劉小鶯吳　莉,陳　洲,劉禮斌

(福建醫(yī)科大學(xué) 1.附屬協(xié)和醫(yī)院內(nèi)分泌科福建省內(nèi)分泌研究所、2. 老年健康研究院、3.藥學(xué)院, 福建 福州　350001)

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PTEN抑制劑對高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞衰老的影響

劉小鶯1,2吳莉1,2,陳洲3,劉禮斌1,2

(福建醫(yī)科大學(xué) 1.附屬協(xié)和醫(yī)院內(nèi)分泌科福建省內(nèi)分泌研究所、2. 老年健康研究院、3.藥學(xué)院, 福建 福州350001)

摘要：目的PTEN抑制劑對高糖誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞衰老的影響。方法原代內(nèi)皮細胞的培養(yǎng)和鑒定，CCK8檢測細胞生存率，實驗分為正常組(C)、高糖組(HG)，PIC處理組(PIC)。C組糖濃度為5.6 mmol·L-1(C組)，HG濃度為30 mmol·L-1(HG)，PIC組過氧釩(PIC)濃度為10、100 nmol·L-1，預(yù)培養(yǎng)半小時后加高糖。流式細胞測定細胞凋亡，β-半乳糖苷酶染色試劑盒(SA-β-Gal)染色測定陽性細胞數(shù)，實時定量PCR測定p16、PTEN基因表達，Western 印跡檢測總PTEN p16蛋白表達水平。結(jié)果高糖降低內(nèi)皮細胞生存率，高糖誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞PTEN基因及蛋白表達增加，增加β-半乳糖苷酶染色性陽性細胞數(shù)， p16、PTEN基因及蛋白表達增加。PIC增加高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞生存率，降低高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞p16、PTEN基因及蛋白的表達。高糖可以誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞凋亡，PIC降低高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞凋亡率。結(jié)論適當(dāng)濃度PTEN抑制劑降低高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞衰老。高糖作用時間6 d可以誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞凋亡，PIC降低高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞凋亡率。

關(guān)健詞：內(nèi)皮細胞；PTEN；p16；細胞衰老；PI3K-AKT；高糖

糖尿病是心血管疾病的致病因素之一[1]。細胞不可逆的生長停滯的狀態(tài)為衰老，糖尿病主要特征是高血糖，高糖可以誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞衰老[2]。動脈粥樣硬化斑塊處內(nèi)皮細胞與非斑塊處的內(nèi)皮細胞相比，呈現(xiàn)出衰老細胞的特征，血管內(nèi)皮細胞在衰老過程中，分泌的各種生物活性因子也在發(fā)生變化，如內(nèi)皮依賴性血管舒張因子合成下降、炎性因子合成增加、黏附因子表達增多等[3]。細胞的老化加快動脈粥樣硬化的進程[4]。

PTEN(phosphatase and tensinhomology deleted on chromosome ten)是具有脂質(zhì)和蛋白雙特異性磷酸酶活性的抑癌基因，去磷酸化PIP3，生成PIP2，負調(diào)節(jié)PI3K-AKT信號通路[5]。高糖抑制PI3K-AKT信號通路誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞凋亡是PTEN依賴性[6]。過氧釩(PIC)是蛋白酪氨酸磷酸酶的抑制劑，低劑量就可以和PTEN酶結(jié)合，抑制其活性[7]。PI3K-AKT信號通路與細胞周期的調(diào)控有關(guān)，抑制PI3K-AKT使細胞處于G1期，誘導(dǎo)纖維細胞衰老[8]。因此，研究PTEN抑制劑對高糖誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞衰老相關(guān)細胞衰老的影響，為糖尿病血管并發(fā)癥提供治療的新思路。

1材料與方法

1.1材料內(nèi)皮細胞專用培養(yǎng)基購自Sciencecell ；0.025 g·L-1胰酶，膠原酶Ι購自GIBCO；CCK8，β-半乳糖苷酶(β-gal)試劑盒購自碧云天；Annexin-V-FLUOS 染色試劑盒購自Roche公司；RNAprep Pure總RNA提取試劑盒試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Promega 公司，SYBR Premix Ex Taq 定量試劑盒購自日本TaKaRa公司；BCA蛋白定量試劑盒，HRP化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒購自武漢博士德公司；PTEN、 p16 抗體購自CST公司；過氧釩(PIC)購自Merck公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)取當(dāng)天剖腹產(chǎn)新鮮臍帶10～15 cm，0.01 g·L-1膠原酶Ι消化內(nèi)皮細胞，37℃消化15 min。收集所有消化液，1000 r·min-1離心 15 min，棄上清，加入 4 mL培養(yǎng)液懸浮細胞，接種到塑料培養(yǎng)瓶中。細胞生長融合達80%～90%，胰酶消化細胞，取2～6代細胞做實驗。

1.2.2原代內(nèi)皮細胞簽定FⅧ因子免疫組織化學(xué)染色鑒定內(nèi)皮細胞。

1.2.3實驗分組實驗分為正常組、實驗組、PIC處理組，正常組糖濃度為5.6 mmol·L-1(C組)，實驗組糖濃度為30 mmol·L-1(HG)，PIC處理組的PIC濃度分別為1、10、100、1000 nmol·L-1(PIC)，PIC預(yù)培養(yǎng)0.5 h后加入高糖，各組作用時間為2、4、6 d，實驗重復(fù)5次。選取合適的高糖處理時間和PIC處理濃度。

1.2.4CCK8檢測細胞生存率96孔板每孔加入100 μL 105個細胞，按照實驗需要進行培養(yǎng)，實驗結(jié)果后每孔加入10 μL CCK-8溶液，在細胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育1 h，450 nm測定吸光度。

1.2.5β-半乳糖苷酶染色試劑盒(SA-β-Gal)測定細胞衰老衰老細胞在pH 6.0時有高β-半乳糖苷酶活性，以X-Gal為底物催化下會生成深藍色產(chǎn)物。顯微鏡下可以看到藍色的表達β-半乳糖苷酶的陽性細胞。6孔板培養(yǎng)的細胞，按實驗分組處理細胞后，室溫固定15 min，每孔加入1 mL染色工作液，37℃孵育6 h，顯微鏡下觀察。計數(shù)陽性細胞數(shù)。

1.2.6FITC- PI雙染流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率參照Annexin-V-FLUOS 染色試劑盒說明書操作：細胞分組干預(yù)后，用胰酶(0.25%，不含EDTA)消化處理細胞，1000 r·min-1離心5 min,收集細胞沉淀，PBS清洗2遍后，加入500 μL FITC/PI試劑盒緩沖液重懸細胞，取300 μL懸液于流式管中，分別加入FITC 3 μL、PI 3 μL，避光15 min后上機檢測。

1.2.7實時熒光定量PCR測定RNAprep Pure總RNA提取試劑盒，電泳結(jié)果顯示出清晰的28 S和18 S兩條帶，且28 S>18 S，Rromega逆轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得cDNA產(chǎn)物(按Rromega公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行)，SYBR GreenⅠ實時定量PCR反應(yīng)在LightCycle熒光PCR儀上測定,引物分別是：目標(biāo)基因p16 5′-CCCCACTACCGTAAATGTCCA-3′;5′-TG CTCACTCCAGAAAACTCCAA-3′目標(biāo)基因PTEN5′-TCAGGCGAGGGAGATGAGA-3′,5′-GACGAAGAGGA GGCGAGAAA-3′ PTEN 目標(biāo)基因P21 5′-TCAAAT CGTCCAGCGACCTTC-3′;5′-CATGCCCTGTCCATAG CCTCTAC-3′內(nèi)參基因(GAPDH)的擴增效率一致，不同試驗組內(nèi)參基因GAPDH相差1～2個循環(huán)，利用2-△△CT方法進行相對定量。

1.2.8Western blot檢測總PTENp16蛋白水平：收集細胞，裂解液裂解，4℃，12 000 r·min-1離心10 min，取上清，BCA法測定蛋白濃度，上樣緩沖液稀釋各樣品蛋白，95℃變性5 min后上樣。先后經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉過夜后，分別加入PTEN、p16一抗4℃振蕩過夜，TBST洗5 min×3次，加入HRP標(biāo)記的二抗常溫孵育1 h，ECL法顯影，應(yīng)用凝膠成像分析儀測定蛋白條帶灰度后，計算各蛋白條帶和內(nèi)參照β-actin 的比值。

2結(jié)果

2.1內(nèi)皮細胞的培養(yǎng)和鑒定原代內(nèi)皮細胞培養(yǎng)3 h后開始貼壁，24 h完全貼壁，早期貼壁細胞呈短梭形，細胞多成團生長，少數(shù)細胞分散生長；2～3 d后細胞單層鋪滿呈鋪路石樣生長(Fig 1)。內(nèi)皮細胞FⅧ抗原相關(guān)染色鑒定，F(xiàn)Ⅷ是由因子FⅧ促凝成分(FⅧ∶C)和內(nèi)皮細胞合成的vWF(von Willebrand factor)組成的一種復(fù)合物，F(xiàn)Ⅷ抗原陽性細胞表現(xiàn)為胞質(zhì)中可見染成棕褐色的顆粒，取3～5代的細胞做實驗。Fig 1A原代培養(yǎng)HUVECs細胞形態(tài)(×200);Fig 1B細胞免疫化學(xué)染色法鑒定HUVECs(×400)，胞質(zhì)中出現(xiàn)棕褐色顆粒細胞為FⅧ抗原陽性表達細胞。

A：Morphology of HUVEC(×100)；B：Identification of HUVEC by FⅧ immunochemical staining

2.2CCK-8測定細胞的生存率Fig 2A： HG組不同時間點高糖對內(nèi)皮細胞生存率的影響，以C為對照組，30 mmol·L-1高糖降低內(nèi)皮細胞生存率,并隨時間延長降低，作用2、4、6 d生存率分別為86.5%±3.5%、73.5%±5.1%、65.4%±4.6%(P<0.01，n=5)；Fig 2B: PIC 對內(nèi)皮細胞生存率的影響，與C組相比，1000 nmol·L-1PIC降低內(nèi)皮細胞生存率，生存率為76.2%±3.7% (P<0.01，n=5)，其它濃度PIC對內(nèi)皮細胞生存率沒的影響；Fig 2C: 以C對照組，不同濃度 PIC 預(yù)培養(yǎng)0.5 h后，30 mmol·L-1高糖作用4 d對細胞生存率的影響，與高糖作用組相比，10、100 nmol·L-1PIC可以增加高糖作用內(nèi)皮細胞的生存率(P<0.01，n=5)。

2.3PTEN抑制劑對高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞凋亡的影響根據(jù)CCK8結(jié)果實驗分為以C組、高糖處理組(HG)、PIC 10 nmol·L-1+高糖處理組、PIC 100 nmol·L-1+高糖處理組，作用時間為6 d。流式結(jié)果顯示C、HG、PIC 10 nmol·L-1+高糖處理組、PIC 100 nmol·L-1+高糖處理組凋亡率分別為(10.2±1.06)%、(28.64±1.83)%、(16.40±1.86)%、(15.40±1.16)%，高糖作用內(nèi)皮細胞6 d，細胞的凋亡率增加，PIC 10 nmol·L-1+高糖處理組、PIC 100 nmol·L-1+高糖處理組降低高糖誘導(dǎo)的細胞凋亡。與C組相比，HG組P<0.01；PIC組與HG相比，P<0.01；PIC 10 nmol·L-1+高糖處理組、PIC 100 nmol·L-1+高糖處理組相比差異沒有顯著性，n=3。如Fig 3所示。

A:Different time of high glucose on endothelial cell survival rate; B:Influence of different concentration of PIC on endothelial cell survival rate;C: Influence of different concentration of PIC on high glucose induced endothelial cell survival rate.**P<0.05vsHG

**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsHG

2.4PTEN抑制劑對高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞衰老的影響實驗分為C組、高糖處理組(HG)、PIC 10 nmol·L-1+高糖組、PIC 100 nmol·L-1+高糖組，作用時間為4 d。 A圖顯示SA-β-Gal染色：衰老細胞表達綠色陽性細胞，HG組較C組SA-β-Gal的陽性細胞數(shù)增加，PIC 10 nmol·L-1+高糖組、PIC 100 nmol·L-1+高糖組較HG組SA-β-Gal的陽性細胞數(shù)降低。B圖顯示定量PCR結(jié)果： HG組較C組p16 mRNA表達增加(3.3±0.6)倍，PIC 10 nmol·L-1+高糖組、PIC 100 nmol·L-1+高糖組較HG組p16mRNA分別降為(2.3±0.6)、(2.1±0.4)倍。C圖顯示W(wǎng)estern-blot蛋白灰度掃描結(jié)果：HG組較C組p16蛋白表達增加(2.7±0.4)倍，PIC 10 nmol·L-1+高糖組、PIC 100 nmol·L-1+高糖組較HG組p16蛋白表達分別降為(1.7±0.2)、(1.6±0.6)。如Fig 4所示。

A:The influence of PTEN inhibitors on high glucose induced endothelial cell senescence by SA-β-gal l staining;B:The influence of PTEN inhibitors on high glucose induced endothelial cell p16rnRNA expression;C:The influence of PTEN inhibitors on high glucose induced endothelial cell p16 protein expression.*P<0.05vsHG

2.5高糖對內(nèi)皮細胞PTENmRNA及蛋白的影響對照組(C)、高糖組(HG)72 h，定量PCR結(jié)果顯示HG組較C組PTENmRNA增加(2.7±0.6)倍；Western blot結(jié)果顯示蛋白灰度PTEN/Actin比較，HG組較C組PTEN蛋白表達增加1.81±0.23。如Fig 5所示。

*P<0.05vscontrol

3討論

細胞周期可分為G1、S、G2，M 4個時期，細胞周期停滯是細胞衰老的一個關(guān)鍵特征，研究發(fā)現(xiàn)衰老細胞主要含有G1期的DNA，衰老細胞停滯于G1期，不能順利進人S期，細胞不可逆的生長停滯。p16基因是一種抑癌基因，在細胞周期的G1期調(diào)控中起重要作用，p16蛋白抑制細胞周期。G1-S期的轉(zhuǎn)化受Rb-p16-cdk4/6調(diào)控[9]。研究發(fā)現(xiàn), 細胞衰老時, p16 表達明顯增高; 當(dāng)細胞中導(dǎo)入p16 基因可出現(xiàn)衰老表型，因此p16 是細胞壽限的關(guān)鍵調(diào)控基因[10]。細胞衰老時乳糖苷酶活性增加，SA-β-Gal染色呈綠色陽性。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)與正常組相比，高糖(30 mmol·L-1)作用內(nèi)皮細胞4 d，表達SA-β-Gal綠色陽性細胞增加，p16mRNA 及蛋白表達增加，因此高糖作用內(nèi)皮細胞4 d可以誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞衰老。

細胞衰老影響細胞膜完整性，細胞內(nèi)生成的自由基、不完全氧化產(chǎn)生的自由基攻擊細胞膜上的膽固醇和不飽和脂肪酸。產(chǎn)生的有毒分子導(dǎo)致細胞凋亡和細胞死亡。實驗結(jié)果顯示，高糖(30 mmol·L-1)作用內(nèi)皮細胞4 d內(nèi)皮細胞老化，作用6 d后細胞凋亡增加，存活率明顯下降。

研究表明高糖通過上調(diào)PTEN誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞凋亡[11]，實驗結(jié)果高糖作用內(nèi)皮細胞4 d PTEN mRNA 及蛋白表達增加2倍以上，PTEN具有蛋白酪氨酸磷酸酶活性，負調(diào)節(jié)PI3K-AKT信號通路，參與調(diào)控細胞多種功能如細胞周期進展，細胞遷移、擴散和生長[12]。PIC是PTEN的抑制劑，蛋白酪氨酸磷酸酶的抑制劑，較小的劑量就可以抑制PTEN，調(diào)節(jié)PI3K-AKT信號通路。PTEN抑制對損傷的神經(jīng)元具有保護作用[13]，PTEN抑制劑能緩解內(nèi)毒素誘導(dǎo)的急性肺損傷[14]。CCK8結(jié)果顯示，單獨0.1～100 nmol·L-1PIC作用低糖培養(yǎng)的內(nèi)皮細胞，0.1～100 nmol·L-1PIC內(nèi)皮細胞的生存率略增加，1000 nmol·L-1PIC對細胞生長具有抑制作用；高糖(30 mmol·L-1)培養(yǎng)內(nèi)皮細胞4 d可以抑制細胞生存率，0.1 nmol·L-1PIC預(yù)培養(yǎng)不能改善高糖作用的內(nèi)皮細胞生存率，10、100 nmol·L-1預(yù)培養(yǎng)增加高糖作用的內(nèi)皮細胞生存率，100 nmol·L-1增加細胞生存率10 nmol·L-1沒有明顯區(qū)別，因此選擇10、100 nmol·L-1PIC為實驗濃度，此濃度范圍能有效抑制PTEN并且對細胞沒有毒性作用。流式結(jié)果顯示，10、100 nmol·L-1PIC預(yù)處理可以降低高糖誘導(dǎo)的細胞凋亡。PTEN調(diào)節(jié)胰島β細胞p16的表達，PTEN敲除可以恢復(fù)老化和受損的胰島β細胞再生[15]。結(jié)果顯示內(nèi)皮細胞p16受PTEN調(diào)節(jié)，10、100 nmol·L-1PIC使p16mRNA 及蛋白表達降低，SA-β-Gal綠色陽性細胞減少。PTEN抑制劑可以降低高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞衰老。

PTEN和p16是體內(nèi)的抑癌基因，體內(nèi)主要是起抑制腫瘤的作用。實驗結(jié)果表明，高糖作用內(nèi)皮細胞，抑癌基因表達增加誘導(dǎo)細胞衰老，同時抑制腫瘤的發(fā)生。說明體內(nèi)細胞在不良環(huán)境下，誘導(dǎo)細胞衰老，防止腫瘤的產(chǎn)生，這也是體內(nèi)的一種保護機制。

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PTEN inhibitors attenuates high glucose induced endothelial cell senescence

LIU Xiao-ying1,2, WU Li1,2, CHEN Zhou3, LIU Li-bin1,2

(1.FujianMedicalUniversityUnionHospitalEndocrinologyFujianInstituteofEndocrinology,Fuzhou350001,China; 2.ElderlyHealthResearchInstitute,FujianMedicalUniversity,Fuzhou350001,China; 3.FujianMedicalUniversityCollegeofPharmacy,Fuzhou350001,China)

Key words:endothelial cell; PTEN; p16; cell senescence; PI3K-Akt; high glucose

Abstract:AimTo study influence of PTEN inhibitors(PIC) on high glucose induced endothelial cell senescence Methods(1)HUVECs were cultured in ECM medium. Cell viability was determined by CCK-8. Cells were randomly divided into control group(C), high glucose group(HG), high glucose+10 nmol·L-1PIC group(HG+10 nmol·L-1PIC), high glucose+100 nmol·L-1PIC group(HG+100 nmol·L-1PIC). Cell apoptosis was examined by flow cytometry. Senescence Detection Kit was performed by SA-β-gal Cytochemical staining. The expression levels of genes and protein (p16 and Pten ) were detected by real-time PCR and Western blot. ResultsThe proliferation rate was markedly decreased in HG group compared with C group, and this phenomenon was reversed by PTEN inhibitors . Cell apoptosis was significantly increased in HG group compared with C group, and again these changes were blocked by PIC.The expression levels of genes (PTEN) were significantly higher in HG group compared with C group. The frequency of senescent (SA-β-Gal-positive) cells and the expression level of senescence genes (p16) were significantly higher in HG group compared with C group, and these changes were blocked by PIC. ConclusionThese results show that PTEN inhibitors(PIC) delays cellular senescence that is promoted under high glucose condition.

收稿日期：2015-12-15，修回日期：2016-02-13

基金項目：國家臨床重點?？评夏赆t(yī)學(xué)項目(No 2010306); 福建省自然科學(xué)基金資助項目(No 2014J01335)

作者簡介：劉小鶯(1972-)，女，碩士，副主任技師，研究方向：糖尿病血管并發(fā)癥，E-mail:lxy666-123@163.com; 劉禮斌(1967-)，男，博士，主任醫(yī)師，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：糖尿病血管并發(fā)癥，通訊作者，Tel:0596-83357896-8452，E-mail:libin.liu@hotmail.com.

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2016.04.015

文獻標(biāo)志碼：A

文章編號：1001-1978(2016)04-0514-06

中國圖書分類號：R329.25；R339.38；R394.2；R977.3；R977.6

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2016-3-18 11:22網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160318.1122.030.html