張金鳳，郭大文

哈爾濱醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，哈爾濱 150001

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白假絲酵母基因分型研究進(jìn)展

張金鳳，郭大文

哈爾濱醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，哈爾濱 150001

摘要：白假絲酵母(又稱白念珠菌)感染位居真菌感染的首位，由于廣譜抗生素和皮質(zhì)激素廣泛應(yīng)用、創(chuàng)傷性器械檢查使用增加、免疫力低下患者增多，其發(fā)病率日趨增加，且病死率高、預(yù)后差，因此早期準(zhǔn)確篩查白念珠菌對疾病的發(fā)生與發(fā)展至關(guān)重要。分子分型是分析機(jī)會(huì)性致病真菌種群結(jié)構(gòu)和流行性的重要方法，能有效鑒定社區(qū)或醫(yī)院內(nèi)感染、追蹤傳染源、分析暴發(fā)流行、研究種群動(dòng)力學(xué)、區(qū)分多重感染和評估微進(jìn)化。本文主要針對兩類白念珠菌基因分型方法(基于電泳技術(shù)的分型方法和基于測序技術(shù)的分型方法)進(jìn)行綜述，并著重闡述目前用于白念珠菌基因分型的最佳方法——多位點(diǎn)序列分型(MLST)的研究進(jìn)展。

關(guān)鍵詞：白假絲酵母；基因分型；多位點(diǎn)序列分型

真菌感染病死率高、預(yù)后差，是困擾臨床的重大問題。近年來，由于廣譜抗生素和皮質(zhì)激素廣泛應(yīng)用，植入性導(dǎo)管所致感染增加，器官移植、重癥監(jiān)護(hù)室(intensive care unit，ICU)、人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)感染、糖尿病和血液系統(tǒng)腫瘤患者增多，真菌感染日趨嚴(yán)重[1]。1995~2002年，美國一統(tǒng)計(jì)表明，假絲酵母(又稱念珠菌)感染占所有血流感染的9.0%，位居感染第4位，僅次于第1位的凝固酶陰性葡萄球菌感染、第2位的金黃色葡萄球菌感染和第3位的腸球菌感染。我國侵襲性真菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)2014年數(shù)據(jù)顯示，白念珠菌占全部分離真菌菌株的41.4%，位居第1，因此必須對白念珠菌感染加以重視。

白念珠菌是一種機(jī)會(huì)性致病真菌，通常存在于人的皮膚、口腔、上呼吸道、腸道和陰道黏膜，當(dāng)機(jī)體菌群失調(diào)或抵抗力降低時(shí)，可引起各種念珠菌病，甚至血流感染。因此，早期準(zhǔn)確篩查白念珠菌對疾病的發(fā)生與發(fā)展至關(guān)重要。分子分型是分析機(jī)會(huì)性致病真菌種群結(jié)構(gòu)和流行性的重要方法，能有效鑒定社區(qū)或醫(yī)院內(nèi)感染、追蹤傳染源、分析暴發(fā)流行、研究種群動(dòng)力學(xué)、區(qū)分多重感染和評估微進(jìn)化。白念珠菌基因分型的方法主要有：脈沖場凝膠電泳(pulsed field gel electrophoresis，PFGE)、限制性片段長度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)分析、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA (random amplified polymorphic DNA，RAPD)分析、擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(amplified fragment length polymorphism，AFLP)分析、重復(fù)序列聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain yeaction, PCR)、DNA指紋分析、基因芯片(DNA芯片)、轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribed spacer，ITS)核酸序列測定、微衛(wèi)星多態(tài)性分析、單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)分析、單鏈構(gòu)象多態(tài)性(single strand conformation polymorphism，SSCP)分析與異源雙鏈(heteroduple)分析、多位點(diǎn)序列分型(multilocus sequence typing，MLST)等。本文就白念珠菌基因分型方法的研究進(jìn)展作一綜述。

1基于電泳技術(shù)的分型方法

1970年，瓊脂糖凝膠電泳問世，利用單純電泳可簡單地將基因分開，但僅限于50 kb以下的片段。而大于10 kb的DNA片段移動(dòng)速度相近，電泳后條帶相近或混雜，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能達(dá)到精確分型的要求。以后陸續(xù)發(fā)展了多種基于電泳技術(shù)的白念珠菌基因分型方法，如PFGE、RFLP、RAPD、AFLP，包括DNA指紋技術(shù)。1984年，PFGE問世[2]，它采用交替脈沖和垂直定向電場的新型凝膠電泳分離技術(shù)，解決了傳統(tǒng)凝膠電泳對分子量的依賴，DNA分子的分辨力最高可達(dá)2 000 kb，且重復(fù)性好，結(jié)果易于記錄和解釋，很快得到廣泛應(yīng)用，尤其是在20世紀(jì)90年代至21世紀(jì)初。但PFGE需特殊設(shè)備，對技術(shù)要求高，易受緩沖液的種類、濃度、溫度及電泳時(shí)脈沖角度、時(shí)間、電壓梯度的影響，且所需時(shí)間近72 h[3]，最重要的是難以區(qū)分分子量相近的DNA[4]，即使區(qū)分出大小相似條帶，也不一定表示相同序列，因此限制了其應(yīng)用。1987年，在PFGE基礎(chǔ)上發(fā)展了電泳核型分析技術(shù)[5]，但由于分辨率差，現(xiàn)已少用[6,7]。由于PFGE及相關(guān)技術(shù)的缺陷，人們一直在探索更特異的基因分型方法。1987年，RFLP作為最早的DNA標(biāo)記技術(shù)，第1次成功用于念珠菌分型[7]，彌補(bǔ)了早期分型方法特異性差的缺陷，在20世紀(jì)80年代中期至90年代中期被廣泛應(yīng)用。后經(jīng)過改進(jìn)發(fā)展為PCR-RFLP，這是一種較成熟的技術(shù)[5]。PCR-RFLP將目的基因經(jīng)PCR特異擴(kuò)增后，用限制性內(nèi)切酶酶切DNA片段，然后電泳分離，經(jīng)濾膜將DNA轉(zhuǎn)移后用放射性標(biāo)記探針進(jìn)行Southern雜交、放射顯影，通過酶切位點(diǎn)的差異來反映型別及突變。此方法分型能力好，操作簡便，但要求樣品純度高，所需DNA量大，對限制性內(nèi)切酶的數(shù)量和種類依賴性強(qiáng)。1990年，從PCR衍生的RAPD誕生[8]。其采用10 bp左右的單鏈寡核苷酸作為隨機(jī)引物擴(kuò)增全基因組DNA，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳、染色以反映基因組在引物結(jié)合位點(diǎn)與擴(kuò)增位點(diǎn)間的多態(tài)性。RAPD操作簡單、省時(shí)，可用于種內(nèi)和種間鑒定，還可用于檢測序列未知的菌種，已廣泛用于醫(yī)院內(nèi)感染白念珠菌的分型、系譜分析及進(jìn)化關(guān)系研究[9]。但在用于種以上類群間比較時(shí)，無法得到可靠的遺傳距離，且無法區(qū)分?jǐn)U增片段是純合或雜合。此外，RAPD擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)退火溫度低，易出現(xiàn)假帶[4]，且易受外界因素影響，需多次試驗(yàn)以優(yōu)化反應(yīng)體系，從而限制了使用。1995年，AFLP作為一種新的分型方法出現(xiàn)，其結(jié)合了RFLP與PCR的分型特點(diǎn)，具有RFLP的可靠性和PCR的高效性。但實(shí)際上AFLP很少應(yīng)用于白念珠菌分型，超高的花費(fèi)、復(fù)雜的步驟、高水平的技術(shù)需要及對DNA質(zhì)量的嚴(yán)格要求限制了其應(yīng)用[2]。由于電泳技術(shù)本身存在一些缺陷，如瓊脂糖濃度、緩沖液組成及電壓變化對結(jié)果的影響，電泳反應(yīng)時(shí)間長，分子量相近的DNA難以區(qū)分，電泳條帶的位置和強(qiáng)度受主觀因素的影響等，使電泳相關(guān)基因分型技術(shù)發(fā)展受限。

2基于測序技術(shù)的分型方法

隨著測序技術(shù)的發(fā)展和成本的降低，涌現(xiàn)出一系列以測序?yàn)榛A(chǔ)的分型方法，如SNP分析、微衛(wèi)星多態(tài)性分析、MLST等，從本質(zhì)上彌補(bǔ)了傳統(tǒng)電泳技術(shù)的缺陷。真核生物基因組中，每隔10~50 kb就存在一個(gè)由幾個(gè)核苷酸組成的1~10 bp串聯(lián)的簡單重復(fù)序列，其重復(fù)次數(shù)決定了多態(tài)性，且在不同型別間差異很大，此重復(fù)序列被稱為微衛(wèi)星。微衛(wèi)星多態(tài)性技術(shù)就是通過檢測基因組中的微衛(wèi)星以分析基因多態(tài)性，從而進(jìn)行分型。該方法操作簡單，且特異性強(qiáng)，重復(fù)性高，因此很快被接受[10]。Diab-Elschahawi 等應(yīng)用微衛(wèi)星多態(tài)性技術(shù)對心胸外科ICU的近平滑念珠菌成功分型，分析了其在醫(yī)院內(nèi)的流行性[11]。但微衛(wèi)星串聯(lián)復(fù)制時(shí)由于重復(fù)序列太多，復(fù)制時(shí)不易找準(zhǔn)位置而造成重復(fù)復(fù)制或跳躍少復(fù)制一段序列，極易出錯(cuò)，這種不穩(wěn)定性限制了其在臨床上的應(yīng)用[12]。人們開始探索更加穩(wěn)定的方法，終于在1998年由Maiden等開發(fā)了MLST，這是一種分析核苷酸序列多態(tài)性的高效方法，起初用于自然變異的腦膜炎奈瑟菌的研究，后廣泛用于多種致病微生物的分型檢測[13]，真正用于白念珠菌的檢測始于2002年[14]。Rainey于2005年在新西蘭奧克蘭大學(xué)建立了第1個(gè)用于全球MLST數(shù)據(jù)分析和儲(chǔ)存的中央網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫。在真菌分型中，MLST起初用于白念珠菌和光滑念珠菌的分型，現(xiàn)在熱帶念珠菌數(shù)據(jù)庫也已開通。因?yàn)镸LST檢測要求菌株的管家基因有一定的多態(tài)性，而近平滑念珠菌缺乏等位基因多態(tài)性，故其不能用MLST進(jìn)行分型。MLST數(shù)據(jù)庫從開始信息不全且主數(shù)據(jù)庫運(yùn)行很慢逐漸發(fā)展為現(xiàn)在包括兩個(gè)子數(shù)據(jù)庫的高效數(shù)據(jù)庫：菌株數(shù)據(jù)庫(包含菌株信息)和概要文件數(shù)據(jù)庫(包含等位基因信息)，既提升了數(shù)據(jù)庫查詢時(shí)網(wǎng)絡(luò)的運(yùn)行速度，又便于分類查找，已成為目前白念珠菌基因分型的最佳方法。

MLST建立在多位點(diǎn)酶電泳(multilocus enzyme electrophoresis，MLEE)的基礎(chǔ)上。MLEE屬于表型分型技術(shù)，通過檢測生物個(gè)體間多種代謝相關(guān)的酶電泳遷移率不同來反映同種菌株間的差異；而MLST屬于基因型分型技術(shù)，通過檢測指導(dǎo)這些代謝相關(guān)酶合成的管家基因核苷酸序列的多樣性反映菌株間的差異，彌補(bǔ)了MLEE直接通過分析表達(dá)產(chǎn)物而推斷基因多態(tài)性的缺陷[15]。MLST操作簡單，白念珠菌基因分型時(shí)，僅需對7個(gè)管家基因(AAT1a、ACC1、VPS13、MPIb、ADP1、SYA1和ZWF1b[16])進(jìn)行擴(kuò)增測序，然后將測序結(jié)果輸入MLST數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對分析，即得到分型結(jié)果——菌株的ST型。通過比較菌株的ST型，可發(fā)現(xiàn)不同菌株之間的相關(guān)性：密切相關(guān)的菌株有相同ST或僅極個(gè)別等位基因座ST不同，不相關(guān)的菌株至少有3個(gè)基因位點(diǎn)不同。盡管MLST得到廣泛應(yīng)用，但仍存在不足。因?yàn)橐昧藴y序技術(shù)，MLST最大的缺陷就是成本高，無法迅速普及。其次，MLST對管家基因的變異程度有要求，不能檢測無變異的管家基因或變異程度小的管家基因，如近平滑念珠菌。此外，MLST分析時(shí)需經(jīng)歷基因組DNA提取、PCR擴(kuò)增、電泳檢測、測序、MLST等步驟，相對耗時(shí)，暫不適合臨床大規(guī)模使用。

MLST最大的優(yōu)勢在于其可通過數(shù)據(jù)庫在實(shí)驗(yàn)室間共享信息，從而進(jìn)行全球范圍的流行病學(xué)調(diào)查，故一經(jīng)推出便轟動(dòng)世界，很快用于流行病學(xué)監(jiān)測和病原生物學(xué)基礎(chǔ)研究。燒傷ICU患者易發(fā)生深部真菌感染，尤其是白念珠菌感染。為研究病房白念珠菌傳播與醫(yī)院內(nèi)感染的關(guān)系， Afsarian等采用MLST對來自伊朗醫(yī)院燒傷ICU的22例患者30株白念珠菌進(jìn)行分型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)來自幾例燒傷患者的分離株在遺傳學(xué)上有相關(guān)性，一些有相同DST型的菌株可能是菌株復(fù)合體，可能是患者間交叉污染引起的定植或感染[17]。MLST還可用于耐藥機(jī)制、微進(jìn)化和再感染的研究。鑒定機(jī)會(huì)性真菌病原體和白念珠菌亞種對識(shí)別感染暴發(fā)至關(guān)重要，特別是對毒力株和耐藥株的檢測。真菌生物膜形成與耐藥株密切相關(guān)。Bitar等為研究生物膜的形成能力、耐藥模式及相關(guān)MLST分型，對85株臨床分離的白念珠菌進(jìn)行MLST檢測，發(fā)現(xiàn)生物膜形成與耐藥株有系統(tǒng)相關(guān)性，且生物膜形成與多藥耐藥和再感染密切相關(guān)；MLST分型和進(jìn)化樹分析提示，菌株存在微進(jìn)化，且可能與生物膜形成相關(guān)[18]。針對新生兒白念珠菌感染和垂直傳播菌株的分型，MLST也是一個(gè)有用的方法。Song等和Hoarau等對新生兒念珠菌感染進(jìn)行了研究，結(jié)果表明白念珠菌在嬰兒間的水平傳播可能比新生兒的母嬰垂直傳播出現(xiàn)更頻繁[19]；對于來源于母親垂直傳播的念珠菌，三胞胎感染的白念珠菌在基因型上也略有不同[20]。來自多基因座的序列數(shù)據(jù)不僅可分析克隆型和重組菌株在種內(nèi)的流行性，還可提供菌株種水平差異的證據(jù)。Da Matta等就巴西4所三級(jí)保健醫(yī)院收集的6例患者標(biāo)本進(jìn)行MLST分析，發(fā)現(xiàn)只有一株為clade2，而clade2在全世界常見[21]。近年來，國內(nèi)MLST應(yīng)用也日趨成熟。郭雅莉等對來源于皮膚科的33株白念珠菌進(jìn)行MLST分析，發(fā)現(xiàn)了新的基因型，豐富了中國地區(qū)白念珠菌數(shù)據(jù)庫。吳克飛等就復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院收集的白念珠菌用MLST進(jìn)行分子流行病學(xué)研究，成功證實(shí)了白念珠菌的微進(jìn)化是由于雜合性缺失，表明MLST是用于研究流行性和微進(jìn)化的有效方法[22]。

作為白念珠菌基因分型的最佳方法，MLST優(yōu)點(diǎn)很多，它結(jié)合了高通量測序與群體遺傳學(xué)的生物信息技術(shù)，是一種方便、可重復(fù)、有規(guī)模、反映致病菌種群和生物進(jìn)化學(xué)的分型系統(tǒng)。因?yàn)閿?shù)據(jù)可在網(wǎng)上存儲(chǔ)并實(shí)時(shí)更新，MLST擁有很高的鑒別力和可操作性，最大的優(yōu)勢在于其可輕松比對實(shí)驗(yàn)室之間的序列數(shù)據(jù)，無需交換菌種，通過訪問存放在數(shù)據(jù)庫中的菌株信息和概要文件，不同國家實(shí)驗(yàn)室間可共享信息，從而進(jìn)行全球范圍的流行病學(xué)調(diào)查。在材料準(zhǔn)備上，簡單易得，方便運(yùn)輸，無感染和腐蝕性，不需培養(yǎng)病原菌，僅須破壞細(xì)胞和進(jìn)行DNA準(zhǔn)備。此外，因引物序列易分離，不需特異性不高又費(fèi)時(shí)的電泳技術(shù)，MLST正日趨自動(dòng)化[23]。該方法很可能從檢測單一菌株發(fā)展到檢測成百上千的菌株[24]，通過開發(fā)機(jī)器人DNA提取和高通量核苷酸序列檢測技術(shù)，將大幅降低檢測成本[25]。設(shè)計(jì)一個(gè)臨時(shí)的MLST檢測很簡單，但大批量常規(guī)用于臨床實(shí)驗(yàn)室將會(huì)面臨巨大的挑戰(zhàn)，其廣泛的應(yīng)用前景值得進(jìn)一步探索。

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Progress on genotyping ofCandidaalbicans

ZHANG Jin-Feng，GUO Da-Wen

First Affiliated Hospital of Harbin Medical University，Harbin 150001，China

Abstract:Candida albicans (C. albicans) infection is the most frequently encountered fungal infection with high mortality and poor prognosis. Due to the wide application of broad-spectrum antibiotics and corticosteroids, the use of invasive examination instruments, and the increase of immunocompromised patients, the incidence of the infection is increasing. Thus, early detection and accurate typing are crucial for the control of the situation in both community and clinical settings. Two classes of C. albicans genotyping methods are reviewed in the paper—the electrophoresis-based method and the sequencing-based method. Multilocus sequence typing (MLST) is emphatically expounded as the current best method for C. albicans genotyping.

Key words:Candida albicans；Genotyping；Multilocus sequence typing

收稿日期：(2015-09-11)