朱佳芳　于文心　馬剛　林曉曦

葡萄酒色斑中GNAQ基因突變的研究進(jìn)展

朱佳芳于文心馬剛林曉曦

【提要】鳥嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白q多肽（G uanine nucleotide binding protein q polypeptide，GNAQ）是GTP結(jié)合蛋白異源三聚體的組成部分，能夠通過結(jié)合細(xì)胞表面受體介導(dǎo)下游信號通路。最近的研究發(fā)現(xiàn)，葡萄酒色斑（P ort-wine stains，PWS）中GNAQ p.Arg183點(diǎn)突變，可能介導(dǎo)細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（E xtracellular signal-regulated kinase，ERK）信號通路。本文對GNAQ基因突變可能介導(dǎo)的下游信號通路，包括絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）、G蛋白信號調(diào)節(jié)因子5（regulator of G protein signaling 5，RGS5）、蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）和YAP等信號通路進(jìn)行綜述。

葡萄酒色斑鳥嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白q多肽絲裂原活化蛋白激酶G蛋白信號調(diào)節(jié)因子5蛋白激酶C

葡萄酒色斑（Port-wine stains，PWS）是先天性毛細(xì)血管畸形，發(fā)病率約為0.3%。Sturge-Weber綜合征是以三叉神經(jīng)眼支支配區(qū)域、軟腦膜和脈絡(luò)膜毛細(xì)血管靜脈畸形為主要特征的綜合征，主要表現(xiàn)為V1/V2區(qū)PWS、青光眼、癲癇、休克及智力發(fā)育遲緩等[1]。Shirley等證實(shí)了PWS中存在體細(xì)胞突變，發(fā)現(xiàn)了GNAQ p.Arg183Gln點(diǎn)突變[2-3]，以及該位點(diǎn)其他突變類型[4-5]，和該突變分布的組織類型[6]。但該突變所參與的信號通路至少有部分與腫瘤中GNAQ常見的突變p.Gln209Leu存在差異[2]，可能是其導(dǎo)致血管壁不正常擴(kuò)張而非惡性腫瘤的原因所在。

1　GNAQ基因及其蛋白質(zhì)

1.1GNAQ基因

編碼人鳥嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白q多肽（GNAQ）的基因位于9q21.2，跨越310 993核苷酸序列，包含7個(gè)外顯子區(qū)域，轉(zhuǎn)錄長度為6 539堿基對（Base pair，bp），開放讀碼框（Open reading frame，ORF）長度為1 080 bp[7]。

1.2GNAQ蛋白結(jié)構(gòu)

G蛋白根據(jù)其α亞單位分成4個(gè)家族，包括Gi、Gs、G12/ 13和Gq。Gq家族包含4個(gè)成員：Gq、G11、G14和G15/16。其相應(yīng)的α亞單位為Gαq、Gα11、Gα14、Gα15/16[8]。GNAQ編碼Gαq蛋白由359個(gè)氨基酸組成，包含兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，一個(gè)Ras樣三磷酸鳥苷酶結(jié)合結(jié)構(gòu)域（Ras-like GTPase binding domain）以及一個(gè)α螺旋結(jié)構(gòu)域（αhelical domain）。這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間形成一個(gè)口袋結(jié)構(gòu)能夠結(jié)合二磷酸鳥苷（G uanosine diphosphate，GDP）。在GTPase結(jié)構(gòu)域中有3個(gè)活動(dòng)結(jié)構(gòu)域稱之為開關(guān)（Switch），包括SwitchⅠ、SwitchⅡ、SwitchⅢ，該結(jié)構(gòu)域氨基酸殘基結(jié)合GTP后能發(fā)生構(gòu)像改變[9]

1.3Gαq蛋白功能

G蛋白偶聯(lián)受體（G protein coupled receptors，GPCRs)是由7個(gè)α螺旋組成的跨膜蛋白，是一類細(xì)胞表面的受體家族[10]。GPCRs主要通過與G蛋白結(jié)合激活下游信號通路。當(dāng)細(xì)胞外配體與GPCRs相結(jié)合后，其構(gòu)像發(fā)生改變，形成一個(gè)結(jié)合袋，與胞質(zhì)內(nèi)的G蛋白異源三聚體Gαβγ結(jié)合，GPCR能起到鳥嘌呤核苷酸交換因子（Guanine nucleotide exchange factor，GEF）的作用，催化α亞單位釋放GDP并與胞質(zhì)內(nèi)高濃度的GTP結(jié)合，在活化狀態(tài)下，Gα亞單位與G-βγ亞單位分離，switchⅠ～Ⅲ發(fā)生構(gòu)像改變[11]。結(jié)合GTP的Gα亞單位或G-βγ亞單位，能通過活化二級信使，如腺苷酸環(huán)化酶（A denylyl cyclase）、磷脂酶C（P hospholipase C，PLC），激活下游信號通路[12]。G蛋白信號調(diào)節(jié)因子（G-protein signaling，RGS）家族能夠加速GTPase的作用，使GTP水解為GDP，此時(shí)的Gαq轉(zhuǎn)變?yōu)榉腔罨癄顟B(tài)，再次以G蛋白異源三聚體的形式存在于胞內(nèi)，停止激活下游信號通路。

2　PWS中GNAQ基因突變

2.1GNAQ（c.548G＞A,p.Arg183Gln）點(diǎn)突變

Shirley等報(bào)道了Sturge-Weber綜合征患者以及PWS患者中GNAQ 4號外顯子單核苷酸突變（c.548G＞A,p. Arg183Gln）。該報(bào)道對Sturge-Weber綜合征患者組織活檢并進(jìn)行全基因組測序，發(fā)現(xiàn)了GNAQ（c.548G＞A,p.Arg183Gln）點(diǎn)突變。該研究組進(jìn)一步對Sturge-Weber綜合征的患者以及無癥狀的PWS患者取樣測序，發(fā)現(xiàn)Sturge-Weber綜合征的患者GNAQ總突變率在88%（23/26），無癥狀PWS患者突變率在92%（12/13），標(biāo)本中等位基因突變頻率為1.0%～18.1%。但并未發(fā)現(xiàn)熱點(diǎn)突變，如GNA11、GNAQ p.Gln209等的突變[2]。

2.2GNAQ（c.547C＞G,p.Arg183Gly）點(diǎn)突變

Frigerio等在證實(shí)原有突變位點(diǎn)的基礎(chǔ)上，首次在PWS皮膚組織中發(fā)現(xiàn)1例新的GNAQ（c.547C＞G,p.Arg183Gly）點(diǎn)突變，組織中突變頻率為4%[4]。

2.3組織分布

Tan等利用激光顯微切割技術(shù)（L aser capturem icroscopy，LCM）從10例PWS皮膚病灶中分離出血管、表皮、毛囊和結(jié)締組織，利用巢式PCR（Nesting PCR）技術(shù)分析了GNAQ（c. 548G→A,p.Arg183Gln）點(diǎn)突變在組織中的分布，證實(shí)了該突變60%（6/10）分布在血管，突變率為3.16%～12.37%。這6例中，20%（2/10）分布在結(jié)締組織，突變率分別為22.17%和6.43%。另外4例血管內(nèi)未發(fā)現(xiàn)突變，但其中2例結(jié)締組織和（或）毛囊/腺體內(nèi)發(fā)現(xiàn)GNAQ突變，突變頻率為2.67%～6.62%[6]。Uchiyama等利用肽核酸（Peptide nucleic acid，PNA）以及數(shù)字微滴多聚酶鏈（Droplet digital PCR，ddPCR）反應(yīng)技術(shù)，提升了組織中GNAQ突變的檢測極限，達(dá)到0.1%（3個(gè)拷貝數(shù)），并首次在10%（4/40）的Sturge-Weber綜合征患者血液白細(xì)胞和唾液中發(fā)現(xiàn)了GNAQ突變[13]。

2016年，Salato等利用ddPCR技術(shù)發(fā)現(xiàn)18例散發(fā)PWS患者組織內(nèi)100%（18/18）存在GNAQ（c.548G→A,p. Arg183Gln）點(diǎn)突變，而Sturge-Weber綜合征患者100%（4/4）皮膚組織及60%（3/5）腦組織中存在該突變。該突變可能成為鑒別PWS與其他脈管畸形的重要依據(jù)之一。

3　突變可能介導(dǎo)的相關(guān)信號通路

3.1MAPK信號通路

活化狀態(tài)下的Gαq通過激活PLCβ，使磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（Phophotidy linositol diphosphate PIP2）水解成肌醇三磷酸（Inositol triphosphate，IP3）和甘油二酯（Diacylglycerol，DAG）[14]。IP3和DAG進(jìn)一步通過二級信使如鈣離子和蛋白激酶C（Protein kinase C，PKC）傳導(dǎo)信號通路。PKC能夠通過磷酸化Raf/MEK1/2/ERK信號通路，從而激活MAPK信號通路[15]。Shirley等[2]發(fā)現(xiàn)，GNAQ p.Arg183Gln點(diǎn)突變能使ERK表達(dá)量顯著增加，但不能使p38和c-Jun氨基端激酶（Jun N-terminal kinase，JNK）過表達(dá)，推測GNAQ p.Arg183Gln點(diǎn)突變是通過ERK途徑過度激活MAPK信號通路。Shirazi檢測到MAPK下游信號通路磷酸化核糖體蛋白S6（Phosphorylated ribosomal protein S6，RPS6），存在于Sturge-Weber綜合征患者PWS組織的畸形血管壁內(nèi)，推測RPS6可能是PWS中MAPK的下游潛在靶點(diǎn)之一[16]。

3.2RGS5信號通路

RGS能夠調(diào)節(jié)Gα蛋白GTPase的作用，抑制下游信號通路。RGS5是RGS家族成員之一，主要在血管平滑肌細(xì)胞（V ascular smooth muscle cells，VSMC）以及周細(xì)胞（P ericytes）中表達(dá)，潛在的作用靶點(diǎn)為Gi和Gq。Cho等發(fā)現(xiàn)敲除Rsg5等位基因的小鼠主動(dòng)脈擴(kuò)張，血壓明顯降低，提示該RSG5可能是調(diào)節(jié)血管收縮的重要因子[17]。PWS組織內(nèi)主要病理特征為毛細(xì)血管及微靜脈擴(kuò)張畸形，猜測GNAQ突變后，其GTPase結(jié)構(gòu)域可能失去RGS5調(diào)控作用而最終導(dǎo)致微血管不正常擴(kuò)張。

3.3PKC信號通路

PKC蛋白家族至少由7個(gè)密切相關(guān)的蛋白質(zhì)組成，被劃分為經(jīng)典型（α，β，γ），新型（δ，ε，η，θ）以及非典型（ζ，λ/ι）等3種同源異構(gòu)體（I soform）。Wu等[18]發(fā)現(xiàn)，enzastaurin能夠選擇性抑制經(jīng)典型（β，γ）以及新型（δ，ε，θ）同源異構(gòu)體，將GNAQ突變細(xì)胞系抑制在G1期，并增加細(xì)胞凋亡。該機(jī)制可能是通過減少ERK磷酸化和細(xì)胞周期蛋白D1（Cyclin D1）表達(dá)從而減少M(fèi)APK信號通路激活實(shí)現(xiàn)。Sotrastaurin為PKC更強(qiáng)的抑制劑，進(jìn)一步證實(shí)了ERK在PKC信號通路中的作用[19]，同時(shí)，也發(fā)現(xiàn)其減少了核轉(zhuǎn)錄因子-kB（N uclear transcription factor-kB，NF-kB）信號通路的表達(dá)。因此，PKC/NF-kB可能是獨(dú)立于MAPK的另一條信號通路[20]。

3.4YAP以及下游信號通路

Hippo信號通路參與器官大小的形成，該通路異常會(huì)導(dǎo)致惡性腫瘤的發(fā)生。Hippo信號通路中，MST1/2以及Lats1/2激酶能夠使YAP磷酸化，使其在胞質(zhì)中處于失活狀態(tài)。YAP/ TAZ去磷酸化能夠激活轉(zhuǎn)錄因子TEAD和SMAD家族，使細(xì)胞增生[21]。細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)了GNAQ基因突變后，使得YAP/TAZ去磷酸化并激活。Feng等[22]發(fā)現(xiàn)，突變的GNAQ蛋白是通過GEF Trio以及下游的GTPase Rho/Rac調(diào)節(jié)YAP信號通路。Rho/Rac能夠聚合肌動(dòng)蛋白并游離血管抑素結(jié)合蛋白（A ngiomotin），增加YAP進(jìn)入核內(nèi)的能力，從而導(dǎo)致核內(nèi)轉(zhuǎn)錄水平增加。

4　展望

GNAQ中的GTP結(jié)合袋（Guanosine triphosphate binding pocket，GTP）結(jié)構(gòu)域183位點(diǎn)精氨酸殘基在所有人Gα亞單位中保守，是GTPase的關(guān)鍵位點(diǎn)。該位點(diǎn)精氨酸殘基被谷氨酸殘基所取代，可能會(huì)使下游信號通路異常激活[23]。GNAQ p. Arg183Gln點(diǎn)突變能使ERK表達(dá)量顯著增加，但不使p38和JNK過表達(dá)[2]。最近研究發(fā)現(xiàn)PWS患者組織中ERK和JNK表達(dá)量增加，提示PWS中可能存在其他突變介導(dǎo)該信號通路的發(fā)生[4]。利用新的PNA-ddPCR技術(shù)，能夠使GNAQ突變檢測極限達(dá)到0.1%（3拷貝數(shù)）[13]。近來，通過二代測序已經(jīng)在PWS組織中發(fā)現(xiàn)了RASA1、SMARCA4、EPHA3、MYB、PDGFR-β和PIK3CA等新的突變[5]，但是GNAQ基因突變?nèi)允墙M織中最精準(zhǔn)可靠的突變位點(diǎn)，隨著檢測技術(shù)的更新及普及，未來該突變可能成為鑒別PWS與其他脈管畸形的重要依據(jù)之一。

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GNAQ M utations in P ort-W ine S tains

ZHU Jiafang,YUWenxin,MA Gang,LIN Xiaoxi.Department of Plastic and Reconstructive Surgery,Shanghai Ninth People's Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200011,China.Corresponding author:LIN Xiaoxi(E-mail:linxiaoxi@126.com).

【Summary】G-alpha-q(GNAQ)is the alpha subunit of the heterotrimeric GTP-binding proteins that mediates the regulators of several downstream signaling through coupling cell surface receptors.Recently,lesionswithin port-wine stains are found harbormutations in GNAQ p.Arg183 and may at least associate with ERK(extracellular signal-regulated kinase) signaling pathways.In this paper,themutations of GNAQ within port-wine stains and themultiple activated signaling targets downstream ofmutant GNAQ,including MAPK,RGS5,PKC and YAP pathwayswere reviewed.

Port-wine stains;Guanine nucleotide binding protein q polypeptide;Mitogen-activated protein kinase; Regulator of G protein signaling 5;Protein kinase C

R732.2

B

1673－0364（2016）05－0322－03

10.3969/j.issn.1673-0364.2016.05.014

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81272127）；上海市衛(wèi)生系統(tǒng)重要疾病聯(lián)合攻關(guān)重點(diǎn)項(xiàng)目（2013ZYJB0014）。

200011上海市上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院整復(fù)外科。

林曉曦（E-mail：linxiaoxi@126.com）。

（2016年3月9日；

2016年3月30日）