張俊琪，謝幼華，王葳，劉晶，袁正宏，瞿滌

復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系，上海 200032

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細(xì)菌學(xué)綜合性實驗在《醫(yī)學(xué)微生物學(xué)》教學(xué)中的應(yīng)用效果分析

張俊琪，謝幼華，王葳，劉晶，袁正宏，瞿滌

復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系，上海 200032

摘要：通過綜合性實驗“人體腸道桿菌的分離與鑒定”，讓醫(yī)學(xué)本科生接受包括傳統(tǒng)的細(xì)菌學(xué)分離鑒定技術(shù)和現(xiàn)代分子生物學(xué)16S rRNA核苷酸序列分析技術(shù)在內(nèi)的系統(tǒng)培訓(xùn)，更新了知識體系，增加了學(xué)生的動手機(jī)會，激發(fā)了學(xué)生的學(xué)習(xí)熱情，培養(yǎng)了學(xué)生獨立分析問題和解決問題的能力，為培養(yǎng)高素質(zhì)應(yīng)用型醫(yī)學(xué)人才打下基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：醫(yī)學(xué)微生物學(xué)；綜合性實驗；教學(xué)改革

《醫(yī)學(xué)微生物學(xué)》作為臨床醫(yī)學(xué)、基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)、法醫(yī)學(xué)、護(hù)理學(xué)等醫(yī)學(xué)相關(guān)專業(yè)的必修基礎(chǔ)課，為學(xué)習(xí)臨床各科的感染性疾病、免疫性疾病、腫瘤相關(guān)性疾病等奠定了重要的理論基礎(chǔ)?！夺t(yī)學(xué)微生物學(xué)》實驗課是理論知識實際應(yīng)用和演練的平臺，是《醫(yī)學(xué)微生物學(xué)》教學(xué)中的重要組成。實驗課教學(xué)不僅是組織學(xué)生對理論知識的驗證性體會，更是培養(yǎng)學(xué)生動手能力、綜合理解能力及創(chuàng)新能力的重要途徑。

傳統(tǒng)的《醫(yī)學(xué)微生物學(xué)》實驗教學(xué)存在明顯的不足，主要表現(xiàn)在以下幾個方面[1,2]：① 實驗教學(xué)內(nèi)容較為零散，雖然包括細(xì)菌染色、平板劃線、質(zhì)粒轉(zhuǎn)化與接合等基礎(chǔ)性實驗，但各實驗之間相關(guān)性不強(qiáng)；②實驗教學(xué)內(nèi)容以驗證性為主，缺乏探究性和綜合性內(nèi)容；③某些實驗教學(xué)內(nèi)容陳舊，存在與臨床脫節(jié)的現(xiàn)象。因此，傳統(tǒng)的實驗教學(xué)模式不利于學(xué)生分析問題、解決問題等綜合能力的培養(yǎng)，也很難激發(fā)學(xué)生的協(xié)作能力和創(chuàng)新能力，迫切需要新的教學(xué)理念的注入和教學(xué)方法的改進(jìn)，以提高本科生《醫(yī)學(xué)微生物學(xué)》實驗教學(xué)的效果。

在《醫(yī)學(xué)微生物學(xué)》的理論和實驗教學(xué)中，“腸道致病菌的分離與鑒定”一直是教學(xué)內(nèi)容的重點和難點。但是，隨著國家《病原微生物實驗室生物安全管理條例》和《可感染人類的高致病性病原微生物菌(毒)種或樣本運輸管理規(guī)定》等相關(guān)實驗室生物安全法律法規(guī)的出臺，志賀菌、傷寒沙門菌等重要腸道致病菌實驗均不能在教學(xué)實驗室內(nèi)進(jìn)行，制約了《醫(yī)學(xué)微生物學(xué)》教學(xué)實驗的開展。因此，從2006年起，本教研室就開始對本科生細(xì)菌學(xué)的實驗教學(xué)內(nèi)容進(jìn)行改革[4]，在以往實驗教學(xué)的基礎(chǔ)上重新設(shè)計和開展綜合性實驗教學(xué)活動——“人體腸道桿菌的分離與鑒定”，通過分離與鑒定正常人體腸道桿菌的過程，讓學(xué)生系統(tǒng)地學(xué)習(xí)并理解傳統(tǒng)的細(xì)菌分離純化和生化鑒定方法。從2013年起，又逐步在該系統(tǒng)實驗中引入現(xiàn)代分子生物學(xué)的16S rRNA基因序列分析技術(shù)和方法，并在小班教學(xué)(每班20人左右)中加以實施。通過比較兩種菌種鑒定方法的各自特點，增強(qiáng)了學(xué)生分析和解決問題的能力，更新了知識體系，讓基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)教學(xué)與臨床醫(yī)學(xué)實踐更緊密地聯(lián)系起來。同時，由于標(biāo)本來自于正常人體，達(dá)到了病原微生物實驗室生物安全管理的要求[3-5]。

1材料與方法

1.1教學(xué)對象

復(fù)旦大學(xué)2011級和2012級臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)六年制本科生，其中女同學(xué)26名，男同學(xué)10名。

1.2教學(xué)材料、教學(xué)安排及教學(xué)實驗結(jié)果

1.2.1標(biāo)本來源普通糞便標(biāo)本12份，由學(xué)生自己采集提供，置甘油保存液中備用。

1.2.2材料與試劑API 10S 革蘭陰性細(xì)菌生化反應(yīng)鑒定條購自生物梅里埃中國有限公司，麥康凱和普通瓊脂培養(yǎng)基購自上海疾病預(yù)防控制中心，細(xì)菌基因組提取試劑盒、聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)擴(kuò)增試劑盒(Taq)、TA克隆試劑盒、瓊脂糖凝膠等購自生工生物工程(上海)有限公司。DNA引物由生工生物工程(上海)有限公司合成并經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)純化，引物序列見表1。核苷酸序列測定由鉑尚生物技術(shù)(上海)有限公司完成。

表1腸道桿菌16S rRNA通用擴(kuò)增引物序列

Tab.1The universal primers for enterobacteriaceae 16S rRNA

PrimerSequence(5'-3')SizeofPCRproduct16SrRNA-27FAGAGTTTGATCCTGGCTCAG16SrRNA-1492RGGTTACCTTGTTACGACTTAbout1.45kb

表2實驗安排

Tab.2Arrangement of experiment

第9教學(xué)周學(xué)習(xí)糞便標(biāo)本的采集、保存和運輸方法,采集普通糞便標(biāo)本12份,并置于甘油保存液中保存?zhèn)溆玫?0教學(xué)周麥康凱平板上分區(qū)劃線接種糞便標(biāo)本,置37℃培養(yǎng)16~18h后于4℃冷庫保存?zhèn)溆玫?1教學(xué)周觀察并記錄麥康凱平板上菌落的特征,從中選取單個菌落進(jìn)行革蘭染色,同時取該單個菌落接種于LB液體培養(yǎng)基增菌,培養(yǎng)物于4℃冷庫保存?zhèn)溆玫?2教學(xué)周(1)制備實驗要求密度的待檢細(xì)菌懸液并接種于API10S革蘭陰性細(xì)菌生化反應(yīng)鑒定條,于37℃培養(yǎng)16~18h后置4℃冷庫保存1周備用(2)K-B紙片擴(kuò)散法藥敏試驗測定待檢細(xì)菌對4種抗生素(卡那霉素、慶大霉素、鏈霉素和復(fù)合磺胺)的耐藥性(3)制備待檢細(xì)菌基因組并作為16SrRNA擴(kuò)增模板,用16SrRNA-27F和16SrRNA-1492R引物擴(kuò)增待檢細(xì)菌16SrRNA27~1492核苷酸片段。PCR反應(yīng)體系為:總體積20μl,含1×PCRBuffer、1mmol/LMg2+、1mmol/LdNTPs、1μmol/L引物、50ng模板DNA及0.5UTaqDNA聚合酶。反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性;94℃30s、55℃30s、72℃90s,30個循環(huán);72℃延長7min。產(chǎn)物經(jīng)1%凝膠電泳鑒定(4)PCR產(chǎn)物經(jīng)純化、TA克隆后,送鉑尚生物技術(shù)(上海)有限公司進(jìn)行核苷酸序列分析第13教學(xué)周(1)觀察并記錄生化反應(yīng)結(jié)果,并依據(jù)試劑盒判定方法和判斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行鑒定(2)生化鑒定結(jié)果與測序鑒定結(jié)果比對分析(3)觀察并記錄藥敏試驗結(jié)果

1.2.3教學(xué)實驗安排及方法綜合性實驗“人體腸道桿菌的分離與鑒定”安排在細(xì)菌學(xué)教學(xué)活動的后半部，分5次在5周內(nèi)完成。此時，學(xué)生已具備基本的感染性疾病微生物學(xué)檢查方法的理論知識，并已接受醫(yī)學(xué)微生物學(xué)的基本操作訓(xùn)練。整個實驗完全在學(xué)生正常實驗課時間進(jìn)行，不占據(jù)學(xué)生的課外時間。具體安排見表2。

2結(jié)果

2.1學(xué)生實驗結(jié)果

學(xué)生實驗結(jié)果與預(yù)期相同：正常人體腸道桿菌發(fā)酵或不發(fā)酵乳糖，在麥康凱培養(yǎng)基上呈現(xiàn)為無色或粉紅色菌落，為革蘭陰性桿菌(圖1)。API 10S革蘭陰性細(xì)菌生化反應(yīng)鑒定條、16S rRNA PCR產(chǎn)物電泳圖和藥敏試驗結(jié)果見圖2和表3。

A: Isolated colonies on MacConkey agar from human feces. B: Gram staining.

圖1人體腸道桿菌菌落特征(麥康凱)和革蘭染色

Fig.1Isolated colonies on MacConkey agar from human feces and Gram staining

A: API 10S strip identification. B: Amplification of 16S rRNA (27F, 1492R). C: Antimicrobial susceptibility testing.

圖2API 10S革蘭陰性細(xì)菌生化反應(yīng)鑒定條、16S rRNA擴(kuò)增和藥敏試驗結(jié)果

Fig.2API 10S strip identification, 16S rRNA PCR amplification and antimicrobial susceptibility testing results

2.2教學(xué)效果分析

2.2.1學(xué)生實驗操作分析整個實驗涵蓋了微生物學(xué)實驗的基本操作，學(xué)生在前幾次實驗課已接受了諸如革蘭染色、分區(qū)劃線接種、液體培養(yǎng)基接種等基本微生物學(xué)實驗技能和無菌操作技能的培訓(xùn)，能比較獨立、準(zhǔn)確地完成整個系統(tǒng)實驗。但是，由于學(xué)生在前期沒有接受系統(tǒng)的分子生物學(xué)實驗培訓(xùn)，包括核酸提取、PCR、DNA電泳、核酸產(chǎn)物純化和TA克隆等，個別學(xué)生最終沒能得到16S rRNA的測序結(jié)果。這也提示,在今后的實驗教學(xué)中需加強(qiáng)學(xué)生微生物分子生物學(xué)理論和實際操作的訓(xùn)練。實驗操作分析結(jié)果見表4。

2.2.2綜合性教學(xué)實驗 “人體腸道桿菌的分離與鑒定”問卷調(diào)查為進(jìn)一步考察本次綜合性教學(xué)實驗效果，本研究在實驗課結(jié)束后針對教學(xué)對象——復(fù)旦大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)六年制2個年級(2011級和2012級)共36名同學(xué)進(jìn)行問卷調(diào)查和統(tǒng)計分析，結(jié)果見表5。

表3API 10S與16S rRNA鑒定及藥敏試驗結(jié)果

Tab.3Identification and antimicrobial susceptibility testing results

No.API10Sidentification16SrRNAidentificationAntimicrobialsusceptibilitytestingSXTKANSTRGEN1Escherichiacoli1EscherichiacoliSSSI2Escherichiacoli1EscherichiacoliSSIS3SerratiaodoriferaorEscherichiacoli1EscherichiacoliRIIR4Escherichiacoli1EscherichiacoliISSS5Escherichiacoli1EscherichiacoliRSIR6Escherichiacoli1CronobactersakazakiiSSSI7SerratiaodoriferaorEscherichiacoli1EscherichiacoliIIIR8EscherichiacoliorShigellaspp.EscherichiacoliRIIR9EscherichiacoliorShigellaspp.EscherichiacoliRSSI10Escherichiacoli2orPantoeaspp.2EscherichiacoliSISR11Klebsiellapneumoniaessp.pneumoniaeKlebsiellapneumoniaeRIIR12Escherichiacoli1orCronobactersakazakiiCronobactersakazakiiRIIR

SXT, sulfamethoxazole; KAN, kanamycin; STR, streptomycin; GEN, gentamycin; S, sensitive; R, resistant; I, intermediate.

表4“人體腸道桿菌的分離與鑒定”綜合性實驗學(xué)生操作分析

Tab.4Assessment of students’ operation on comprehensive experiment “Isolation and identification of the enterobacterial strains from human feces”

No.ExperimentalprocedurePurposeProbabilityofsuccess(%)Causeoffailure1PlatestreakingGettingasinglecolony100Non2GramstainingGramnegativebacilli89.9Unsuccessfuldiscoloration3LiquidcultureinoculationCellenrichment100Non4Setting,readingandinterpretingAPI10SstripBacterialidentification50API10Sstripenablestheidentificationof400speciesofenterobacteriaceae,andsomespeciesarenotincludedinthedatabase5BacterialgenomepreparationPCRtemplate preparation77.8Noproductsduetounskilled,improperorcarelessoperationofgenomicDNAextraction 616SrRNAamplificationBacterialidentification100Non7PCRfragmentpurificationBacterialidentification80.6NoproductsduetoimproperoperationofDNAfragmentpurificationTAcloningBacterialidentification100Non816SrRNAsequenceanalysisBacterialidentification100Non9Antimicrobialsusceptibility testingMeasurementof inhibitionzone100Non

表5綜合性教學(xué)實驗改革“人體腸道桿菌的分離與鑒定”問卷調(diào)查

Tab.5Survey and analysis of the comprehensive experiment teaching reform

No.Item Option1(%)Option2(%)Option3(%)1ResourceoffecessampleFromstudents(100)Fromothers(0) —2Basicexperimentalskillstrainingformicrobiology Enhanced(94.4)Notbad(15.6)Nohelp(0)3Basicexperimentalskillstrainingformolecularbiology Enhanced(94.4)Notbad(15.6)Nohelp(0)4ApplicationsinfutureworkVeryapplicable(88.9)Applicable(11.1)Inapplicable(0)5Stimulatingstudents’interestinMedicalMicrobiologystudiesYes(91.7)Alittle(8.3)No(0)

3討論

在實驗設(shè)計上，選擇學(xué)生自己的糞便標(biāo)本作為分離鑒定的目標(biāo)具有以下優(yōu)點[4,5]：①作為人體腸道正常菌群的重要組成部分，糞便中含有相當(dāng)數(shù)量和種類的腸道桿菌，采用麥康凱平板進(jìn)行分離培養(yǎng)成功率很高，適用于教學(xué)實驗。實驗操作分析也證實，12份標(biāo)本全部分離獲得細(xì)菌。②糞便標(biāo)本取材方便，無痛苦，易于保存。③對取自于自己的標(biāo)本進(jìn)行分離鑒定，強(qiáng)烈激發(fā)了學(xué)生的好奇心和學(xué)習(xí)興趣。

在實驗操作上，整個實驗過程包括平板劃線、肉湯接種、分光光度法測定菌液密度、細(xì)菌基因組提取、PCR擴(kuò)增及擴(kuò)增產(chǎn)物分離與純化、DNA片段測序前TA克隆、16S rRNA核苷酸序列分析、藥敏試驗等技術(shù)的綜合運用，強(qiáng)化了學(xué)生對醫(yī)學(xué)微生物學(xué)和分子生物學(xué)基本操作技術(shù)的訓(xùn)練，幫助其系統(tǒng)回顧細(xì)菌分離和鑒定的全過程，為今后獨立從事相應(yīng)的醫(yī)藥衛(wèi)生工作和科學(xué)研究工作奠定了扎實的基礎(chǔ)。

在實驗材料上，繼續(xù)引入臨床常用的API 10S 革蘭陰性細(xì)菌生化反應(yīng)鑒定條。API微生物生化鑒定系統(tǒng)以微生物生化理論為基礎(chǔ)，是目前全球微生物鑒定的“金標(biāo)準(zhǔn)”。它借助于微生物對各種生理條件、生化指標(biāo)及代謝反應(yīng)進(jìn)行分析，將結(jié)果轉(zhuǎn)化為軟件可識別的數(shù)據(jù)來進(jìn)行聚類分析，并與已知的菌種數(shù)據(jù)庫比對，最終對未知細(xì)菌進(jìn)行鑒定。目前已有約600種細(xì)菌可被鑒定。與傳統(tǒng)方法相比，API鑒定系統(tǒng)結(jié)果判斷客觀，準(zhǔn)確可靠，且操作簡單方便，是臨床廣泛采用的細(xì)菌鑒定標(biāo)準(zhǔn)。API 10S 革蘭陰性細(xì)菌生化反應(yīng)鑒定條的引入切實做到了理論與實踐、基礎(chǔ)與臨床的有機(jī)結(jié)合。

在實驗方法上，引入目前已在微生物鑒定方面得到廣泛應(yīng)用的16S rRNA基因序列分析技術(shù)。傳統(tǒng)的細(xì)菌鑒定主要是通過表型特征來鑒定，通過分離培養(yǎng)、染色鏡檢、菌落形態(tài)觀察、生化反應(yīng)特征、抗原分型等一系列實驗后綜合分析得到結(jié)果，雖然廣泛應(yīng)用于病原菌檢測，但存在費時費力、靈敏度低等缺點。16S rRNA序列存在于所有細(xì)菌的基因組中，全長約1.5 kb，大小適中，既有高度保守的序列也有高度特異性序列，充分體現(xiàn)了不同菌屬、菌種之間的差異，成為病原菌檢測和鑒定的一種強(qiáng)有力工具。隨著PCR和核酸研究技術(shù)的不斷發(fā)展，數(shù)據(jù)庫的不斷完善，其在快速、微量、準(zhǔn)確分類鑒定和檢測病原菌方面將發(fā)揮越來越大的作用。在本實驗中，利用16S rRNA基因保守區(qū)的通用引物27F和1492R[6-8]，PCR擴(kuò)增獲得細(xì)菌樣本中1.45 kb的16S rRNA基因片段，測序后將核苷酸序列與GenBank數(shù)據(jù)庫比對分析，達(dá)到快速鑒定細(xì)菌的目的。16S rRNA序列分析方法敏感、快速、可靠性高、重現(xiàn)性強(qiáng)，能彌補(bǔ)傳統(tǒng)方法的不足[9,10]。通過“人體腸道桿菌的分離與鑒定”的系統(tǒng)過程，從傳統(tǒng)的分離純化和生化鑒定到現(xiàn)代分子生物學(xué)的16S rRNA PCR擴(kuò)增和核酸序列測定，讓學(xué)生既學(xué)習(xí)和理解了傳統(tǒng)細(xì)菌學(xué)分類鑒定方法，又對現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)在細(xì)菌分類鑒定中的應(yīng)用有了深刻認(rèn)識，達(dá)到舉一反三、觸類旁通的目的。

本實驗特點是將單個小型實驗組合成為系統(tǒng)性綜合性實驗，將單一的示教性實驗轉(zhuǎn)變?yōu)樘骄啃院蛯嵱眯詫嶒灒瑢崿F(xiàn)了從側(cè)重獲取知識的教育向增強(qiáng)創(chuàng)造性教育的轉(zhuǎn)變。實驗更新了傳統(tǒng)的知識體系，真正做到了理論聯(lián)系實際、基礎(chǔ)結(jié)合臨床。同時，該實驗也增加了學(xué)生的動手機(jī)會，激發(fā)了其學(xué)習(xí)熱情，培養(yǎng)了其獨立分析問題和解決問題的能力，為培養(yǎng)高素質(zhì)的應(yīng)用型醫(yī)學(xué)人才打下了基礎(chǔ)。

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為了促進(jìn)及幫助本刊讀者提高專業(yè)英語寫作水平，上期刊出1句中文科技詞句，本期刊出其對應(yīng)的英文詞句，供讀者對比學(xué)習(xí)。

Invivostudies have shown that this mAb is very effective in protecting MERS-CoV-susceptible animals from viral challenge, suggesting that the m336 mAb is a very promising drug candidate for the urgent treatment of MERS-CoV-infected patients.

評議：Drug candidate: 未成藥前只能用candidate;

MERS-CoV-infected: 此處用了MERS-CoV-infected作為一個詞，比用MERS-CoV infected更確切。

Corresponding author. CAO Zhong-Sheng, E-mail: cao4018@163.com

·病例分析·

Synergistic integration of comprehensive bacterial experiments in Medical Microbiology teaching

ZHANG Jun-Qi, XIE You-Hua, WANG Wei, LIU Jing, YUAN Zheng-Hong, QU Di

Department of Medical Microbiology and Parasitology, School of Basic Medical Sciences, Fudan University, Shanghai 200032, China

Abstract:Through comprehensive experiment “Isolation and identification of the enterobacterial strains from human feces”，medical students received systematic training of Medical Microbiology lab techniques including traditional methods for bacterial identification and modern 16S rRNA gene identification. These training inspired students for innovation and exploration. The reform lays a solid foundation for the cultivation of application-oriented medical talents.

Key words:Medical Microbiology；Comprehensive experiment；Education reform

通信作者：曹忠勝

收稿日期：(2015-05-08)