胡珊蓮

(上海市閘北區(qū)江場西路上海光明荷斯坦牧業(yè)有限公司，上海閘北 200436)

?

獸醫(yī)防疫

口蹄疫液相阻斷ELISA抗體檢測方法的操作注意事項

胡珊蓮

(上海市閘北區(qū)江場西路上海光明荷斯坦牧業(yè)有限公司，上海閘北 200436)

液相阻斷ELISA用于檢測家畜血清中的口蹄疫(FMD)抗體，具有靈敏性高、特異性強、穩(wěn)定性好等特點。但因耗時較長，操作步驟繁多，操作中稍有不慎就會導(dǎo)致實驗結(jié)果發(fā)生偏差或試驗失敗，因此必須謹(jǐn)慎操作。

1樣品或試劑的保存和使用

全血樣品采集后應(yīng)盡快分離血清避免溶血，3500～4000 rpm離心5～10 min，血清0～4℃條件下可保存5 d，如采用-15～-20℃冷凍保存則更好。冷凍保存血清樣品需在4～8℃條件下解凍，再平衡至室溫，稀釋前需充分混勻。

口蹄疫O型病毒抗原-20℃保存，其余試劑盒組分置于2～8℃保存。檢測前，試劑盒內(nèi)的所有試劑、包被反應(yīng)板放置1～2 h平衡至室溫(20～25℃)，冬季可置于25～37℃左右的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)。為使實驗結(jié)果準(zhǔn)確，應(yīng)避免使用不同批次的試劑盒及試劑成分。

2試劑配制

配制試劑前后都要充分混勻，濃縮的PBST液，低溫下會有無機鹽結(jié)晶析出，使用前可水浴或恒溫培養(yǎng)箱融化，用無離子水或超純水25倍稀釋，用NaOH或稀HCl溶液調(diào)整至pH 7.4。

底物溶液按操作說明配制，現(xiàn)配現(xiàn)用。OPD有致癌性，配制時一定要注意不能接觸皮膚。配制時避光溶化，為無色透明液體，4℃避光保存，如有變色，則不能使用。用時按需要量倒出,臨用前每1 mL加10 μL本試劑盒配備的3%雙氧水，否則酶標(biāo)板將無法顯色，導(dǎo)致實驗失敗。

3稀釋

稀釋過程中, 要注意使用同一微量加樣器、槍頭和稀釋板,保證所稀釋液體容量一致。

稀釋過程中，操作人員應(yīng)注意每稀釋一個樣品調(diào)換一次槍頭，不能連續(xù)使用。

4加樣

加樣應(yīng)避免在冷氣、光照、熱源或通風(fēng)口等溫度不均勻位置進(jìn)行，注意不能將反應(yīng)板直接放在冰冷的實驗桌面上，可墊上墊布作為緩沖。

加樣不宜太快,不可濺出和產(chǎn)生氣泡，每次加樣都要保持同樣的加樣順序，板數(shù)多者要單獨計時，保證每板反應(yīng)時間充足。

5孵育

孵育前要封好膜，蓋嚴(yán)，避免水分蒸發(fā)。

孵育時不可重疊放置，避免受熱不均，且要避免人為縮短或延長孵育時間。

6洗滌

洗滌是ELISA操作中關(guān)鍵技術(shù)之一, 300 μL 3～5次洗板，每次浸泡時間一般為30 s。

洗板時需保證酶標(biāo)板平放，將洗滌液注滿各孔，避免漏液、溢液現(xiàn)象。

7拍板

每次拍板時都要更換吸水紙，同時避免手指接觸板底。拍板時應(yīng)注意觀察板孔內(nèi)有無氣泡附著，如有氣泡加樣前應(yīng)一一去除。

8顯色

顯色是ELISA 操作中的最后一個反應(yīng)步驟,這時酶催化無色底物, 生成有色產(chǎn)物。反應(yīng)溫度和時間是影響顯色的因素。加入底物后的反應(yīng)溫度應(yīng)嚴(yán)格按實驗操作說明書執(zhí)行。根據(jù)底物顯色情況，反應(yīng)時間可適當(dāng)調(diào)整為10～15 min。

9OD值讀數(shù)

加入終止液終止反應(yīng)后應(yīng)立即在492 nm波長下讀取吸光值，讀數(shù)前，保證酶標(biāo)板底板清潔無污染，如有水分應(yīng)仔細(xì)擦干，提前15 min打開酶標(biāo)儀，使之穩(wěn)定并用空氣調(diào)零。

為使實驗獲得正確結(jié)果，操作人員應(yīng)在實驗前仔細(xì)閱讀實驗說明書，試驗時要嚴(yán)格按試驗步驟操作, 對每個環(huán)節(jié)進(jìn)行優(yōu)化, 提高試驗結(jié)果的精確性,保證試驗結(jié)果的真實性和客觀性。

收稿日期：2015--

中圖分類號：S852.5

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：B

文章編號：1005-7307(2016)04-0031-001