵條件優(yōu)化

2.2.1 溫度對產(chǎn)活性物質(zhì)的影響

采用優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基，不改變其他發(fā)酵條件，確定22、24、26、28、30 ℃5個溫度水平，每個處理重復(fù)3次，測定發(fā)酵液抑菌圈活性。結(jié)果表明，當(dāng)在28 ℃培養(yǎng)時抑菌圈直徑最大，而溫度過高或過低抑菌圈直徑均減小。

2.2.2 起始pH對產(chǎn)活性物質(zhì)的影響

采用優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基，將培養(yǎng)基初始pH值分別調(diào)節(jié)為4、5、6、7、8，每個處理重復(fù)3次，進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，檢測菌株Da07210抗菌效果。結(jié)果表明，pH值為7.0時發(fā)酵液的抑菌圈直徑最大。

2.2.3 接種量對產(chǎn)活性物質(zhì)的影響

在優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基中，分別按裝液量的4%、6%、8%、10%、12%接入培養(yǎng)了48 h的種子液，每個處理重復(fù)3次，測定發(fā)酵液抑菌圈活性。結(jié)果表明，菌株Da07210以8%的接種量最佳。

2.2.4 搖床轉(zhuǎn)速對產(chǎn)活性物質(zhì)的影響

采用優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基，搖床轉(zhuǎn)速設(shè)定為50、100、150、200、250 r/min5個梯度，接種量均為10%，每個處理重復(fù)3次，測定發(fā)酵液抑菌圈活性。實驗結(jié)果表明，Da07210在轉(zhuǎn)速為200～250 r/mi時，活性最好且變化不明顯。

2.2.5 種齡對產(chǎn)活性物質(zhì)的影響

在優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基中，以10%的接種量分別接種培養(yǎng)時間為24、36、48、60、72 h的搖瓶種子，每個處理重復(fù)3次，進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，測定發(fā)酵液抑菌圈活性。菌株Da07210種子液培養(yǎng)48 h，接種后對應(yīng)的發(fā)酵液抑菌圈直徑最大。

2.2.6 發(fā)酵時間對產(chǎn)活性物質(zhì)的影響

采用優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基，其他條件不變，分別發(fā)酵48、72、96、120、144、168 h，每個處理重復(fù)3次，測定發(fā)酵液抑菌圈活性。菌株Da07210發(fā)酵至144 h時活性達(dá)到最大。

3 討論

Streptomyces sp. Da07210的發(fā)酵產(chǎn)物對多種多種土傳真菌病害的病原菌都有拮抗作用，因此具有成為抗生素產(chǎn)生菌的開發(fā)潛力。本實驗得到該菌株的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件，為Streptomyces sp. Da07210進(jìn)一步的工業(yè)開發(fā)利用提供了數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

[1]Ploetz R C. Fusarium Wilt of Banana is Caused by Several Pathogens Referred to As Fusarium oxysporum f. sp. cubense [J].Phytopathology，2006（96）：653–656.

[2]Ploetz R C， Pegg K. Fusarium wilt. In Diseases of Banana [M].Abacá and Enset. Jones D R （Ed.）. Wallingford，UK： CAB International，1999，143-159.

[3]Hunfeld K P， Weigand J， Wichelhaus T A. In vitro Activity of Mezlocillin Meropenem Aztreonam， Vancomycin， Teicoplanin， Ribostamycin and Fusidic Acid Against Borrelia burgdorferi[J].International Journal of Antimicrobial Agents，2001（17）：203-208.

[4]杜榮騫.生物統(tǒng)計學(xué)[M].第2版.北京：高等教育出版社，2003：275.

（責(zé)任編輯：趙中正）