姚維范，劉明妍，鐘　欣，楊時(shí)倫，杜　可，毛瑞琨，魏敏杰

(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)教研室，遼寧 沈陽(yáng)　110122)

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美金剛激活NGF/TrkA信號(hào)通路改善APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙

姚維范，劉明妍，鐘欣，楊時(shí)倫，杜可，毛瑞琨，魏敏杰

(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)教研室，遼寧 沈陽(yáng)110122)

摘要:目的考察NGF/TrkA信號(hào)通路在美金剛(memantine，MEM)改善APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠的學(xué)習(xí)記憶障礙中的作用及其相關(guān)機(jī)制。方法以Morris水迷宮、被動(dòng)避暗試驗(yàn)及自主活動(dòng)試驗(yàn)觀察動(dòng)物行為學(xué)變化，免疫組化檢測(cè)小鼠腦內(nèi)Aβ1-42表達(dá)水平，ELISA法及比色法考察其腦內(nèi)ChAT及AChE活性，并用Western blot法檢測(cè)小鼠海馬NGF的水平及其特異性受體TrkA下游ERK通路相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果MEM明顯改善APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠的學(xué)習(xí)記憶障礙，并明顯降低其腦內(nèi)Aβ1-42蛋白沉積。MEM可上調(diào)NGF表達(dá)水平，繼而激活NGF-TrkA通路，明顯增加TrkA、c-raf、ERK1/2及其下游效應(yīng)蛋白CREB的磷酸化水平；同時(shí)，增強(qiáng)其腦內(nèi)ACh生成酶ChAT并降低其水解酶AChE活性。結(jié)論MEM可能通過(guò)增加NGF的表達(dá)，激活TrkA信號(hào)通路，降低APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)Aβ1-42蛋白沉積，從而改善其學(xué)習(xí)記憶障礙。

關(guān)鍵詞：美金剛；NGF；TrkA；學(xué)習(xí)記憶障礙；阿爾茨海默??；Aβ

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)是以認(rèn)知障礙為其主要特征的進(jìn)行性神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其典型的病理改變?yōu)樯窠?jīng)細(xì)胞間出現(xiàn)以β-淀粉樣肽(β-amyloid, Aβ)為核心的老年斑(senile plaques, SP)及神經(jīng)元丟失等[1]。鹽酸美金剛(memantine hydrochloride,MEM)作為第一個(gè)美國(guó)FDA批準(zhǔn)用于治療中、重度AD的藥物，是一種新型、低度親和力、電壓依賴、非競(jìng)爭(zhēng)性NMDA(N-methyl-D-aspastate)受體拮抗劑，臨床研究顯示可明顯改善中、重度AD患者的認(rèn)知、行為障礙[2-4]，其機(jī)制與通過(guò)非競(jìng)爭(zhēng)性阻斷NMDA受體，降低谷氨酸引起的NMDA受體過(guò)度興奮，阻斷谷氨酸興奮性毒性，改善學(xué)習(xí)記憶能力有關(guān)[5-6]。然而，有研究表明，美金剛改善AD還與促進(jìn)腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)表達(dá)，興奮M受體有關(guān)[7-8]，這提示著MEM可能存在多種神經(jīng)保護(hù)機(jī)制的可能性。

神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor, NGF)作為一種具有支持神經(jīng)元發(fā)育、分化、維持及營(yíng)養(yǎng)等生物學(xué)效應(yīng)的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子家族中的一員，腦內(nèi)NGF的缺乏將導(dǎo)致膽堿能神經(jīng)元凋亡、死亡及功能降低，并可抑制Aβ沉積，降低Aβ的神經(jīng)毒性[9-10]。然而，美金剛是否能通過(guò)調(diào)節(jié)NGF相關(guān)通路，調(diào)控膽堿能神經(jīng)元功能，影響Aβ沉積，從而發(fā)揮其改善學(xué)習(xí)記憶障礙的神經(jīng)保護(hù)作用，尚未見(jiàn)相關(guān)研究報(bào)道。因此，本研究擬對(duì)美金剛改善APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙、降低Aβ沉積的神經(jīng)保護(hù)作用進(jìn)行考察，并進(jìn)一步研究美金剛對(duì)APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠NGF/TrkA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響及二者的相關(guān)性進(jìn)行研究，旨在發(fā)現(xiàn)美金剛防治AD作用可能的新作用機(jī)制。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物C57 BL/6J 小鼠10只，♀♂各半，12月齡，(26±4)g；APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠20只，♀♂各半，12月齡，體質(zhì)量(23±3) g，由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的動(dòng)物飼養(yǎng)及取材均遵守實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和保護(hù)的有關(guān)規(guī)定。

1.2藥物處理對(duì)照組(WT組)：12月齡C57 BL/6J小鼠10只，♀♂各半，每日等量于實(shí)驗(yàn)組的雙蒸水灌胃，每日1次，連續(xù)灌胃4周；模型組(APP/PS1組)：12月齡APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠10只，♀♂各半，每日等量于實(shí)驗(yàn)組的雙蒸水灌胃，每日1次，連續(xù)灌胃4周；治療組(MEM-treated APP/PS1組)：12月齡APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠10只，♀♂各半，每天按5 mg·kg-1體重灌胃400 mg·L-1的MEM水溶液(購(gòu)自Sigma公司)，每日1次，連續(xù)灌胃4周。4周給藥結(jié)束后，即可開(kāi)始行為學(xué)試驗(yàn)，行為學(xué)試驗(yàn)結(jié)束后，處死動(dòng)物，取皮質(zhì)及海馬，并進(jìn)行組織固定。

1.3行為學(xué)試驗(yàn)

1.3.1避暗試驗(yàn)4周給藥結(jié)束后，開(kāi)始被動(dòng)避暗試驗(yàn)，分為訓(xùn)練和正式試驗(yàn)兩個(gè)階段：訓(xùn)練前將小鼠頭背著洞口放入明室(BA-200避暗自動(dòng)測(cè)試儀，成都泰盟科技有限公司)，先適應(yīng)環(huán)境3 min，然后給暗室銅柵通以36 V電流，小鼠一進(jìn)入暗室即受電擊，其正確反應(yīng)是回到明室，銅柵通電持續(xù)5 min，此為訓(xùn)練過(guò)程。24 h后對(duì)小鼠進(jìn)行記憶測(cè)驗(yàn)，記錄小鼠第一次進(jìn)入暗室的時(shí)間，此為避暗潛伏期，并記錄5 min內(nèi)小鼠進(jìn)入暗室的次數(shù)(即避暗穿梭錯(cuò)誤次數(shù))，5 min內(nèi)未進(jìn)入暗室的小鼠其潛伏期按300 s計(jì)算。

1.3.2Morris水迷宮試驗(yàn)在被動(dòng)避暗試驗(yàn)結(jié)束后，開(kāi)始Morris水迷宮試驗(yàn)(Morris水迷宮裝置，北京碩林苑生物科技有限公司)，分為訓(xùn)練期、定向航行試驗(yàn)和空間搜索試驗(yàn)3部分進(jìn)行。訓(xùn)練期：在定向航行試驗(yàn)前1 d，水池中不放置平臺(tái)，使小鼠在水中自由游泳2 min，使其適應(yīng)環(huán)境。定向航行試驗(yàn)：進(jìn)行定向航行試驗(yàn)時(shí)，將平臺(tái)放在固定的第二象限。該試驗(yàn)訓(xùn)練小鼠每天4次，共5 d。訓(xùn)練時(shí)，將小鼠面向池壁從4個(gè)入水點(diǎn)分別放入水池，記錄鼠入水到找到水下隱蔽平臺(tái)并站立于其上所需時(shí)間，作為潛伏期(latency)，用s表示，并記錄從小鼠入水至找到平臺(tái)通過(guò)路徑的總長(zhǎng)度，用cm表示。小鼠找到平臺(tái)后，讓其在平臺(tái)上站立30 s。若入水后60 s若小鼠仍未能找到平臺(tái)，則將其輕輕從水中引導(dǎo)拖上平臺(tái)，并停留30 s，然后進(jìn)行下一次訓(xùn)練。每只鼠從4個(gè)入水點(diǎn)分別放入水池為1次訓(xùn)練，兩次訓(xùn)練之間間隔120 s。空間搜索試驗(yàn)：在定向航行試驗(yàn)結(jié)束后，即d 6，將平臺(tái)撤去，使其在水中尋找原平臺(tái)所在位置，共120 s，記錄從小鼠第1次到達(dá)平臺(tái)原來(lái)所在位置的時(shí)間(latency)，用s表示，以及小鼠穿越原平臺(tái)的次數(shù)，來(lái)評(píng)價(jià)小鼠記憶重現(xiàn)的能力。

1.3.3自主活動(dòng)試驗(yàn)將小鼠放入自主活動(dòng)箱中(ZZ-6小鼠自主活動(dòng)測(cè)試儀，成都泰盟科技有限公司)，記錄小鼠10 min內(nèi)自主活動(dòng)次數(shù)(locomotivity)和站立次數(shù)(stand-up)。

1.4免疫組化法檢測(cè)小鼠腦組織中APP和Aβ(1-40)蛋白表達(dá)行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束24 h后，將各組小鼠3只以水合氯醛麻醉并先以200 mL生理鹽水心室內(nèi)灌流，繼而更換以4%多聚甲醛溶液灌流，取腦固定24 h，常規(guī)石蠟包埋、切片，進(jìn)行免疫組化染色。切片進(jìn)行脫蠟，水化，3%的H2O2于37℃孵育20 min，微波修復(fù)，正常山羊血清封閉液37℃封閉30 min，一抗抗體Aβ1-42抗體(1 ∶1 000，購(gòu)自CST公司)4℃孵育過(guò)夜，PBS洗后，SP法二抗37℃孵育1 h，DAB顯色，每張切片隨機(jī)數(shù)腦組織3個(gè)視野，用計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)分別測(cè)定各組小鼠每張切片內(nèi)表達(dá)陽(yáng)性蛋白神經(jīng)元的整合光密度值，以反映考察Aβ1-42陽(yáng)性蛋白表達(dá)水平。

1.5Western blot檢測(cè)小鼠海馬組織中相關(guān)蛋白表達(dá)取各組3只小鼠海馬組織，放入預(yù)冷的RIPA Buffer裂解緩沖液(50 mmol·L-1Tris-HCl buffer pH 8.0 containing 150 mmol·L-1NaCl，1% NP-40，0.5% sodium deoxycholate，0.1% sodium dodecyl sulphate，購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所)；0.1% phenylmethyl sulfonylfluoride (PMSF，購(gòu)自Roche公司)中，冰上勻漿后，4℃ 12 000×g×30 min，取上清，BCA法蛋白定量(BCA試劑盒，購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所)。每孔蛋白上樣量50 μg，SDS-PAGE電泳分離蛋白并電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。5%脫脂奶粉或5% BSA的PBST中室溫封閉2 h，一抗4℃過(guò)夜，兔抗NGF抗體(1 ∶400，購(gòu)自Santa Cruz Biotechnology公司)；兔抗TrkA、phospho-TrkA抗體(1 ∶1 000，購(gòu)自CST公司)；兔抗c-raf、phospho-c-raf、ERK1/2、phospho-ERK1/2(均為1 ∶1 500，購(gòu)自CST公司)；兔抗CREB1、Phospho-CREB1抗體(1 ∶500，購(gòu)自Santa Cruz Biotechnology公司)；兔抗Aβ1-42抗體(均為1 ∶1 000，購(gòu)自CST公司)，兔抗或鼠抗β-actin(1 ∶2 000，1 ∶2 000, 購(gòu)自Santa Cruz Biotechnology公司)中4℃過(guò)夜。PBST沖洗10 min×3遍，將膜放入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔或鼠IgG(1 ∶2 000)中，室溫中搖床振蕩60 min，用PBST洗膜10 min×3遍，ECL顯影(Super ECL Plus超敏發(fā)光液購(gòu)自北京普利萊基因技術(shù)公司)。

1.6小鼠海馬組織中ChAT和t-ChE活性測(cè)定取各組3只小鼠海馬組織，放入預(yù)冷的生理鹽水中，冰上超聲勻漿后，制成10%(W/V)的勻漿，2 000×g4℃離心10 min，取上清，BCA法蛋白定量(BCA試劑盒，購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所)后，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)t-ChE及ChAT活性(t-ChE及ChAT檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所)。

2結(jié)果

2.1MEM可明顯改善APP/PS1小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力為了研究MEM對(duì)APP/PS1小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響，分別采用被動(dòng)避暗試驗(yàn)(PAT)、Morris水迷宮試驗(yàn)(MWM)及自主活動(dòng)試驗(yàn)(LCT)來(lái)考察各組小鼠的與學(xué)習(xí)記憶相關(guān)的行為學(xué)改變。

首先，我們采用PAT法對(duì)各組小鼠經(jīng)訓(xùn)練后的避暗潛伏期(Fig 1A)和進(jìn)入暗室錯(cuò)誤次數(shù)(Fig 1B)進(jìn)行了考察。結(jié)果顯示，MEM使APP/PS1小鼠的避暗潛伏期明顯延長(zhǎng)(P<0.01)，進(jìn)入暗室的次數(shù)明顯減少(P<0.01)，初步說(shuō)明MEM可改善APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠的學(xué)習(xí)記憶障礙。

**P<0.01vsWT group;##P<0.01vsAPP/PS1 group

接著，通過(guò)Morris水迷宮試驗(yàn)連續(xù)5 d考察定向航行試驗(yàn)中尋找平臺(tái)潛伏期(Fig 2A)和尋找路徑長(zhǎng)度(Fig 2B)的變化，結(jié)果顯示在定位巡航試驗(yàn)的d 1，各組小鼠的尋找平臺(tái)潛伏期及路徑長(zhǎng)度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；而在d 2～5定位巡航試驗(yàn)的學(xué)習(xí)過(guò)程以后，MEM可使APP/PS1組小鼠的尋找平臺(tái)潛伏期和路徑長(zhǎng)度明顯縮短(P<0.05)，并呈現(xiàn)出明顯的學(xué)習(xí)與記憶的獲得曲線。在d 6撤去平臺(tái)后的空間探索實(shí)驗(yàn)中，繼續(xù)考察各組小鼠在原平臺(tái)所在目的象限的停留時(shí)間(Fig 3A)，以及原平臺(tái)所在位置的穿梭次數(shù)的差異(Fig 3B)對(duì)其記憶再現(xiàn)能力的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MEM可明顯延長(zhǎng)APP/PS1小鼠在目的象限的停留時(shí)間和穿梭次數(shù)(P<0.01)，這進(jìn)一步說(shuō)明MEM可改善APP/PS1小鼠的學(xué)習(xí)記憶障礙。

**P<0.01vsWT group;#P<0.05,##P<0.01vsAPP/PS1 group

最后，應(yīng)用自主活動(dòng)試驗(yàn)考察各組小鼠的自主活動(dòng)次數(shù)(Fig 4A)和站立次數(shù)(Fig 4B)的差異。結(jié)果顯示，各組小鼠的10 min內(nèi)站立次數(shù)和自主活動(dòng)次數(shù)差異均無(wú)顯著性(P>0.05)，提示APP/PS1小鼠的活動(dòng)能力未受影響，即上述行為學(xué)指標(biāo)的改變是由于學(xué)習(xí)記憶障礙所引起的，而不是由于小鼠活動(dòng)能力的改變而引起的。

2.2MEM明顯降低APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠海馬內(nèi)Aβ1-42沉積前述的試驗(yàn)結(jié)果已證實(shí)，MEM可改善APP/PS1小鼠的學(xué)習(xí)記憶障礙，而APP/PS1小鼠的學(xué)習(xí)記憶障礙又與Aβ沉積密切相關(guān)。因此，我們又采用免疫組化法對(duì)MEM是否能夠影響APP/PS1小鼠海馬和皮質(zhì)中AD特異性病理標(biāo)志物Aβ1-42沉積進(jìn)行了考察。通過(guò)對(duì)Aβ1-42的研究發(fā)現(xiàn)(Fig 5)，APP/PS1組小鼠海馬及皮質(zhì)Aβ1-42陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)明顯增加，而MEM可明顯降低APP/PS1組小鼠皮質(zhì)Aβ1-42陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)(P<0.01)，提示MEM可改善APP/PS1小鼠皮質(zhì)的Aβ1-42沉積。

**P<0.01vsWT group;##P<0.01vsAPP/PS1 group

2.3MEM可提高APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠海馬和皮質(zhì)內(nèi)ChAT和t-ChE的表達(dá)水平AD小鼠腦內(nèi)膽堿能神經(jīng)元功能降低，MEM作為抗AD經(jīng)典藥物，是否對(duì)膽堿能神經(jīng)元具有改善作用？這成為下一個(gè)我們關(guān)注的問(wèn)題。我們對(duì)膽堿能神經(jīng)元功能相關(guān)酶ACh生成的限速酶ChAT及水解酶t-ChE的表達(dá)水平進(jìn)行了考察。研究發(fā)現(xiàn)，MEM可明顯增加APP/PS1組小鼠前葉皮質(zhì)ChAT的活性(P<0.01，F(xiàn)ig 6A)，同時(shí)明顯降低其水解酶t-ChE的活性(P<0.05，F(xiàn)ig 6B)，提示MEM可通過(guò)提高ChAT，并降低t-ChE的活性，增加ACh的生成。

A:The typical immunohistochemical figures;B:The statistical results;**P<0.01vsWT group;##P<0.01vsAPP/PS1 group

**P<0.01vsWT group;#P<0.05,##P<0.01vsAPP/PS1 group

2.4MEM調(diào)節(jié)APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠海馬內(nèi)NGF相關(guān)TrkA/p75NTR信號(hào)通路的平衡發(fā)揮其抗AD作用如前所述，MEM抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡作用，從而發(fā)揮其神經(jīng)保護(hù)作用，而也有研究表明MEM可增高腦內(nèi)BDNF的表達(dá)水平[27]，提示MEM可能亦對(duì)神經(jīng)元功能相關(guān)的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子有提高作用。而NGF作為一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，有大量研究已表明其對(duì)膽堿能細(xì)胞發(fā)揮營(yíng)養(yǎng)支持及抑制細(xì)胞凋亡作用[19-20,28]。因此，我們以Western blot法考察了各組小鼠腦內(nèi)NGF的表達(dá)水平，考察MEM提高膽堿能神經(jīng)元的功能是否與神經(jīng)生長(zhǎng)因子NGF相關(guān)。結(jié)果顯示，MEM可明顯增加APP/PS1組小鼠海馬內(nèi)NGF蛋白表達(dá)水平(P<0.01，F(xiàn)ig 7A)，表明MEM可上調(diào)APP/PS1小鼠海馬內(nèi)低NGF狀態(tài)。進(jìn)而，我們對(duì)NGF相關(guān)TrkA信號(hào)通路及其下游底物進(jìn)行了考察，發(fā)現(xiàn)MEM可明顯增加APP/PS1小鼠海馬內(nèi)TrkA(P<0.01，F(xiàn)ig 7B)、c-Raf(P<0.01，F(xiàn)ig 7C)、ERK1/2(P<0.01，F(xiàn)ig 7D)、CREB(P<0.01，F(xiàn)ig 7E)的磷酸化水平，但總蛋白水平不變，提示MEM通過(guò)激活NGF-TrkA信號(hào)通路，促進(jìn)其下游ERK通路及與學(xué)習(xí)記憶相關(guān)底物CREB的激活，從而改善學(xué)習(xí)記憶能力。

3討論

鹽酸美金剛是一種治療中、重度AD的藥物，能夠明顯改善AD患者的學(xué)習(xí)記憶能力[11-12]。我們的研究結(jié)果也顯示，美金剛可改善12月齡APP/PS1轉(zhuǎn)基因AD小鼠的的學(xué)習(xí)記憶障礙(Fig 1～4)，并可降低其腦皮質(zhì)內(nèi)Aβ1-42表達(dá)水平(Fig 5～6)。這一結(jié)果與Alley等[13]、Nagkura等[14]與Arif等[15]研究發(fā)現(xiàn)的美金剛可降低AD細(xì)胞模型及APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)Aβ1-42的水平的研究結(jié)果顯示了一致性[16]。

美金剛可通過(guò)輕度非競(jìng)爭(zhēng)性阻斷NMDA受體而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，但與其他臨床試驗(yàn)失敗的非競(jìng)爭(zhēng)性NMDA拮抗劑如Dizocilpine[(+)MK-801]、Cerestat(CNS-1102)、Licostinel(ACEA 1021)、Selfotel(CGS-19755)和d-CPP-ene相比[17]，美金剛除了阻斷NMDA受體外，美金剛還可通過(guò)降低AD動(dòng)物腦內(nèi)的Aβ沉積，保護(hù)海馬神經(jīng)元不受Aβ細(xì)胞毒性作用[13,17-18]，同時(shí)，亦可抑制LTP，改善大鼠學(xué)習(xí)記憶障礙[19]，還可促進(jìn)腦內(nèi)BDNF表達(dá)，興奮M受體[7-8]，這提示MEM的抗AD作用存在多種可能保護(hù)機(jī)制。因此，本研究首次以美金剛調(diào)控腦內(nèi)，NGF相關(guān)通路這一新的作用機(jī)制，對(duì)MEM改善12月齡(相當(dāng)于中、重度AD)APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠的學(xué)習(xí)記憶障礙及抑制腦內(nèi)Aβ沉積的作用機(jī)制及其相關(guān)性進(jìn)行了研究。

NGF作為一種主要的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，對(duì)神經(jīng)元主要起營(yíng)養(yǎng)、支持作用，并可影響Aβ沉積，降低Aβ毒性，與學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)[16-17,20-22]。又有研究表明，NGF的合成主動(dòng)依賴于NMDA受體的調(diào)控[23-24]，內(nèi)源性NGF與膽堿能系統(tǒng)功能密切相關(guān)[22]。因此，我們考察了MEM對(duì)APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)NGF的影響，并同時(shí)對(duì)膽堿能神經(jīng)元活性標(biāo)記物ChAT及ACh水解酶t-ChE進(jìn)行了考察，發(fā)現(xiàn)MEM可上調(diào)APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)NGF的表達(dá)水平，同時(shí)增加ChAT的活性，降低t-ChE的活性，提高了乙酰膽堿的表達(dá)(Fig 6～7A)。

已知NGF可通過(guò)激活其高親和力受體TrkA信號(hào)通路，調(diào)節(jié)細(xì)胞分化和生存，其下游底物CREB蛋白的磷酸化和激活，可阻斷Aβ的寡聚化和形成，降低Aβ的神經(jīng)毒性[25]。以上提示，NGF/TrkA通路不僅與細(xì)胞生存密切相關(guān)，亦同時(shí)參與了抑制Aβ沉積過(guò)程，從而在AD過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。因此，我們發(fā)現(xiàn)MEM在上調(diào)NGF表達(dá)的基礎(chǔ)上，對(duì)NGF介導(dǎo)的高親和力受體TrkA信號(hào)通路與低親和力受體p75NTR信號(hào)通路進(jìn)行了考察，以期探討MEM的抗AD作用是否與NGF及其信號(hào)通路活化相關(guān)。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MEM可使NGF高親和力功能性受體TrkA的磷酸化增加，并進(jìn)一步激活其下游c-Raf和ERK1/2等蛋白的磷酸化，活化了促進(jìn)細(xì)胞分化和生存的ERK信號(hào)傳導(dǎo)通路，但總蛋白水平不變(Fig 7)。這與Williams等[26]發(fā)現(xiàn)向出現(xiàn)記憶障礙的老年大鼠腦內(nèi)注射N(xiāo)GF可增加基底前腦TrkA水平，并激活MAPK途徑，且ERK總蛋白水平不變的結(jié)果是一致的。同時(shí)，本研究亦發(fā)現(xiàn)MEM通過(guò)激活NGF/TrkA信號(hào)通路而增加其下游與學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)底物CREB的磷酸化(Fig 8D)，這與Autio等[27]發(fā)現(xiàn)的腹腔注射膽堿酯酶抑制劑多奈哌齊和加蘭他敏可增加成年小鼠海馬內(nèi)的TrkA磷酸化水平，進(jìn)而增加CREB磷酸化水平的研究結(jié)果也是保持一致的。

Fig 7MEM treatment increased NGF expression(A),and activated NGF/TrkA signaling by increasing phosphorylation levels of TrkA(B),c-Raf(C) and ERK1/2(D), finally upregulated phosphorylation level of CREB(E) downstream in hippocampus of APP/PS1 mice by Western blot(n=3)**P<0.01vsWT group;##P<0.01vsAPP/PS1 group

綜上結(jié)果，MEM可能通過(guò)增加NGF的表達(dá)，激活TrkA信號(hào)通路，降低APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)Aβ1-42蛋白沉積，從而改善其學(xué)習(xí)記憶障礙。

(致謝：本實(shí)驗(yàn)在中國(guó)醫(yī)科大學(xué)藥理教研室完成，感謝魏敏杰教授和劉明妍教授的悉心指導(dǎo)，同時(shí)感謝鐘欣、楊時(shí)倫、杜可、毛瑞琨的參與和幫助。)

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signaling by increasing the phosphorylation of TrkA following the increased phosphorylation of c-Raf, ERK1/2 and downstream effector CREB after MEM treatment.ConclusionMEM treatment may activate the NGF/TrkA signaling in APP/PS1 mice to reduce amyloidosis and cognitive deficits.

Memantine improves cognitive deficits by activiating NGF/TrkA signaling in APP/PS1 transgenic mice

YAO Wei-fan, LIU Ming-yan, ZHONG Xin, YANG Shi-lun, DU Ke, MAO Rui-kun, WEI Min-jie

(DeptofPharmacology,SchoolofPharmacy,ChinaMedicalUniversity,Shenyang110122,China)

Key words:memantine；NGF；TrkA；cognitive deficits；Alzheimer′s disease；Aβ

Abstract:AimsTo study the role of NGF/Trk A signaling pathway in Memantine (MEM) improving APP/PS1 transgenic mice cognitive deficits and to explore its possible mechanisms. MethodsCognitive performance was assessed by Morris water maze(MWM), passive avoidance test(PAT) and locomotivity test. Aβ1-42protein levels were determined by immunohistochemistry. The activities of AChE and ChAT were also examined by ELISA and colorimetry. Western blot was used to detect the expression levels of NGF and its receptor TrkA and the downstream ERK pathway.ResultsMEM treatment significantly ameliorated the cognitive deficits, dramatically reduced the Aβ1-42overexpression. MEM increased the activity of choline acetyltransferase(ChAT), while decreased that of acetylcho-line esterase(AChE). Moreover, MEM activiated NGF

收稿日期：2015-12-09,修回日期：2016-01-11

基金項(xiàng)目：國(guó)家科技部“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(xiàng)子課題(No 2013ZX09103001-003)，國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 81501098)，遼寧省教育廳科學(xué)研究一般項(xiàng)目(No L2012279)，遼寧省科學(xué)技術(shù)計(jì)劃項(xiàng)目(No 2013225079)

作者簡(jiǎn)介：姚維范(1984-)，男，助理實(shí)驗(yàn)師，研究方向：神經(jīng)藥理學(xué)和分子腫瘤學(xué)，E-mail：ywf3209@163.com; 魏敏杰(1963-)，女，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：神經(jīng)藥理學(xué)和分子腫瘤學(xué)，E-mail：weiminjiecmu@163.com

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2016.04.007

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1001-1978(2016)04-0473-08

中國(guó)圖書(shū)分類號(hào)：R-332；R322.81；R338.64；R394；R745.7；R977.3；R977.6

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-3-18 11:22網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160318.1122.014.html

◇論著◇