任蓉蓉，任曉楠， 李順，劉丹慧，周曉輝

1. 復(fù)旦大學(xué)附屬公共衛(wèi)生臨床中心，上海 201508； 2. 溫州醫(yī)科大學(xué)，溫州 325035

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乙型肝炎病毒感染動(dòng)物模型的研究進(jìn)展

任蓉蓉1，任曉楠1， 李順1，劉丹慧2，周曉輝1

1. 復(fù)旦大學(xué)附屬公共衛(wèi)生臨床中心，上海 201508； 2. 溫州醫(yī)科大學(xué)，溫州 325035

摘要：乙型肝炎病毒(HBV)感染是威脅全球特別是我國人民健康的重大問題。動(dòng)物模型是研究HBV生物學(xué)特性、感染機(jī)制、與宿主相互關(guān)系及篩選治療性藥物和疫苗的重要工具。近年來，各種動(dòng)物模型的發(fā)展促進(jìn)了HBV相關(guān)研究，但現(xiàn)有模型均存在一定弊端。經(jīng)濟(jì)、適用且與人類感染極度相似的動(dòng)物模型的缺乏嚴(yán)重制約著人們對(duì)HBV的深入研究。本文就已有的HBV感染動(dòng)物模型進(jìn)行綜述，以期為更好模型的建立提供幫助。

關(guān)鍵詞：乙型肝炎病毒；動(dòng)物模型；肝臟

20世紀(jì)80年代，安全、有效的乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)疫苗的出現(xiàn)在一定程度上減緩了HBV的傳播，但乙型肝炎仍是威脅人類健康的全球性問題。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，全球有20億例HBV感染者，其中3.5億例為慢性攜帶者，每年新發(fā)400萬例急性HBV感染[1]，有接近60萬例死于乙型肝炎并發(fā)癥。攜帶HBV表面抗原(HBV surface antigen，HBsAg)的慢性乙型肝炎患者在某些國家占比達(dá)20%，甚至更高。全球30%肝硬化和53%肝細(xì)胞癌來源于HBV感染(在非洲和中國比例更高)[2]。HBV是人類已知的最小DNA病毒，基因組長約3.2 kb，為部分雙鏈DNA。此外，它屬于肝脫氧核糖核酸科，有嚴(yán)格的嗜肝性和種屬特異性，一般侵犯肝臟組織，引起急性和慢性肝炎，且自然狀態(tài)下只能感染人和少數(shù)靈長類動(dòng)物[3]。這樣的特性使得應(yīng)用動(dòng)物模型研究HBV受到限制。因此，獲得一種合適的HBV感染動(dòng)物模型至關(guān)重要。

1非小鼠類HBV感染動(dòng)物模型

黑猩猩是與人類親緣關(guān)系最接近的靈長類動(dòng)物，實(shí)驗(yàn)條件下可被HBV感染，且感染病毒亞型與接種亞型一致，部分有血清酶濃度增高及肝組織活檢改變，表現(xiàn)出與人類急性乙型肝炎相似的免疫反應(yīng)[4]，是研究HBV感染過程中宿主抗病毒反應(yīng)以及評(píng)價(jià)疫苗和藥物療效的最佳模型。在此模型中，發(fā)現(xiàn)HBV感染的肝細(xì)胞損傷主要由免疫介導(dǎo)，且特異性CD8 T細(xì)胞在病毒清除和病理損傷中起關(guān)鍵作用[5,6]。但是，黑猩猩感染HBV后癥狀較人類輕，很少發(fā)展為急性重型肝炎，慢性率也較人類低[7]，加上黑猩猩等非人靈長類動(dòng)物多屬瀕危物種，由于倫理約束、成本昂貴、體型龐大等因素，其在研究方面的應(yīng)用受到很大限制。

由于樹鼩與靈長類動(dòng)物在種系發(fā)生上親緣關(guān)系較近，經(jīng)濟(jì)易得，受到了研究者關(guān)注。樹鼩感染HBV后，與人急性自限性肝炎相似：血清中很快出現(xiàn)抗HBsAg和抗HBV e抗原(HBV e antigen，HBeAg)抗體，HBsAg消失[8]。此外，用HBV體外感染分離的樹鼩原代肝細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)有HBV共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(covalently closed circular DNA，cccDNA)及mRNA合成，上清液中可檢測到分泌的HBsAg和HBeAg，故可作為體外研究HBV細(xì)胞感染機(jī)制的模型[9]。但樹鼩個(gè)體差異較大，感染效率低，感染HBV后病毒載量低且為一過性，對(duì)樹鼩進(jìn)行研究的試劑及抗體不充足等制約著其在HBV研究領(lǐng)域中的應(yīng)用。

此外， HBV相關(guān)嗜肝病毒，如鴨乙型肝炎病毒(duck hepatitis B virus，DHBV)、土撥鼠乙型肝炎病毒(woodchuck hepatitis B virus，WHV)等可分別感染鴨和土撥鼠。DHBV感染鴨后，基因組主要以cccDNA形式存在，且在細(xì)胞內(nèi)高度穩(wěn)定[10]。WHV感染的土撥鼠可發(fā)生慢性感染并易發(fā)生肝細(xì)胞性肝癌[11]。這些HBV或HBV相關(guān)病毒感染模型對(duì)研究HBV感染過程及評(píng)價(jià)疫苗和藥物的效果起了極大作用，但某些限制使其不能成為研究HBV的常規(guī)動(dòng)物模型(表1)。與上述模型相比，小鼠可能是更為合適的模型并受到越來越多研究者的重視與發(fā)掘，不同類型的小鼠模型廣泛應(yīng)用于HBV相關(guān)研究。

表1HBV動(dòng)物模型及其優(yōu)缺點(diǎn)

Tab.1Advantages and disadvantages of HBV animal models

模型優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)備注非人靈長類易受HBV自然感染;與人類感染極度相似受倫理限制;費(fèi)用高;體型大與人類基因相似樹鼩體型相對(duì)較小;可直接感染HBV感染效率低;只引起瞬間、輕度感染;病毒載量低起源上與靈長類接近鴨、土撥鼠等可被HBV相關(guān)病毒感染;原代肝細(xì)胞易獲取體型相對(duì)較大;免疫背景不清楚;HBV相關(guān)病毒與HBV不同,所獲的數(shù)據(jù)可能不適用于HBV為HBV相關(guān)病毒宿主小鼠體型小,易控制;價(jià)格便宜,易獲得;遺傳背景清晰;繁育周期短,產(chǎn)仔多;小鼠基因修飾的技術(shù)和試劑較多小鼠無HBV受體,不被自然感染;HBV基因組轉(zhuǎn)入技術(shù)要求高,操作較復(fù)雜;免疫缺陷小鼠飼養(yǎng)條件要求嚴(yán)格與人類生物學(xué)差異大,但可應(yīng)用特殊技術(shù)方法改建;所獲結(jié)果可能不完全適用于人體

2小鼠類HBV感染動(dòng)物模型

2.1轉(zhuǎn)基因小鼠

理想的HBV轉(zhuǎn)基因小鼠模型應(yīng)是表達(dá)人HBV受體的轉(zhuǎn)基因小鼠，這樣可更好地模擬HBV感染人肝細(xì)胞的過程(自然吸附、進(jìn)入肝細(xì)胞、復(fù)制并增殖)。然而，對(duì)于介導(dǎo)HBV進(jìn)入肝細(xì)胞的受體，最近有報(bào)道稱鈉離子/?；悄懰峁厕D(zhuǎn)運(yùn)蛋白(sodium taurocholate cotransporting polypeptide，NTCP)是人HBV的功能性受體之一[12]，但小鼠NTCP中沒有發(fā)現(xiàn)病毒入侵所需的分子決定基[13]，且是否有共受體目前仍不清楚。因此，具有HBV受體的轉(zhuǎn)基因小鼠模型的建立仍需進(jìn)一步深入研究。盡管HBV不能自然感染小鼠，但通過不同技術(shù)方法，人們還是建立了眾多不同的轉(zhuǎn)基因小鼠模型并用于HBV研究。

轉(zhuǎn)基因技術(shù)的主要路線：采用顯微注射的方法，將HBV部分、全長或超長基因組注射到小鼠受精卵中，獲得表達(dá)HBV單基因產(chǎn)物和供HBV復(fù)制的轉(zhuǎn)基因小鼠，同時(shí)在子代小鼠中也可檢測到HBV基因表達(dá)[14]。現(xiàn)階段應(yīng)用較多的是1.3倍HBV基因組(HBV1.3)的轉(zhuǎn)基因小鼠，通過在HBV全長末端添加增強(qiáng)子和調(diào)節(jié)子，小鼠體內(nèi)可同時(shí)檢測到HBsAg、HBV核心抗原(HBV core antigen，HBcAg)及HBeAg[15]。HBV可在肝細(xì)胞中復(fù)制并釋放入血，但不能繼續(xù)感染新的肝細(xì)胞。有觀點(diǎn)認(rèn)為，HBV1.3轉(zhuǎn)基因小鼠在血清學(xué)和免疫學(xué)方面與經(jīng)垂直傳播形成的慢性HBV感染者相似，是研究HBV垂直傳播致乙型肝炎慢性化的較好模型[16]，但也有學(xué)者認(rèn)為兩者形成的耐受機(jī)制及疾病發(fā)展后果有所不同。

雖然這種小鼠模型被廣泛應(yīng)用于研究HBV感染發(fā)病機(jī)制和篩選抑制HBV復(fù)制的抗HBV藥物，但仍存在一些缺陷：① 由于小鼠肝細(xì)胞表面缺乏HBV受體，所以該模型不能用于病毒侵入與細(xì)胞間播散的研究；②在轉(zhuǎn)基因小鼠中，HBV轉(zhuǎn)錄的天然模板——cccDNA不能被檢測到；③由于在胚胎發(fā)育期將HBV基因組轉(zhuǎn)入，所以轉(zhuǎn)基因小鼠對(duì)HBV組分產(chǎn)生免疫耐受，不能形成肝炎。

在此模型中，乙型肝炎發(fā)病機(jī)制的研究主要依賴過繼免疫。在這種小鼠體內(nèi)過繼轉(zhuǎn)移針對(duì)HBV抗原特異的細(xì)胞毒性T細(xì)胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)后，可建立小鼠急性肝炎模型[17,18]；將HBV轉(zhuǎn)基因小鼠與免疫缺陷小鼠〔如嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷(severe combined immunodeficiency，SCID)[19]小鼠、重組激活基因1(recombination activating gene 1，Rag1)缺失(Rag1-/-)[20]小鼠〕雜交，得到適應(yīng)性免疫缺陷但有HBV表達(dá)復(fù)制的小鼠，然后將同系小鼠原始脾細(xì)胞過繼到雜交鼠中，則可產(chǎn)生對(duì)HBV的免疫應(yīng)答并伴肝臟慢性炎癥?；谶@些模型，發(fā)現(xiàn)對(duì)HBV的細(xì)胞免疫應(yīng)答(尤其是CTL的應(yīng)答)程度決定了HBV的感染結(jié)果[21]。除特異性殺傷HBV陽性細(xì)胞外，HBV特異性CTL可介導(dǎo)炎癥因子(γ干擾素、腫瘤壞死因子α)的分泌，通過非細(xì)胞溶解途徑抑制HBV DNA的表達(dá)和復(fù)制[22,23]。這些模型可研究HBV感染過程中宿主免疫系統(tǒng)與病毒的相互關(guān)系，加深對(duì)HBV免疫病理機(jī)制的認(rèn)識(shí)。但此模型操作過程較復(fù)雜，且與人感染HBV的自然病程不相符，因此不能廣泛應(yīng)用于對(duì)HBV的研究。

2.2HBV轉(zhuǎn)染模型

為進(jìn)一步模擬HBV感染過程中病毒與宿主免疫系統(tǒng)的相互作用，研究者用不同方法將HBV基因轉(zhuǎn)入小鼠肝細(xì)胞中。

2.2.1高壓水動(dòng)力法高壓水動(dòng)力注射法(hydrodynamic injection)是在較短的時(shí)間內(nèi)(5~8 s)將大量(體重的8%~10%)含目的DNA的生理鹽水通過尾靜脈注射入小鼠體內(nèi)[24]，是一種對(duì)小鼠負(fù)荷較重但能使注射DNA特異性轉(zhuǎn)移到肝的較好方法。用此種方法注射HBV1.3質(zhì)粒到免疫系統(tǒng)健全的小鼠中，能引起HBV在肝臟復(fù)制，血中HBV DNA可達(dá)8×106拷貝/ml。同時(shí)，病毒抗原和復(fù)制中間物可引起急性自限性反應(yīng)。Yang等在 B10.D2 小鼠中觀察到HBV抗原在高壓水動(dòng)力注射7 d后消失，伴隨抗體產(chǎn)生；注射15 d后HBV轉(zhuǎn)錄和復(fù)制中間體被清除，伴隨抗病毒性CD8+T細(xì)胞反應(yīng)發(fā)生；而在功能性T細(xì)胞、B細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞(natural killer，NK細(xì)胞)缺失的非肥胖糖尿病(non-obese diabetic，NOD)/SCID小鼠中，病毒復(fù)制可持續(xù)超過80 d[25]。這種方法打破了種族屏障，增加了HBV DNA的轉(zhuǎn)染效率。

基于以上研究，陳培哲團(tuán)隊(duì)通過高壓水動(dòng)力法注射以腺相關(guān)病毒(adeno-associated virus，AAV)為載體的HBV1.2質(zhì)粒到有正常免疫應(yīng)答的C57BL/6小鼠體內(nèi)，成功建立了慢性轉(zhuǎn)染模型[26]。然而，這種模型只有40%的注射小鼠能持續(xù)24周表達(dá)HBV抗原。之后，他們又用8種不同品系小鼠造模，發(fā)現(xiàn)在不同品系小鼠中HBV清除率不同，表明宿主的基因組成在一定程度上影響HBV的感染結(jié)果[27]。周曉輝課題組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也支持上述結(jié)論：用高壓水動(dòng)力法注射pAAV-HBV1.2質(zhì)粒到C3H/HeN 小鼠中，近90%小鼠HBV持續(xù)感染達(dá)46周[28]，表明C3H/HeN 小鼠更適合用于HBV持續(xù)感染的研究。因此，應(yīng)根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x用不同品系的小鼠。這種基于高壓水動(dòng)力的HBV轉(zhuǎn)染模型為體內(nèi)研究HBV持續(xù)感染提供了可能。

另一種基于高壓水動(dòng)力法研究體內(nèi)cccDNA的模型由鄧強(qiáng)團(tuán)隊(duì)構(gòu)建：將lox-P嵌合到緊接質(zhì)粒骨架的HBV單倍基因組內(nèi)含子中，通過Cre/loxP系統(tǒng)剪接去除質(zhì)粒骨架，在肝細(xì)胞核中形成含嵌合體的重組cccDNA。在轉(zhuǎn)錄過程中，嵌合體隨內(nèi)含子被剪切，從而獲得 cccDNA，達(dá)到不影響HBV生活周期的目的。這種模型可在正常免疫系統(tǒng)小鼠中研究cccDNA在HBV持續(xù)感染中所起的作用，供基于cccDNA靶點(diǎn)藥物的研究[29]。

需注意的是，高壓水動(dòng)力轉(zhuǎn)染模型由于短時(shí)間內(nèi)將大劑量基因組導(dǎo)入小鼠體內(nèi)，會(huì)造成小鼠肝臟或其他組織物理損傷，可能產(chǎn)生非特異性影響。

2.2.2腺病毒載體和AAV包含HBV 1.3的腺病毒載體AdHBV可有效將HBV基因轉(zhuǎn)染至肝細(xì)胞[30]。靜脈注射AdHBV后，HBV可在小鼠肝臟成功復(fù)制，肝臟中丙氨酸轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)上升并產(chǎn)生HBV特異性T細(xì)胞。在誘導(dǎo)B細(xì)胞應(yīng)答、血清抗體轉(zhuǎn)陽并產(chǎn)生中和抗體后，感染結(jié)束[31]。這種由腺病毒介導(dǎo)的HBV感染是急性自限性的，可用于研究免疫介導(dǎo)的病毒清除機(jī)制。但由于免疫系統(tǒng)對(duì)腺病毒載體的應(yīng)答，這種模型不能建立HBV長期感染。為克服這一障礙，有研究者嘗試用低劑量腺病毒載體獲得持續(xù)性HBV感染模型[32]，可用于研究慢性HBV感染的發(fā)病機(jī)制和新的治療藥物。

與低劑量腺病毒載體相似，應(yīng)用重組AAV載體也可構(gòu)建HBV慢性感染模型。在AAV2/8介導(dǎo)的HBV轉(zhuǎn)染小鼠模型中，血清HBsAg、HBeAg和HBV DNA可持續(xù)至少1年[33]。與臨床HBV攜帶者相似，這種AAV/HBV小鼠血清抗體陰性，用傳統(tǒng)HBV疫苗加佐劑鋁免疫，不能誘導(dǎo)產(chǎn)生針對(duì)HBV的免疫反應(yīng)。用CpG(Toll樣受體9的興奮劑)佐劑與HBsAg聯(lián)合免疫，不僅能使機(jī)體清除病毒血癥，還可產(chǎn)生T細(xì)胞和B細(xì)胞免疫應(yīng)答，HBV DNA復(fù)制和蛋白表達(dá)減少[34]。AAV/HBV小鼠可用于研究HBV免疫耐受的形成機(jī)制及篩選評(píng)估HBV免疫治療的方法。

2.3人源化小鼠

在以上小鼠模型中，HBV并不是真正通過感染進(jìn)入小鼠肝細(xì)胞，因此這些模型不能反映HBV的自然感染狀態(tài)。

2.3.1人肝嵌合小鼠為更好地模擬HBV自然感染，研究者嘗試將人肝細(xì)胞移植至小鼠體內(nèi)，建立了“三嵌合體”小鼠模型。正常小鼠經(jīng)射線全身照射滅活免疫系統(tǒng)后，給予SCID小鼠骨髓重建造血功能，形成可接受外來移植物的環(huán)境；然后，移植HBV感染的人肝細(xì)胞至腎被膜下。在此“三嵌合體”模型中，85%的小鼠在移植1個(gè)月后仍能檢測到人肝組織存在。小鼠發(fā)生HBV病毒血癥，病毒滴度最高為2.5×105拷貝/ml血液，持續(xù)時(shí)間只有20 d左右[35]。這種模型適用于免疫治療的短期研究，并可作為 HBV感染蛋白疫苗的研究模型。然而，腎被膜中存活的肝細(xì)胞數(shù)量很少且不能形成正常肝組織結(jié)構(gòu)；模型建立極其費(fèi)時(shí)，不適合大規(guī)模實(shí)驗(yàn)；移植的人肝細(xì)胞維持功能時(shí)間段短等不足嚴(yán)重影響了其應(yīng)用。

為使人肝細(xì)胞在小鼠體內(nèi)的存活時(shí)間延長且具有肝臟的正常功能，易被HBV感染，研究人員經(jīng)過大量努力建立了多種穩(wěn)定表達(dá)人肝細(xì)胞的小鼠模型。這些模型的構(gòu)建思路：運(yùn)用免疫缺陷小鼠，防止發(fā)生移植排斥反應(yīng)；在小鼠體內(nèi)表達(dá)有肝臟毒性的基因使小鼠肝臟損傷，從而為人肝細(xì)胞的植入提供空間。目前常用的有以下幾種模型。

尿激酶型纖溶酶原激活物(urokinase type plasminogen activator，uPA)/SCID小鼠模型：應(yīng)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將肝臟的白蛋白(albumin，Alb)啟動(dòng)子與uPA基因相關(guān)聯(lián)。這種Alb-uPA小鼠在肝臟中大量表達(dá)uPA，可觀察到肝細(xì)胞大量死亡。然后，將Alb-uPA小鼠與SCID小鼠雜交，獲得的Alb-uPA/SCID小鼠可接受人肝細(xì)胞植入，且人肝細(xì)胞嵌入達(dá)15%[36]。這種嵌合小鼠帶有人肝細(xì)胞，因而可被HBV感染，便于研究HBV侵入及復(fù)制的生理機(jī)制，但免疫缺陷和易出血的特點(diǎn)使其易于感染及受傷死亡。

Fah-/-Rag2-/-Il2rg-/-小鼠模型：這種小鼠缺失延胡索酰乙酰乙酸水解酶(fumarylacetoacetate hydrolase，F(xiàn)ah)、Rag2、白細(xì)胞介素2受體γ鏈(interleukin 2 receptor, γ chain，Il2rg)基因。Fah是酪氨酸代謝途徑的關(guān)鍵酶，其缺失會(huì)導(dǎo)致毒性酪氨酸積累，小鼠發(fā)生肝損。而移植的人肝細(xì)胞由于人Fah的存在得以保留下來并表現(xiàn)出一定的生長優(yōu)勢。在這種人肝嵌合小鼠(Fah-/-Rag2-/-Il2rg-/-)中可建立HBV的有效感染[36]，HBV持續(xù)擴(kuò)增達(dá)6個(gè)月[37]。

反式四環(huán)素轉(zhuǎn)錄活化因子(reverse tetracycline transcriptional activator，rtTA)/SCID小鼠模型：為克服以上2種小鼠模型出生死亡率高、手術(shù)窗口期短且手術(shù)難度高的問題，研究人員構(gòu)建了rtTA/SCID小鼠。rtTA小鼠的rtTA受小鼠Alb啟動(dòng)子調(diào)控，將rtTA小鼠與SCID小鼠雜交，得到rtTA/SCID小鼠。在構(gòu)建的重組腺病毒載體Ad.TRE-uPA中，uPA位于四環(huán)素效應(yīng)元件(tetracycline responsive element，TRE)下游。用Ad.TRE-uPA處理rtTA/SCID小鼠，這樣在多西環(huán)素(四環(huán)素衍生物)的存在下，rtTA與TRE結(jié)合而促使下游基因uPA開放轉(zhuǎn)錄，uPA在肝細(xì)胞中表達(dá)并引起廣泛肝臟損傷，誘導(dǎo)肝細(xì)胞的損傷程度可受Ad.TRE-uPA劑量調(diào)控[38]。這種模型靈活性強(qiáng)，誘導(dǎo)肝臟損傷的處理方法簡單，可人為選擇肝臟損傷程度和時(shí)間點(diǎn)。

TK-NOG小鼠模型：是一種可使移植的人肝臟組織及功能長期保持穩(wěn)定而不需使用外源性藥物的人肝嵌合小鼠模型。TK-NOG小鼠利用由肝臟Alb啟動(dòng)子控制的Ⅰ型單純皰疹病毒胸苷激酶(herpes simplex virus type Ⅰ thymidine kinase，HSVtk)與環(huán)氧鳥苷(gancyclovir，GCV)結(jié)合，形成強(qiáng)毒性代謝物，并作為DNA和RNA鏈的終止劑使小鼠肝細(xì)胞死亡，繼而可移植人肝細(xì)胞。在這種模型中，人肝細(xì)胞功能可持續(xù)8個(gè)月[39]。

人肝嵌合小鼠模型能被HBV感染，肝細(xì)胞核內(nèi)可形成cccDNA，有助于在體內(nèi)研究HBV感染過程，并用于藥物檢測，是研究HBV感染的較好模型。但由于沒有正常免疫系統(tǒng)，小鼠死亡率很高，且不能研究HBV引起的免疫病理機(jī)制，不適用于慢性HBV感染及治療性疫苗的研究。同時(shí)，模型構(gòu)建復(fù)雜、費(fèi)用昂貴也限制了其發(fā)展。

2.3.2人肝/免疫系統(tǒng)雙嵌合小鼠以上人肝嵌合小鼠模型沒有功能性免疫系統(tǒng)，只能支持HBV感染和復(fù)制，但沒有明顯的肝臟疾病形成[37]。對(duì)于HBV感染模型來說，小鼠體內(nèi)既有人免疫系統(tǒng)，又有人肝細(xì)胞，更接近人體內(nèi)HBV感染及其引起的免疫病理狀態(tài)。

AFC8-huHSC/Hep小鼠模型，即用FK506結(jié)合蛋白(可抑制排斥反應(yīng))和受Alb啟動(dòng)子調(diào)控的半胱天冬酶8 (AFC8)處理BALB/cRag2-/-γc-/-小鼠，導(dǎo)致肝臟損傷；同時(shí)聯(lián)合移植同基因的人CD34+造血干細(xì)胞(hematopoietic stem cell，HSC)和肝臟祖細(xì)胞，形成有效的人白細(xì)胞和肝細(xì)胞。這種小鼠可被丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)感染，并引起相應(yīng)的免疫應(yīng)答和肝臟疾病[40]。另一種模型是用攜帶兩套小鼠Alb啟動(dòng)子調(diào)控的uPA新品系免疫缺陷小鼠uPA-NOG，在6周時(shí)通過注射人肝細(xì)胞和造血干細(xì)胞重建人肝臟和免疫細(xì)胞[41]。還有研究人員用人造血干細(xì)胞和肝臟祖細(xì)胞重建免疫缺陷的A2/NSG小鼠〔包含人類白細(xì)胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)-A2 基因的NOD.Cg-Prkdc(SCID)Il2rg tm1Wjl/SzJ小鼠〕，得到的A2/NSG-huHSC/Hep小鼠可支持HBV感染，接近75%的HBV感染小鼠持續(xù)感染至少4個(gè)月[42]。

值得注意的是，這幾種肝細(xì)胞和造血干細(xì)胞來源于同基因的模型只能檢測到很少的人肝細(xì)胞嵌入。如用HLA不匹配的造血干細(xì)胞和成熟人肝細(xì)胞移植可達(dá)到較高的人肝細(xì)胞嵌合。用Fah-/-Rag2-/-Il2rg-/-NOD小鼠(FRGN)經(jīng)二甲磺酸丁酯(抗腫瘤藥)和Ad∶uPA處理后，共移植成人肝細(xì)胞和造血干細(xì)胞。移植后的4個(gè)月中人肝嵌合超過80%且造血細(xì)胞水平較高。此外，還檢測到人肝臟巨噬細(xì)胞(Kupffer細(xì)胞)在嵌合肝中的表達(dá)[43]。這種雙嵌合小鼠可用于研究HBV感染狀態(tài)下肝臟與免疫系統(tǒng)的相互作用。

但以上小鼠模型中，胸腺并不人源化，因此還不完全具有人免疫系統(tǒng)的特點(diǎn)。最近的HIS-HUHEP(人免疫細(xì)胞和人肝細(xì)胞)小鼠，是在有uPA的BALB/cRag2-/-Il2rγ-/-NOD.sirpa小鼠中共移植人免疫細(xì)胞和造血細(xì)胞。在此小鼠中可檢測到至少5個(gè)月高水平的人肝嵌合和人骨髓淋巴細(xì)胞[44]，為研究嗜肝病毒的免疫病理機(jī)制及篩選藥物和疫苗提供了廣闊平臺(tái)。

不過，以上模型所用小鼠為免疫缺陷鼠，死亡率高，對(duì)環(huán)境的要求較嚴(yán)格；所需人組織來源受限；所需操作精細(xì)，對(duì)操作者要求高；模型構(gòu)建復(fù)雜。這些因素都成為發(fā)展這種新型小鼠的瓶頸。

綜上所述，HBV感染動(dòng)物模型在技術(shù)和內(nèi)容上不斷豐富和完善，各模型有各自的特點(diǎn)被用于不同研究，對(duì)HBV分子生物學(xué)和感染人體后的相關(guān)病理機(jī)制、與人免疫系統(tǒng)的相互作用及藥物和疫苗的研究起了關(guān)鍵作用。但人們也認(rèn)識(shí)到：乙型肝炎尚未完全被攻克，針對(duì)HBV還有一系列重要的科學(xué)問題需探索，如HBV進(jìn)入肝細(xì)胞的過程和機(jī)制、病毒持續(xù)感染的決定性分子機(jī)制、cccDNA持續(xù)存在的原因等，而現(xiàn)有的各種模型均有一定弊端。因此，還需進(jìn)一步完善動(dòng)物模型，使其來源方便、經(jīng)濟(jì)適用、能極度模擬HBV感染人體的完整過程及人體應(yīng)答。只有通過合適的動(dòng)物模型對(duì)有關(guān)HBV感染的關(guān)鍵問題闡述清楚，人們才能找到有效戰(zhàn)勝乙型肝炎的方法。

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Corresponding authors. JIAO Xin-An, E-mail: jiao@yzu.edu.cn；GENG Shi-Zhong, E-mail: gszhong@yzu.edu.cn

·綜述·

A review on the animal models for hepatitis B virus infection

REN Rong-Rong1, REN Xiao-Nan1, LI Shun1, LIU Dan-Hui2, ZHOU Xiao-Hui1

1. Public Health Clinical Center Affiliated to Fudan University, Shanghai 201508, China; 2. Wenzhou Medical University, Wenzhou 325035, China

Abstract:Hepatitis B virus (HBV) infection is a major health problem in the world, especially in China. Animal model is an important tool for studying HBV biological characteristics, pathogenesis of infection, virus-host interplay, and screening for novel therapeutic targets and compounds. In recent years, the development of various animal models accelerates HBV-related researches. However, all the existing models have their own disadvantages. Lack of economical and applicable animal models that could imitate the natural course of human infection has seriously restricted the further study of HBV. This paper summarizes the current HBV animal models.

Key words:Hepatitis B virus; Animal model; Liver

通信作者：焦新安，耿士忠

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金(31230070)，國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(2011AA10A212)，江蘇省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題(0273896034819)，國家博士后基金(2014M551670)，江蘇省自然科學(xué)基金(BK20151306)

收稿日期：(2015-08-02)