和勝菲　周國麗　鄭仕萍　王　芬　范　源云南中醫(yī)學(xué)院，云南　昆明　650500

不同提取溫度的五倍子主要化學(xué)成分HPLC含量測定

和勝菲周國麗鄭仕萍王芬范源*
云南中醫(yī)學(xué)院，云南昆明650500

【摘要】目的:采用高效液相色譜法測定并分析不同提取溫度對(duì)五倍子中單寧酸、五沒食子?；咸烟恰]食子酸含量的影響.方法:以醋酸－醋酸鈉緩沖溶液(pH4. 0)為提取溶劑(液料比1∶100)，分別在65、75、85、95℃中水浴3. 5h，HPLC法測定含量.結(jié)果:在85℃溫度提取條件下，三者可測得最大含量.結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)初步提示提取五倍子中單寧酸、五沒食子酰基葡萄糖、沒食子酸的最佳提取溫度為85℃，可為五倍子的實(shí)驗(yàn)研究和工藝研究提供一定參考.

【關(guān)鍵詞】五倍子;提取溫度;單寧酸;五沒食子酰基葡萄糖(PGG);沒食子酸; HPLC

Different extraction temperatures gallnut main chem ical components of HPLC

HE Sheng－fei ZHOU Guo－li ZHENG Shi－ping WANF Fen FAN Yuan*
Yunnan University of TCM，Kunming 650500，China

Abstract:Objective To measure and analysis the influence of different extract temperature on the content of tannic acid，gallic acid and 1，2，3，4，6－Penta－O－galloyl－β－D－glucopyranose(PGG)in Chinese gall by using high performance liquid chromatography．Methods With sodium acetate acetic acid buffer soiution(pH4)as the extraction solvent(liquid rate 1∶100)，respectively at 65℃，75℃，85℃，95℃water bath in 3. 5h，using HPLC to measure and analysis the extraction of tannic acid，PGG，gallic acid from Chinese gall．Results The content of three are highest on condition of 85℃．Concludes The experiment preliminary suggest extraction temperature of annic acid，PCC，gallic acid from Chinese gall is 85℃，it can provide some reference for the research of experiment and pross of china gall．

Key words:Chinese gall; extraction temperature; tannic acid; PGG; gallic acid; HPLC

五倍子是我國的傳統(tǒng)中藥，已有幾千年的歷史，廣泛用于抗菌、抗病毒、防齲齒、抗氧化、抗癌、抗糖尿病、止瀉、消炎和抗凝血酶等[1].我國五倍子產(chǎn)量約占世界總產(chǎn)量的95%，國際上又把五倍子稱為中國五倍子[2].五倍子中的主要有效成分為鞣質(zhì)及沒食子酸，五倍子中的單寧酸和五沒食子?；咸烟?PGG)是水解類鞣質(zhì)[3].

五倍子中含量最多的成分是五倍子單寧，單寧又名鞣酸、單寧酸，含量約70%，甚至可高達(dá)80%[4].五倍子單寧具有β－五－O－沒食子酸－D－葡萄糖(β－PGG)，另外還含8～9個(gè)沒食子酸[5]，分子式為C76H52O46，結(jié)構(gòu)如圖1所示.五沒食子?；咸鞘翘烊欢喾宇惢衔铮怯善咸烟桥c5個(gè)沒食子酸形成的酯[6]，是五倍子鞣質(zhì)的原型和化學(xué)反應(yīng)的中間途徑[7]，分子式為C41H32O26，結(jié)構(gòu)如圖2所示.沒食子酸(Gallic acid)亦稱五倍子酸或棓酸，在五倍子中約含2%～4%[8]，是天然的多酚類化合物，化學(xué)名3，4，5－三羥基苯甲酸[9]，分子式C7H6O5，結(jié)構(gòu)如圖3所示.

五倍子作為傳統(tǒng)中藥有廣泛應(yīng)用價(jià)值，為更好的利用五倍子的資源，其各有效成分的提取成為研究熱點(diǎn)，本文測定并分析提取溫度對(duì)其活性成分中單寧酸、五沒食子?；咸烟?、沒食子酸的影響.

圖1　單寧酸

圖2　PGG

圖3　沒食子酸

1　材料與試劑

1. 1儀器Agilent1200型高效液相色譜儀(VWD檢測器);電熱恒溫干燥箱DHG－9071(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);高速多功能粉碎機(jī)XY－500A型(浙江省永康市松青五金廠);分樣篩(浙江上虞市五四建材儀器廠);分析天平;電子天平;恒溫水浴鍋.

1. 2試劑單寧酸對(duì)照品(成都邁斯克醫(yī)藥科技有限公司); PGG對(duì)照品(四川成都普瑞法有限公司);沒食子酸對(duì)照品(購自云南省藥檢所);甲醇、乙腈均為色譜純;水為純凈水;其余試劑為分析純醇.

五倍子(購自昆明道地中藥飲片廠)敲碎，除去蟲癭，清洗，烘干，粉碎，過五號(hào)篩密封保存?zhèn)溆?

2　方法

2. 1色譜條件

2. 1. 1單寧酸色譜條件色譜柱: ZORBAX SB－C18柱(4. 6×250mm，5μm);流動(dòng)相:純凈水(A)－甲醇(B)(20∶80);流速: 0. 5ml/min;檢測波長: 275nm;柱溫: 25℃;進(jìn)樣量: 2μl.

2. 1. 2 PGG色譜條件色譜柱: ZORBAX SB－C18柱(4. 6×250mm，5um)流速: 1. 0ml/min;流動(dòng)相: 0. 1%磷酸(A)－乙腈(C)(90∶10)，進(jìn)行梯度洗脫，0～15min，10%～25% C、15～15. 10min，25% C、15. 10～20min，25% C;檢測波長: 280nm;柱溫: 25℃;進(jìn)樣量: 20μl.

2. 1. 3沒食子酸色譜條件色譜柱: ZORBAX SB－C18柱(4. 6×250mm，5μm)流動(dòng)相: 0. 2%磷酸(A)－甲醇(B)(95: 5)流速: 1ml/min;檢測波長: 273nm;柱溫: 25℃;進(jìn)樣量: 10μl.

2. 2對(duì)照品溶液制備

2. 2. 1單寧酸對(duì)照品溶液制備精密稱取單寧酸標(biāo)準(zhǔn)品0. 44mg置于10ml容量瓶中，用50%的甲醇溶解定容至刻度，搖勻作為儲(chǔ)備液.

2. 2. 2 PGG對(duì)照品溶液制備精密稱取PGG標(biāo)準(zhǔn)品0. 45mg，用80%甲醇溶解定容于10ml容量瓶中，搖勻即得.

2. 2. 3沒食子酸對(duì)照品溶液制備精密稱取沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品2. 5mg置于10ml容量瓶中，再加入7ml乙醇、2. 9ml水和0. 1ml丙酮定容至刻度，搖勻即得.

2. 3供試品溶液制備用電子天平精密稱取4份0. 2g五倍子粉末于4個(gè)250ml具塞錐形瓶中，加入20ml配好的pH4. 0醋酸－醋酸鈉緩沖溶液，分別置于65、75、85、95℃恒溫水浴鍋中水浴加熱水解3. 5h，冷卻過濾，精密量取濾液1ml于10ml容量瓶中，加50%甲醇至刻度，搖勻即得.

2. 4標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

2. 4. 1單寧酸標(biāo)準(zhǔn)曲線制備精密稱取單寧酸標(biāo)準(zhǔn)品2. 58μg置于10ml容量瓶中，用乙醇、水、丙酮體積比為69. 9%、29. 8%、0. 3%的溶液溶解并定容至刻度，搖勻.按“2. 1. 1”單寧酸色譜條件分別取2、4、6、8、10μl不同體積進(jìn)樣，以單寧酸的峰面積(Y)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量(X)進(jìn)行線性回歸，得方程y = 5719. 5x－1924. 8(r = 0. 9974)，結(jié)果表明:單寧酸峰面積值與質(zhì)量有良好的線性關(guān)系，線性范圍為0. 516～2. 58μg.

2. 4. 2 PGG標(biāo)準(zhǔn)曲線制備[10]精密稱取單寧酸標(biāo)準(zhǔn)品8mg置于50ml容量瓶中，用甲醇溶解定容至刻度，搖勻.從中精密吸取10ml于25ml容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻.按“2. 1. 2”PGG色譜條件分別取2、4、6、8、10、15μl不同體積進(jìn)樣，以PGG標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量為橫坐標(biāo)(X)，峰面積峰值為縱坐標(biāo)(Y)，得回歸方程為: Y = 2420237X －18. 445(r = 0. 9998)，表明PGG在0. 139～1. 0428μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好.

2. 4. 3沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線制備精密稱取沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品2. 5mg置于25ml容量瓶中，用50%的甲醇溶解定容至刻度，搖勻.分別精密吸取0. 1、0. 5、1、2、4ml于10ml容量瓶中，用50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即配制成濃度為1、5、10、20、40μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液.按“2. 1. 3”沒食子酸色譜條件進(jìn)樣20μl，以沒食子酸的峰面積(Y)對(duì)其濃度(X)進(jìn)線性回歸，得方程Y = 114. 7X + 2. 4554(r = 0. 9999)，結(jié)果表明:沒食子酸峰面積值與濃度有良好的線性關(guān)系，線性范圍為1～10μg/ml.

2. 5含量測定分別取“2. 3項(xiàng)”下方法制備的供試品溶液，按“2. 1”色譜條件分別測定單寧酸、五沒食子?；咸烟呛蜎]食子酸含量，用外標(biāo)法進(jìn)行計(jì)算.

3　結(jié)果

由表1可知，在85℃時(shí)單寧酸、五沒食子?；咸烟?PGG)和沒食子酸可測得最大含量.上述結(jié)果顯示: 85℃為單寧酸、五沒食子?；咸烟?PGG)和沒食子酸的最適提取溫度，并且五沒食子?；咸烟呛蜎]食子酸含量變化受溫度影響較單寧酸大.

表1　不同提取溫度下單寧酸、五沒食子?；咸烟呛蜎]食子酸含量(g)

4　討論

中藥成分復(fù)雜，在提取過程中應(yīng)該盡可能多的提取出其有效活性成分，而在此過程中液料比、提取溶劑種類、提取溫度、pH值等都可能會(huì)影響其含量.在五倍子中，單寧酸的提取方法主要有溶劑提取法、超聲輔助法、加壓提取法、超臨界CO2萃取法，沒食子酸提取有酸水解法、堿水解法和酶水解法，而五沒食子?；咸烟侵饕獮榇冀夥╗11].

本實(shí)驗(yàn)以醋酸－醋酸鈉緩沖溶液(pH4. 0)為提取溶劑，用HPLC法測定分析不同提取溫度下提取液中單寧酸、五沒食子?；咸烟呛蜎]食子酸的含量變化，以期獲得最佳的提取溫度.結(jié)果表明在85℃時(shí)五倍子中單寧酸、五沒食子酰基葡萄糖和沒食子酸可測得最大含量，結(jié)果提示單寧酸含量變化受溫度影響比五沒食子?；咸烟呛蜎]食子酸小.測定并分析不同溫度對(duì)五倍子中單寧酸、五沒食子?；咸烟呛蜎]食子酸的影響可為五倍子的工藝研究及進(jìn)一步開展實(shí)驗(yàn)研究提供參考依據(jù).

參考文獻(xiàn)

[1]Xue－Lian Huang，Ming－Dong Liu，Ji－Yao Li，et al．Chemical composition of Galla chinensis extract and the effect of its main component(s)on the prevention of enamel demineralization in vitro[J]．International Journal of Oral Scienc，2012，4(3): 146－151．

[2]李志國，楊文云，夏定久．中國五倍子研究現(xiàn)狀[J]．林業(yè)科學(xué)研究，2003，16(6): 760－767．

[3]趙勇，王紅，王寶恩，等．中藥水解類鞣質(zhì)PGG的研究進(jìn)展[J]．臨床和實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2013，12(6): 462－464．

[4]張雅麗，李建科，劉柳，等．五倍子單寧對(duì)常見食品腐敗菌和致病菌抑制作用研究[J]．食品工業(yè)科技，2013，34(18): 141－143．

[5]江凱．五倍子單寧提取純化及生理活性的研究進(jìn)展[J]．農(nóng)產(chǎn)品加工·學(xué)刊，2013，(5): 53－56．

[6]Jinhui Zhang，Li Li，Sung－Hoon Kim，et al．Anti－Cancer，Anti－Diabetic Other Pharmacologic Biological Activities of Penta－Galloyl－Glucose[J]．Pharmaceutical Research，2009，26(9): 2066－2080．

[7]Makoto Nishizawa，Takashi Yamagishi．Novel hydrolysable tannins from Nuphar Japonicum DC[J]．Chemical and Pharmaceutical Bulletin，1982，30(3): 1094－1097．

[8]喬彩云，李建科．五倍子及五倍子單寧的研究進(jìn)展[J]．食品工業(yè)科技，2011，32(7): 458－462．

[9]張雅麗，李建科，劉柳，等．五倍子沒食子酸研究進(jìn)展[J]．食品工業(yè)科技，2013，34(10): 386－390．

[10]李霄，艾萍．RP－HPLC雙波長法測定白芍中芍藥苷和五沒食子酰葡萄糖含量[J]．北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，32(2): 122－124．

[11]Lili，AhmadAli，Shaik，et al．Preparation of penta－O－galloyl－β－dglucose from tannic acid and plasmapharmacokinetic analyses by liquid–liquid extraction and reverse－phase HPLC[J]．Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis，2011，54(2): 545－550．

收稿日期:( 2014. 12. 03)

通信作者:范源，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事天然產(chǎn)物活性及機(jī)制研究.E－mail: 1647909799@ qq. com

作者簡介:和勝菲，本科，E－mail: 1332066337@ qq. com

【文章編號(hào)】1007－8517(2015)05－0028－02

【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A

【中圖分類號(hào)】R284. 1