劉茜桐，田　莉，師娟子

(西北婦女兒童醫(yī)院，陜西 西安 710000)

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【女性生殖醫(yī)學研究】

胚胎植入前遺傳學診斷和篩查的研究進展

劉茜桐，田莉，師娟子

(西北婦女兒童醫(yī)院，陜西 西安 710000)

胚胎植入前遺傳學診斷(PGD)和篩查(PGS)是近年來發(fā)展的植入前遺傳學檢測(PGT)方法。PGD主要適用于父母攜帶基因突變或染色體平衡易位，通過體外受精，在胚胎移植前檢測特定的突變以及非平衡染色體異常是否傳遞到卵子或胚胎。PGS是運用相同的檢測方法檢測胚胎染色體非整倍性，通過移植正常的胚胎從而提高妊娠率。PGD/PGS相關檢測技術發(fā)展日新月異，傳統(tǒng)FISH技術逐漸被取代，更多的新技術也在研發(fā)中。但是，PGD/PGS仍存在費用昂貴,無法檢測所有胚胎異常等不足之處。該文綜述PGD/PGS相關進展和PGD/PGS所存在的問題。

植入前；遺傳學篩查；遺傳學診斷；非整倍體

[Abstract]Preimplantationgeneticdiagnosis(PGD)andpreimplantationgeneticscreening(PGS)arerecentlydevelopedpreimplantationgenetictesting(PGT).PGDisappliedwhenoneorbothgeneticparentscarryagenemutationorabalancedchromosomalrearrangementandtestingisperformedtodeterminewhetherthatspecificmutationoranunbalancedchromosomalcomplementhasbeentransmittedtotheoocyteorembryo.PGSusesthesamemethodfordetectingembryochromosomalaneuploidyinordertoimprovepregnancyrate.WiththedevelopmentofnewtechnologyrelatedwithPGD/PGS,FISHisgraduallybeingreplacedandnewmethodsareunderresearch.However,PGD/PGSisexpensiveandcannotdetectallabnormalitiesoftheembryo.ThisarticlereviewedtheadvancementandshortcomingsofPGD/PGS.

[Keywords]preimplantation;preimplantationgeneticdiagnosis(PGD);preimplantationgeneticscreening(PGS);aneuploidy

胚胎植入前遺傳學診斷(preimplantationgeneticdiagnosis,PGD)是通過體外受精或胞質(zhì)內(nèi)單精子注射獲得胚胎，利用分子生物學技術對胚胎進行檢測，以獲得無遺傳疾病的胚胎進行移植，從而避免患兒出生以及反復人流或引產(chǎn)導致的生理和精神創(chuàng)傷[1]。胚胎植入前非整倍體篩查(preimplantationgeneticscreeningforaneuploidy,PGS)可在胚胎移植前對胚胎染色體結構和數(shù)量進行檢測和篩查，通過比對，分析胚胎是否有遺傳物質(zhì)異常。

1989年Handyside首次將PGD技術應用于臨床，如今，PGD已在全球范圍內(nèi)被廣泛應用。PGD將產(chǎn)前診斷提前到胚胎種植之前，避免了異常妊娠的發(fā)生。PGD主要適用于夫婦一方染色體異常，單基因病，性連鎖疾病，非整倍體篩查等。PGS在最初的指南中，被稱為“低風險PGD”。PGS適用于女方高齡，染色體正常的夫婦出現(xiàn)復發(fā)性流產(chǎn)、反復種植失敗、嚴重的男方不孕患者[2]。ESHRE3統(tǒng)計了10年的PGD數(shù)據(jù)，該數(shù)據(jù)納入62個中心共5 780個取卵周期，PGS占2 979個周期，單基因疾病占1 574個周期，染色體異常占1 071個周期，X性染色體連鎖疾病占108個周期，社會性別選擇占48個周期。

1適用范圍

1.1染色體異常

一般人群中染色體異常發(fā)生率為5/1 000。染色體異常包括染色體數(shù)目異常和結構異常?？耸习Y(47，XXY)和Turner綜合征(45，XO)都是染色體數(shù)目異常。染色體結構異常包括相互易位，羅氏易位，倒位。染色體易位是染色體結構異常中最常見的類型，平衡異位的發(fā)生率約為1/500，對于自然流產(chǎn)或者有不良孕產(chǎn)史的患者出現(xiàn)染色體平衡易位的概率升高，約為2%。IVF助孕中復發(fā)性流產(chǎn)和胚胎反復種植失敗的患者染色體異常發(fā)生率為5%。染色體相互易位在因染色體結構異常行PGD人群中占60%。相互易位患者中男女數(shù)量比例接近，羅氏易位患者中男性數(shù)量約為女性的2倍[3]。

PGD技術可以避免染色體異常的胚胎植入子宮導致妊娠失敗或者新生兒缺陷。3篇RCT研究報道在年輕，預后好的患者中，PGD-A(非整倍體篩查)比單純形態(tài)學篩選胚胎有更高的妊娠率[4]。

1.2單基因病

單基因病指單個基因突變引起的疾病，遵循孟德爾定律。包括以下幾種：①常染色體顯性遺傳，常見疾病有Huntington病、強直性肌營養(yǎng)不良等；②常染色體隱形遺傳，常見疾病有肝豆狀核變形、脊肌萎縮癥等；③X連鎖顯性遺傳，常見疾病有抗維生素D佝僂病、色素失禁癥等；④X連鎖隱形遺傳，常見疾病有假肥大型肌營養(yǎng)不良、血友病A、B等；⑤Y連鎖遺傳，常見疾病有外耳道多毛癥。目前已有超過150種單基因疾病通過PGD技術檢測。

1.3反復胚胎種植失敗

反復胚胎種植失敗(repeatedimplantationfailure,RIF)指連續(xù)經(jīng)歷3次以上移植優(yōu)質(zhì)胚胎仍未獲臨床妊娠[5]。反復胚胎種植失敗患者，其胚胎染色體異常比例較高。雖然輔助生殖技術不斷發(fā)展，但是IVF種植率仍然只有40%～60%?，F(xiàn)有的胚胎評級標準例如胚胎形態(tài)學評分對胚胎發(fā)育潛能預測價值有限。因此，我們需要更客觀的評價標準來選擇胚胎。PGD可以在胚胎植入前對其分析是否攜帶遺傳性疾病，是否為非整倍體胚胎。

1.4復發(fā)性流產(chǎn)

復發(fā)性流產(chǎn)(recurrentspontaneousabortion,RSA)是指連續(xù)發(fā)生2次或2次以上超聲或病理檢查證實的胎兒丟失[6]。細胞有絲分裂和減數(shù)分裂都可能產(chǎn)生非整倍體。輔助生殖技術中早期流產(chǎn)率為10%～20%[7]。自然流產(chǎn)組織中50%～70%有細胞遺傳學異常，最常見的核型是常染色體三體。隨著年齡增大，染色體異常在流產(chǎn)患者中占到的比例增大。高齡女性胚胎染色體發(fā)生異常的幾率增加。并且，非整倍體是導致種植失敗、流產(chǎn)、胎兒先天畸形的主要原因。異常染色體常出現(xiàn)在16,22號染色體。PGS與期待治療相比，花費高，活產(chǎn)率低，但是臨床流產(chǎn)率低[8]。

PGD還可應用于HLA配型、遲發(fā)型疾病，腫瘤傾向，遺傳性心臟病，早發(fā)型阿爾茲海默癥等。

對于已生育患兒的家庭，通過PGD可得到相同人類白細胞抗原(humanleukocyteantigen,HLA)類型的胎兒，并通過新生兒臍血造血干細胞移植治療第1個患兒。2000年，PGD的指征增加了HLA配型。 需要相匹配的造血干細胞的家庭，例如子女患疾病(白血病、再生障礙性貧血等)均可以行PGD-HLA(preimplantaiongeneticdiagnosis-humanleukocyteantigen,PGD-HLA)。

建議的PGD-HLA臨床指南[9]：①沒有相匹配的HLA捐贈者；②造血干細胞移植(haematopoieticstemcelltransplantation,HSCT)需求不緊急，可等待至少9～12個月(invitrofertilization-preimplantaiongeneticdiagnosis,IVF-PGD)至少需要2～3個月，考慮到妊娠至分娩，至少需要1年才能獲得HSCT)；③女方在育齡期或者有配型相符的供卵者；④即使疾病預后良好，在疾病診斷后數(shù)周內(nèi)應向家庭告知PGD-HLA；⑤如果當?shù)貨]有進行PGD-HLA條件，應該和其他中心合作完成。

2胚胎活檢技術比較

2.1極體活檢

極體為卵母細胞減數(shù)分裂產(chǎn)物，無明顯生物學作用，對胚胎后續(xù)發(fā)育影響極小，取材方便，活檢時間早，有充足時間進行基因診斷，易于接受。極體活檢的缺點在于遺傳性診斷范圍局限，不能檢測父源性基因或染色體組成，需要連續(xù)活檢第一極體和第二極體，極體體積很小容易降解，因此應用較少。

2.2卵裂球活檢

一般認為卵裂期胚胎是全能的，取1個細胞活檢不影響胚胎發(fā)育。卵裂球活檢后可以新鮮移植胚胎，是PGD活檢的主要方法，大約占報道PGD周期的90%。其缺點在于取材少，卵裂期胚胎染色體異常比例大[10]，胚胎存在嵌合體可導致誤診。胚胎在發(fā)育過程中，可能存在自我矯正機制。卵裂球活檢可能造成正常胚胎浪費。

2.3囊胚活檢

近年來，隨著玻璃化冷凍技術的開展，囊胚活檢逐漸成為趨勢。囊胚活檢可從滋養(yǎng)外胚層活檢10個細胞，準確性增加，有助于診斷嵌合體，移植胚胎著床率高。由于遺傳學診斷所需時間導致囊胚需冷凍移植，冷凍解凍過程可能造成囊胚損傷，體外培養(yǎng)時間的延長可能導致遺傳印記疾病發(fā)生。D6新鮮移植在高齡女性中妊娠率顯著降低。

3診斷技術

過去的20年間，胚胎種植前遺傳檢測主要通過PCR或FISH技術進行胚胎篩選，近年來，出現(xiàn)了很多新興的遺傳檢測方法，使得同時檢測23條染色體成為可能。

3.1聚合酶鏈式反應

聚合酶鏈式反應(polymerasechainreaction,PCR)主要用于單基因病的診斷，缺點在于費時，每一對夫妻或遺傳疾病都需要制定一套方案，且取材少，可能出現(xiàn)模板量少，擴增效率低，被污染，等位基因脫扣(alleledrop-out,ADO)。

3.2熒光原位雜交

熒光原位雜交(fluorescenceinsituhybridization,FISH)是最早應用于PGD/PGS的分子技術。FISH根據(jù)被檢測基因設計特異寡核苷酸探針，進行熒光標記后與染色體或間期核雜交，通過在熒光顯微鏡下觀察熒光以篩查染色體異常。

FISH探針穩(wěn)定性好，技術簡單，時間短，重復性好，可以檢測出染色體異常和鑒別性別，缺點在于由于探針數(shù)量限制，檢測的染色體數(shù)目少。倒位和羅氏易位患者進行FISH-PGD可以提高IVF成功率[11]。9項隨機對照試驗顯示FISH-PGS不能提高IVF的活產(chǎn)率[12]。

3.3比較基因組雜交技術

比較基因組雜交技術(comparativegenomichybridization,CGH)技術是在FISH技術基礎上發(fā)展起來一種新的分子細胞遺傳學技術。CGH利用不同顏色的非同位素熒光標記待測細胞DNA與正?；蚪MDNA，兩者混合后制備成探針，通過與正常人外周血白細胞的有絲分裂中期染色體原位抑制雜交，再分別進行檢測，通過比較兩種熒光探針熒光信號強度差異，判斷遺傳物質(zhì)的缺失與重復。CGH檢測周期短，效率高，但診斷昂貴、技術要求高、耗時(需要72小時)，不能區(qū)分非整倍體異常和染色體平衡易位攜帶。

3.4微陣列-比較基因組雜交

微陣列-比較基因組雜交(array-basedcomparativegenomichybridization,aCGH)又稱arrayCGH，是一種將基因芯片和CGH相結合的新技術。將待檢測細胞DNA與基因組DNA用熒光標記后和基因芯片進行雜交。具有高通量，高分辨率，高靈敏度，快速，自動化，但是不能檢出所有的染色體異常，例如染色體倒位。

3.5單核苷酸多態(tài)性

單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotidepolymorphism,SNP)是指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。SNP分布于整個基因組，具有很好的遺傳穩(wěn)定性。2010年，SNP芯片首次用于PGS。SNP芯片原理在于針對等位基因設計探針，用化學熒光標記待檢DNA后與探針雜交，根據(jù)熒光強弱判斷被檢序列的變異。某些SNP可能與疾病發(fā)生有關。SNP最大的優(yōu)越性在于可以同時做每個胚胎的DNA指紋分析。

SNP易于自動化分析，分辨率高，準確性高，可發(fā)現(xiàn)微小的非平衡染色體的缺失、重復和易位，但是費用昂貴，無法完全區(qū)分正常和平衡易位攜帶者的胚胎。在單細胞水平，SNP芯片技術檢出率顯著高于傳統(tǒng)FISH技術。同一胚胎不同單卵裂球間，SNP芯片結果一致性顯著高于FISH[13]。與FISH-PGD相比較，SNP-PGD懷孕率高，流產(chǎn)率低[14]。

3.6全基因組擴增技術

全基因組擴增技術(wholegenomeamplification,WGA)不能直接進行染色體分析，是將單細胞中全基因組單拷貝DNA由pg級別擴增到μg級別，為下游高通量遺傳檢測提供充足樣本，以實現(xiàn)微量DNA多基因位點分析和重復檢測。具有快速、高效、準確性高的特點。

3.7高通量測序

高通量測序又稱新一代測序技術(nextgenerationsequencing,NGS)?？稍跀?shù)百萬個位點上同時進行閱讀測序，定量，能有效監(jiān)測差異性中等或較小的基因，敏感度和特異度高。

3.8單細胞基因組測序

單細胞基因組測序可以發(fā)現(xiàn)更微小的染色體缺失和重復，并且可以一次檢驗更多標本。能夠同時進行染色體異常、單基因疾病、線粒體異常的診斷。具有成本低、速度快的優(yōu)點?；蚪M測序的深度影響結果，如果測序深，將導致信息量大，胚胎篩選困難，如果測序淺，則可能造成漏診。如今，全面染色體篩查(comprehensivechromosomescreening,CCS)也運用于臨床。CCS可以運用多種基因檢測方法(CGH、aCGH、SNP、qPCR、NGS)，在胚胎不同時期(極體、卵裂期和囊胚期)分析所有染色體成分，提高種植率[15-16]。Karyomapping是改良的SNP檢測技術，主要用于單基因病，通過對比父母和家庭成員的染色體片段，篩選出不攜帶致病基因的胚胎進行移植，但是難以檢測新發(fā)突變。

4安全性

多篇文獻報道IVF出生的孩子社會心理發(fā)展與自然妊娠孩子沒有差異[17-19]。PGD涉及單精子注射及胚胎活檢的侵入性操作，并且進行PGD助孕的夫妻可能自身患有某些遺傳性疾病、家庭成員死亡，或者經(jīng)歷了多次流產(chǎn)，這些壓力和情緒都可能影響PGD出生的孩子心理健康。

據(jù)統(tǒng)計，PGD妊娠后剖宮產(chǎn)率高，早產(chǎn)率高，低出生體重兒多，但PGD孩子認知能力與自然妊娠孩子相比無差異[20]。一項前瞻性病例對照研究提出PGD出生的孩子在心理發(fā)展上與自然妊娠出生的孩子沒有區(qū)別[21]，但仍需要大樣本長期隨訪證實PGD的安全性。

5局限性

PGD/PGS活檢屬于有創(chuàng)操作，對胚胎有一定程度的損傷。多數(shù)中心采用卵裂期活檢，卵裂期胚胎染色體異常和嵌合發(fā)生率高，活檢細胞能否能代表胎兒發(fā)育尚不十分明確。PGD/PGS可能需要冷凍胚胎，反復凍融胚胎可能降低胚胎存活率。PGS僅能對胚胎進行整倍體篩查，但是不能改善胚胎質(zhì)量或者增加可用胚胎數(shù)量。PGD/PGS可能導致IVF無可移植胚胎，并且費用昂貴，不能檢測所有遺傳缺陷，可能導致結局不良。PGD/PGS妊娠后，仍需產(chǎn)前診斷。很多疾病病因不清或是由多基因共同導致的，尤其是新發(fā)突變，這是PGS的盲區(qū)。目前對PGS安全性的評估需要多中心、大樣本隨訪。

當一項技術應用于臨床時，必須有科學證據(jù)證明對患者有益。但是尚沒有足夠證據(jù)表明PGS可以提高IVF活產(chǎn)率?？梢悦鞔_的是，PGS可以降低流產(chǎn)風險，但是活產(chǎn)率、備孕時間與自然妊娠沒有顯著差異[22]。胚胎嵌合的可糾正性，遺傳學檢測導致正常胚胎浪費，較高的費用使PGS的應用尚未完全推廣。對于IVF預后差的患者，PGS檢測非整倍體不能增加甚至會降低持續(xù)妊娠率和活產(chǎn)率。2004年以來，有11個針對高齡女性的FISH-PGS-RCT，提示高齡女性不能從中受益。因此，在進行PGD前，應對患者進行遺傳咨詢，充分告知利弊。隨著PGD/PGS廣泛應用于臨床，如何提高其活產(chǎn)率、降低誤診率、減少費用、檢測更少量的細胞成為將來優(yōu)生優(yōu)育的發(fā)展方向。隨著囊胚活檢的推廣和新的檢測技術的應用，PGS的應用價值需要進一步臨床研究證實。

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[專業(yè)責任編輯：王興玲]

Research progression on preimplantation genetic diagnosis and screening

LIU Xi-tong, TIAN Li, SHI Juan-zi

(Northwest Women’s and Children’s Hospital, Shaanxi Xi’an 710000, China)

2015-12-26

劉茜桐(1989-)，女，住院醫(yī)師，碩士，主要從事輔助生殖診治工作。

師娟子，主任醫(yī)師。

10.3969/j.issn.1673-5293.2016.01.042

R715.5

A

1673-5293(2016)01-0123-04