關(guān)清華　曠勁松　程嵐　辛彩虹

[摘要] 目的 通過(guò)測(cè)定糖尿病視網(wǎng)膜病變（DR）患者血清晚期蛋白氧化產(chǎn)物（AOPP）、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（VEGF）及色素上皮衍生因子（PEDF）的水平，探討其在DR中的可能作用。 方法 選擇2型糖尿?。═2DM）患者90例，分為T(mén)2DM無(wú)DR（NDR）組30例，背景期DR（BDR）組30例，增殖期DR（PDR）組30例。同時(shí)選擇健康對(duì)照組30例。用Wikto-sarsat介紹的方法改進(jìn)后測(cè)定各組血清AOPP水平，酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法測(cè)定血清VEGF及PEDF水平。 結(jié)果 隨著DR的進(jìn)展，各組血清中AOPP水平逐漸升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與正常對(duì)照組比較，2型糖尿病各組VEGF水平均顯著升高（P<0.05）；BDR組及PDR組與NDR組比較，VEGF水平均明顯高于NDR組（P<0.05）；但PDR組VEGF含量較BDR組有所下降（P<0.05）。各組血清中PEDF水平逐漸下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。Pearson相關(guān)分析表明血清VEGF與PEDF水平呈負(fù)相關(guān)（r=-0.734，P<0.05）；而血清AOPP與VEGF水平呈正相關(guān)（r=0.816，P<0.05），與PEDF水平呈負(fù)相關(guān)（r=-0.905，P<0.05）。 結(jié)論 糖尿病患者血清AOPP和VEGF水平的升高，PEDF水平的下降可能促進(jìn)了DR的發(fā)生發(fā)展。

[關(guān)鍵詞] 糖尿病視網(wǎng)膜病變；晚期蛋白氧化產(chǎn)物；血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子；色素上皮衍生因子

[中圖分類(lèi)號(hào)] R587.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B [文章編號(hào)] 1673-9701（2015）35-0029-03

[Abstract] Objective By measuring the level of serum advanced oxidation protein products （AOPP）， vascular endothelial growth factor （VEGF） and pigment epithelium-derived factor （PEDF） in patients with diabetic retinopathy（DR）， and to explore its possible role in the pathogenesis of DR. Methods 90 type 2 diabetes mellitus （T2DM） patients were divided into three groups： 30 patients with non-DR （NDR）， 30 patients with back ground-DR （BDR）， 30 patients with proliferative-DR （PDR）. At the same time， 30 healthy controls were selected. The concentration of serum AOPP was measured by modified Wikto-Sarsat， while VEGF and PEDF by ELISA assay. Results The serum level of AOPP increased gradually along with the development of DR， and the difference was statistically significant （P<0.05）. Serum levels of VEGF in T2DM groups were significantly increased compared with the control group （P<0.05）， and VEGF in BDR and PDR groups were significantly higher than that in NDR group （P<0.05）， but the serum level of VEGF in PDR group was significantly lower than that in BDR group （P<0.05）. The serum level of PEDF in each group was gradually decreased， and the difference was statistically significant（P<0.05）. Pearson correlation analysis showed that the serum level of VEGF was negatively correlated with PEDF（r=-0.734， P<0.05）. The serum level of AOPP was positively correlated with VEGF （r=0.816， P<0.05）， and negatively correlated with PEDF（r=-0.905， P<0.05）. Conclusion The increase of AOPP and VEGF level in serum of patients with diabetes， and the decrease of PEDF may promote the development of DR.

[Key words] Diabetic retinopathy； Advanced oxidation protein products； Vascular endothelial growth factor； Pigment epithelium-derived factor

糖尿病視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy，DR）作為一種漸進(jìn)性疾病，是糖尿病最嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥之一，可導(dǎo)致不可逆性失明，是致盲的主要原因之一，然而關(guān)于DR的確切發(fā)病機(jī)制目前仍未完全明了?，F(xiàn)一致認(rèn)為氧化應(yīng)激狀態(tài)是糖尿病慢性并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展的共同土壤，長(zhǎng)期高血糖及其引起的眼部組織氧化應(yīng)激狀態(tài)使血管生成的促進(jìn)因子表達(dá)增加，并減少抑制因子的表達(dá)，使血管生成調(diào)節(jié)失衡，最終導(dǎo)致DR。本文測(cè)定了DR患者氧化應(yīng)激指標(biāo)血清晚期蛋白氧化產(chǎn)物（advanced oxidation protein products，AOPP）、炎癥因子血清血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）及色素上皮衍生因子（pigment epithelium-derived factor，PEDF）的水平，以探討其在DR中的可能作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

根據(jù)2010年WHO糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)選擇我院2014年7月～2015年7月內(nèi)分泌科住院2型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus，T2DM）患者共90例，其中60例按照全國(guó)眼底病協(xié)作組制定的DR診斷標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)眼底散瞳和眼底熒光素血管造影確診為DR患者為DR組。其中背景期DR組（back ground-DR，BDR）30例。男16例，女14例；年齡（53.16±5.8）歲；增殖期DR組（proliferative-DR，PDR）30例。男15例，女15例，平均年齡（57.2±7.9）歲。無(wú)DR組（non-DR，NDR）30例。男17例，女13例，平均年齡（55.72±7.2）歲。所用病例均排除心腦血管疾病、高血壓、肝腎功能不全、惡性腫瘤及急慢性感染等?；颊哌M(jìn)入研究前1個(gè)月內(nèi)未應(yīng)用抗氧化劑如硫辛酸、維生素C及維生素E等。隨機(jī)挑選我院體檢中心年齡相匹配的健康志愿者30名為正常對(duì)照（NC）組，經(jīng)口服葡萄糖耐量試驗(yàn)證實(shí)排除糖尿病。男15例，女15例，平均年齡（54.91±6.7）歲。雙眼散瞳檢測(cè)眼底正常。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集 全部受試者均于清晨空腹采靜脈血2 mL，室溫靜置1 h，離心10 min（2000 r/min），取血清避光保存于-70℃冰箱待測(cè)，所用標(biāo)本一次測(cè)定。

1.2.2 觀察指標(biāo) 所用患者均常規(guī)計(jì)算體重指數(shù)及檢測(cè)空腹血糖，應(yīng)用Witko-sarsat提出的分光光度計(jì)法[1]加以改進(jìn)檢測(cè)AOPP，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)VEGF及PEDF。

1.2.3 測(cè)定方法 按Witko-sarsat提出的分光光度計(jì)法[1]加以改進(jìn)，血清與PBS按1：5稀釋，以氯胺-T同法稀釋作空白對(duì)照，加入10 μL 1.1 6 mol/L KI及20 μL乙酸后立即測(cè)340 nm處的吸光度（A）值。AOPP濃度以氯胺-T含量表示。VEGF及PEDF的測(cè)定采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法，試劑盒分別由深圳晶美生物工程有限公司及美國(guó)TSZ公司提供。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS12.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析判斷組間差異，兩參數(shù)間相關(guān)性檢驗(yàn)應(yīng)用Pearson相關(guān)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組一般資料及血清AOPP、VEGF及PEDF水平比較

NC組、NDR組、BDR組及PDR組的年齡、性別、體重指數(shù)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。T2DM各組（包括NDR組、BDR組、PDR組）血糖均高于正常對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；而T2DM各組間比較，則差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。隨著DR的進(jìn)展，各組血清中AOPP水平逐漸升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與正常對(duì)照組比較，T2DM各組VEGF水平均顯著升高（P<0.05）；BDR組及PDR組與NDR組比較，VEGF水平均明顯高于NDR組（P<0.05）；但PDR組VEGF含量較BDR組有所下降（P<0.05）；各組血清中PEDF水平逐漸下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表1。

2.2 相關(guān)性分析

血清VEGF與PEDF水平呈負(fù)相關(guān)（r=-0.734，P<0.05）；而血清AOPP與VEGF水平呈正相關(guān)（r=0.816， P<0.05），與PEDF水平呈負(fù)相關(guān)（r=-0.905，P<0.05）。

3 討論

1型和2型糖尿病均可進(jìn)展為DR，幾乎每個(gè)1型糖尿病經(jīng)過(guò)15～20年的時(shí)間均進(jìn)展為DR，而T2DM超過(guò)60%進(jìn)展為DR。在發(fā)達(dá)國(guó)家DR是成人視力缺損的主要原因[2]?，F(xiàn)一致認(rèn)為，DR與自由基介導(dǎo)的氧化損傷有關(guān)[3]。機(jī)體中氧化自由基產(chǎn)物增加或抗氧化劑及抗氧化酶活力下降，導(dǎo)致自由基的生成與機(jī)體抗氧化能力間失衡，導(dǎo)致視網(wǎng)膜組織氧化應(yīng)激發(fā)生。大量研究表明增加的氧化應(yīng)激是糖尿病患者視網(wǎng)膜炎癥反應(yīng)的一個(gè)主要原因[4]，活性氧通過(guò)改變多種炎癥基因表達(dá)從而在介導(dǎo)炎癥反應(yīng)方面起到重要作用，最終引起視網(wǎng)膜損傷導(dǎo)致DR的發(fā)生。糖尿病時(shí)，高血糖誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激明顯增強(qiáng)[5]，自由基可作用于蛋白、脂肪及核酸等，形成各種損傷產(chǎn)物，從而影響正常的生理過(guò)程。AOPP反映了氧化應(yīng)激造成的蛋白質(zhì)損傷，尤其對(duì)白蛋白的損傷，是蛋白質(zhì)被單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞活化生成的次氯酸所修飾的產(chǎn)物，是反應(yīng)蛋白氧化程度的敏感指標(biāo)[6]。研究表明，T2DM患者的AOPP水平較健康對(duì)照組明顯升高，而在T2DM合并DR患者的血清中AOPP水平明顯高于無(wú)DR的患者[7]。本研究表明隨著DR的進(jìn)展，氧化應(yīng)激反應(yīng)逐漸增強(qiáng)，表現(xiàn)為AOPP水平逐漸升高，各組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，亦進(jìn)一步支持上述結(jié)果。

VEGF是目前已知的最強(qiáng)的內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂原和誘導(dǎo)血管生成的細(xì)胞因子[2，8]，也是目前認(rèn)為與DR新生血管形成聯(lián)系最密切的一個(gè)細(xì)胞因子，其特異性地直接作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，刺激血管生長(zhǎng)的因子，其他各種因素刺激血管生成的作用都是直接或間接通過(guò)誘導(dǎo)VEGF及其受體的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的，然而在糖尿病視網(wǎng)膜中這些新生血管脆性強(qiáng)，很容易破裂。Zhang等[9]表明VEGF在玻璃體液中的水平和糖尿病視網(wǎng)膜病變的嚴(yán)重程度密切相關(guān)。本研究結(jié)果表明，隨著DR的加重，血清VEGF水平呈現(xiàn)遞增趨勢(shì)。但PDR組血清VEGF水平較BDR組下降，分析其原因可能為：BDR期由于機(jī)體高血糖及代謝紊亂，導(dǎo)致組織缺氧，刺激VEGF分泌增多，而進(jìn)展到PDR期，大量新生血管形成使得缺氧的壓力減輕，同時(shí)有部分新生血管破裂，則VEGF產(chǎn)生也隨之減少，這表明血清中VEGF水平與糖尿病患者新生血管活動(dòng)性密切相關(guān)。當(dāng)新生血管活動(dòng)期結(jié)束，VEGF水平則下降。有研究表明抗VEGF治療可有效延緩DR的發(fā)展[10]，Porta等[11]研究表明對(duì)存在黃斑水腫的DR患者應(yīng)用抗VEGF治療可以有效治療DR。

PEDF是一種具有多種功能的蛋白質(zhì)，在視網(wǎng)膜及神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)最多，被稱為“天然血管抑制因子”，通過(guò)抑制NADPH氧化酶介導(dǎo)的氧化應(yīng)激而起到阻止神經(jīng)損傷及降低血管通透性等作用，還可以抑制新生血管生成，從而阻止DR發(fā)生發(fā)展[12、13]。本研究結(jié)果表明隨著DR的進(jìn)展，各組血清PEDF水平逐漸下降，各組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這表明血清PEDF水平的下降可能是DR病程進(jìn)展的一個(gè)重要原因。補(bǔ)充PEDF及各種促進(jìn)PEDF表達(dá)的方法均可能為延緩DR病變的發(fā)展提供有效治療[14，15]。

相關(guān)分析表明，血清VEGF與PEDF水平呈負(fù)相關(guān)（r=-0.734，P<0.05），這說(shuō)明VEGF可在一定程度下調(diào)PEDF表達(dá)，進(jìn)一步促進(jìn)DR的進(jìn)展；同時(shí)有研究表明PEDF通過(guò)拮抗VEGF的生物學(xué)作用而抑制視網(wǎng)膜血管通透性[13]，從而阻止DR的發(fā)生發(fā)展。而血清AOPP與VEGF水平呈正相關(guān)（r=0.816，P<0.05），與PEDF水平呈負(fù)相關(guān)（r=-0.905，P<0.05），這說(shuō)明氧化應(yīng)激損傷產(chǎn)物可能會(huì)通過(guò)上調(diào)VEGF及下調(diào)PEDF水平，從而破壞血清VEGF與PEDF之間的平衡，參與DR的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，氧化應(yīng)激狀態(tài)及增加的蛋白氧化損傷與炎癥反應(yīng)在DR形成過(guò)程中起到重要作用，即當(dāng)糖尿病患者血清AOPP和VEGF水平升高，PEDF水平下降時(shí)可能促進(jìn)了DR的發(fā)生發(fā)展。由于DR早期缺乏典型癥狀，晚期尚無(wú)特效藥物治療，通常在患者發(fā)現(xiàn)視覺(jué)異常時(shí)已失去了最佳治療時(shí)機(jī)，而通過(guò)聯(lián)合檢測(cè)血清AOPP、VEGF、PEDF水平有助于明確DR嚴(yán)重程度，為臨床有效防治DR提供依據(jù)，具有廣闊的應(yīng)用前景。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Witko-sarsat V，F(xiàn)riedlander M，Capeillere-Blandin C，et al.Advanced oxidation protein products as a novel marker of oxidative stress in uremia[J]. Kidney Int，1996，49：1304-1313.

[2] Amadio M，Bucolo C，Leqqio GM，et al. The PKCb/HuR/VEGF pathway in diabetic retinopathy[J]. Biochem Pharmacol，2010，80（8）：1230-1237.

[3] Coucha M，Elshaer SL，Eldahshan WS，et al. Molecular mechanisms of diabetic retinopathy：potential therapeutic targets[J]. Middle East Afr J Ophthalmol，2015，22（2）：135-144.

[4] Zhang W，Liu H，Al-Shabrawey M，et al. Inflammation and diabetic retinal microvascular complications[J]. J Cardiovasc Dis Res，2011，2：96-103.

[5] Nowotny K，Jung T，H？觟hn A，et al. Advanced glycation end products and oxidative stress in type 2 diabetes mellitus[J].Biomolecules，2015，5（1）：194-222.

[6] Descamps-Latscha B，Witko-sarsat V. Importance of Oxidatively modified proteins in chronic renal failure[J]. Kidney Int Suppl，2001，78：108-113.

[7] Pan HZ，Zhang H，Chang D，et al. The change of oxidative stress products in diabetes mellitus and diabetic retinopathy[J]. Br J Ophthalmol，2008，92（4）：548-551.

[8] Kumar B，Gupta SK，Srinivasan BP，et al. Hesperetin ameliorates hyperglycemia induced retinal vasculopathy via anti-angiogenic effects in experimental diabetic rats[J]. Vascul Pharmacol，2012，57（5-6）：201-207.

[9] Zhang C，Wang H，Nie J，et al. Protective factors in diabetic retinopathy： focus on blood-retinal barrier[J]. Discov Med，2014，18（98）：105-112.

[10] Das A，Stroud S，Mehta A，et al. New treatments for diabetic retinopathy[J]. Diabetes Obes Metab，2015，17（3）：219-230.

[11] Porta M，Maldari P，Mazzaglia F. New approaches to the treatment of diabetic retinopathy[J]. Diabetes Obes Metab， 2011，13（9）：784-790.

[12] Elahy M，Baindur-Hudson S，Cruzat VF，et al. Mechanisms of PEDF-mediated protection against reactive oxygen species damage in diabetic retinopathy and neuropathy[J]. J Endocrinol，2014，222（3）：129-139.

[13] Ueda S，Yamagishi SI，Okuda S. Anti-vasopermeability effects of PEDF in retinal-renal disorders[J]. Curr Mol Med，2010，10（3）：279-283.

[14] Ibrahim AS，Tawfik AM，Hussein KA，et al. Pigment epithelium-derived factor inhibits retinal microvascular dysfunction induced by 12/15-lipoxygenase-derived eicosanoids[J]. Biochim Biophys Acta，2015，1851（3）：290-298.

[15] Liu Y，Leo LF，McGregor C，et al. Pigment epithelium-derived factor（PEDF） peptide eye drops reduce inflammation，cell death and vascular leakage in diabetic retinopathy in Ins2（Akita） mice[J]. Mol Med，2012，18：1387-1401.

（收稿日期：2015-09-17）