賈艷艷 劉莎莎 汪 洋 丁 軻 程相朝 張春杰

(河南科技大學動物疫病與公共衛(wèi)生重點實驗室，河南省動物疫病與公共安全院士工作站，洛陽471003)

減毒單增李斯特菌載體在腫瘤疫苗中的應用①

賈艷艷 劉莎莎 汪 洋 丁 軻 程相朝 張春杰

(河南科技大學動物疫病與公共衛(wèi)生重點實驗室，河南省動物疫病與公共安全院士工作站，洛陽471003)

單核細胞增生性李斯特菌(Listeria monocyto-genes,LM)是一種宿主譜廣泛的兼性胞內(nèi)菌。LM具有進入抗原提呈細胞(APCs)如巨噬細胞、樹突狀細胞(Dendritic cell，DC)等細胞胞質(zhì)的特性，使其運送外源抗原進入MHCⅠ分子和MHCⅡ分子抗原提呈途徑，從而誘導強烈的CD8+和CD4+T細胞免疫應答[1]。因此，減毒LM已被公認為是一類理想的腫瘤疫苗載體[2]。

1 生物學特性

LM是一種革蘭氏陽性兼性胞內(nèi)菌，一般通過消化道感染，然后通過腸上皮細胞散播至全身。一部分細菌通過內(nèi)化素InlA或InlB進入宿主上皮細胞和肝細胞等非吞噬細胞，散在的細菌則被巨噬細胞和吞噬細胞如肝臟的Kupffer細胞所吞噬，在胞內(nèi)LM通過分泌毒力因子溶血素O(Listeriolysin O，LLO)和磷脂酶C(Phosphatidylinositol phospholipase C，PI-PLC)降解吞噬體膜進入細胞胞漿中復制，并通過誘導宿主細胞肌動蛋白聚集，在細菌表面形成極化的肌動蛋白尾，促使LM在胞漿內(nèi)運動并向鄰近細胞擴散[3]。

2 LM感染后誘導的免疫應答

2.1 天然免疫應答 LM進入機體后，可以感染肝細胞、巨噬細胞和DC等多種細胞。LM表面有一系列Toll樣受體配體(TLR-L)如肽聚糖、脂蛋白、脂磷壁酸及核苷酸結(jié)合寡聚區(qū)(Nucleotide-binding oligomerization domain，NOD)，能夠被細胞表面受體識別，進而釋放前炎性因子和趨化因子，并激發(fā)一系列的炎癥級聯(lián)反應，發(fā)揮天然免疫應答作用[4]。另外，LM還可誘導DC表面共刺激分子(CD40、CD80和CD86)的表達及招募NK細胞至感染部位釋放產(chǎn)生IFN-γ，促進APCs的成熟[5]。LM感染產(chǎn)生強烈的天然免疫應答，能直接或間接地促進獲得性免疫應答的產(chǎn)生。

2.2 獲得性免疫應答 LM感染過程中，溶酶體中的LM被降解為抗原短肽可結(jié)合MHCⅡ類分子，從而被CD4+T細胞識別，并誘導CD4+T細胞免疫應答，且該過程釋放的Th1型細胞因子如IFN-γ和IL-2等又能輔助CD8+T細胞應答的產(chǎn)生。逃逸至胞漿中的LM釋放外源抗原快速進入蛋白降解途徑，被降解成抗原肽與MHCⅠ類分子結(jié)合形成肽復合物提呈至CD8+T細胞，活化后的CD8+T細胞產(chǎn)生穿孔素、顆粒蛋白酶及IFN-γ等介導細胞免疫應答[6]。除CD4+T細胞和CD8+T效應細胞外，LM還激活非傳統(tǒng)的T細胞亞群如γ δ T細胞、NK T細胞發(fā)揮免疫保護性效應[7]。因LM可不經(jīng)過胞外環(huán)境完成胞間感染，使其主要以細胞免疫應答為主，這也是LM作為腫瘤疫苗載體的重要優(yōu)勢之一。

3 LM毒力致弱策略

當重組活載體疫苗應用于臨床時，安全性顯得尤為關鍵，因此在設計LM載體疫苗時需要在保持免疫原性的同時，降低其致病性。目前主要有4種LM致弱策略：如刪除毒力因子、平衡互補系統(tǒng)、營養(yǎng)缺陷株及“Killed but metabolically active”(KBMA)菌株。

在這幾種致弱方法中，刪除毒力因子是最常采用的方法，不過該方法所面臨的挑戰(zhàn)是如何在刪除毒力因子的同時，仍保留其良好的免疫潛能。LM的毒力基因ActA編碼肌動蛋白聚集蛋白(Actin polymerizing protein，ActA)，主要促使LM完成胞間傳遞，plcB也是LM的重要毒力基因之一[8]。Haroula等[9]構(gòu)建了LMΔactA/ΔplcB缺失株，研究顯示成年志愿者口服LMΔactA/ΔplcB突變株后沒有表現(xiàn)出臨床病理癥狀，并且部分志愿者體內(nèi)產(chǎn)生了特異性免疫應答反應。Ma等[10]構(gòu)建了表達外源抗原的LMΔactA/ΔinlB突變株，研究表明該減毒重組株在體內(nèi)毒性顯著降低，且仍具有刺激天然免疫應答和誘導特異性T細胞免疫應答的能力，以上這些減毒株都是良好的潛在疫苗載體。

prfA基因是LM基因組中的重要轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因。Wood等[11]構(gòu)建了prfA平衡互補系統(tǒng)，并將此方法成功應用于多種癌癥治療性疫苗的開發(fā)。該方法是將攜帶目標抗原及PrfA的多拷貝質(zhì)粒pAM401導入至prfA缺失株，該菌株比野生菌毒力下降約4個數(shù)量級，仍保持較好的侵襲能力。

丙氨酸外消旋酶基因(alanine racemase gene，dal)和氨基轉(zhuǎn)移酶基因(αD-amino acid aminotransferase gene，dat)負責LM細胞壁所需D-丙氨酸的合成。Zhao等[12]構(gòu)建LMΔdal/Δdat營養(yǎng)缺陷株，通過攜帶消旋酶基因的質(zhì)粒在IPTG的誘導下供給LMΔdal/Δdat缺失株生存所需的D-丙氨酸，該缺失株在小鼠體內(nèi)是無毒的，能被機體很快清除，并且保留著CD8+T細胞的效應性功能。

以上致弱細菌方法中，易導致細菌侵襲宿主細胞能力的下降，從而影響其免疫原性。Skoberne等[13]應用一種新方法改造LM為不能復制但仍保持新陳代謝狀態(tài)(KBMA)。研究顯示應用表達外源抗原的KBMA LM菌株免疫小鼠能抵抗病毒入侵和抑制腫瘤生長，且較為安全。

4 重組LM載體腫瘤疫苗的研究進展

1992年，Schafer等[14]首次報道LM運送外源抗原能夠誘導機體產(chǎn)生強烈的特異性CD8+T細胞應答。隨后，Pan等[15]研究發(fā)現(xiàn)表達模式腫瘤抗原的重組LM菌株免疫腫瘤小鼠能引起肉眼可見的腫瘤消退，顯示LM載體通過運送腫瘤抗原發(fā)揮良好的抗腫瘤作用。從此，LM作為疫苗載體進行癌癥免疫預防和治療研究已成為眾多學者的研究方向之一。

當前重組減毒LM疫苗的構(gòu)建策略有多種。其中最常見的是平衡致死互補系統(tǒng)，即將多拷貝重組質(zhì)粒pGG-55轉(zhuǎn)化至LMΔprfA，pGG-55攜帶prfA基因與宿主菌構(gòu)成互補系統(tǒng)，其攜帶hly或actA啟動子驅(qū)動LLO或ActA與外源抗原實現(xiàn)融合表達[16]。其次，采用溫敏型質(zhì)粒pKSV7，利用同源重組技術將目標抗原定點整合至LM基因組，該重組菌不需要抗生素維持，在臨床應用方面具有顯著優(yōu)勢[17]。還可以利用整合型載體pPL1或pPL2將外源抗原定點整合至LM基因組的非必需區(qū)域(comK或tRNA Arg基因片段處)，該方法只需一步，快速便捷，但需抗生素的維持[18]。

4.1 LM載體表達外源腫瘤蛋白抗原的研究 最初，LM主要運送一些模式抗原如β-半乳糖苷酶、淋巴細胞脈絡叢腦膜炎病毒(LCMV)及流感病毒核蛋白NP[19]進行抗腫瘤研究。重組減毒LM疫苗能夠誘導抗原特異性CD8+T細胞介導的CTL應答，從而減慢腫瘤發(fā)展進程。

目前，利用減毒LM活載體進行腫瘤疫苗的研究正在如火如荼地進行，其運送的腫瘤抗原包括人乳頭瘤病毒HPV16 E7抗原、黑色素瘤抗原Mage-b、高分子量的黑色素瘤相關抗原HMW-MAA、前列腺特異抗原PSA、間皮素mesothelin、抑癌蛋白P53，肝癌抗原等[20-26]。研究顯示重組李斯特菌疫苗免疫小鼠均能夠誘導特異性CTL應答，在小鼠腫瘤模型中顯示良好的抗腫瘤效果，且不產(chǎn)生明顯的副作用。

Seavey等[27]利用減毒李斯特菌表達血管內(nèi)皮生長因子受體2(Vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR-2又稱fetal liver kinase-1)進行腫瘤血管抑制免疫療法。其中構(gòu)建的LM-LLO-Flk1菌株免疫小鼠能夠誘導抗腫瘤CTL應答的產(chǎn)生，導致肉眼可見腫瘤的消退，降低殘余腫瘤的微血管密度，從而能夠保護小鼠抵抗多種腫瘤細胞的攻擊及腫瘤轉(zhuǎn)移，顯示該重組菌具有廣泛的抗腫瘤作用。

由于中樞神經(jīng)系統(tǒng)是免疫特赦區(qū)，因此在治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤面臨一些難題如免疫應答較弱等。Prins[28]構(gòu)建兩株重組減毒李斯特菌疫苗即LM-NP(NP396-404)及LM-NP/TRP-2(NP396-404和TRP180-188)，結(jié)果表明LM-NP/TRP-2誘導小鼠產(chǎn)生較高的IFN-γ水平及強烈的TRP-2特異性CD8+T細胞應答，通過生物素影像觀察免疫小鼠的顱內(nèi)腫瘤與對照小鼠相比顯著減小，并能延長小鼠存活時間。以上這些研究結(jié)果為中樞系統(tǒng)腫瘤性疾病的臨床免疫治療帶來了福音。

Lori等[29]將LM-LLO-E7已應用于臨床實驗。試驗中選取110名復發(fā)性宮頸癌患者接受3個劑量或4個劑量LM-LLO-E7后，12個月存活期患者比例達到36%，18個月存活期比例達22%，11%的患者體內(nèi)產(chǎn)生了較強的特異性免疫應答，研究顯示重組減毒李斯特菌具有很好的應用前景。

4.2 LM載體運送cDNA/mRNA的研究 由于細菌表達抗原屬于原核表達，缺乏翻譯后修飾及存在classⅡ類T細胞表位的空間構(gòu)象問題。為此，學者利用LM載體運送cDNA或mRNA，當重組菌進入胞漿后被裂解進而釋放質(zhì)粒，利用宿主細胞進行外源抗原的表達，這種運送方式被稱為“bactofe-ction”[30]。該方式比DNA疫苗更有效地誘導免疫應答的產(chǎn)生。證實該方式構(gòu)建的疫苗免疫小鼠可誘導特異性CD8+T細胞免疫應答的產(chǎn)生，且能夠抑制腫瘤生長。但遺憾的是，研究表明這種bactofection方式的免疫效力不如LM疫苗運送蛋白抗原的方式[31]。

4.3 LM自身具有抗腫瘤作用及靶向腫瘤組織 LM對腫瘤組織有特殊的偏好性。Claudia等[32]報道LM能夠靶向腫瘤，不僅將腫瘤抗原運送至腫瘤組織，而且通過誘導腫瘤細胞內(nèi)活性氧(Reactive oxygen species,ROS)水平增高引起腫瘤細胞的死亡，證實了LM自身具有抗腫瘤作用，這些研究結(jié)果為LM腫瘤疫苗載體的開發(fā)提供重要理論基礎。

5 載體免疫應答對重組疫苗免疫效果的影響

活載體疫苗研發(fā)面臨的一個重要問題是體內(nèi)已存在的載體是否會減弱目標抗原誘發(fā)的免疫應答，尤其LM是環(huán)境中普遍存在的一類微生物。Starks等[33]研究表明小鼠體內(nèi)已存在LM抗體不會阻礙重組LM疫苗誘導功能性T細胞的活化、增殖及分化；同時Leong等[34]報道人類體內(nèi)LM載體免疫應答不會降低重組疫苗誘導的特異性免疫應答。以上研究為重組李斯特菌腫瘤疫苗的臨床應用奠定了基礎。

6 展望

由于LM的獨特胞內(nèi)生活史及其誘導強烈的MHCⅠ類免疫應答特性，使其作為腫瘤疫苗載體具有眾多優(yōu)勢，并在抗腫瘤研究中顯示較好的預防性和治療性效果，但是該載體也存在一些需要優(yōu)化的地方，如疫苗是否能穩(wěn)定表達外源抗原以及疫苗的安全性等。因此，在構(gòu)建重組疫苗時采用什么方法既降低細菌的毒力，同時又能保持其強烈的免疫原性，是研究者重點考慮的問題。我們相信隨著研究的不斷深入，減毒李斯特菌重組疫苗會得到不斷的優(yōu)化和改進，從而可以更好地應用于腫瘤性疾病的預防和治療。

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[收稿2016-01-05 修回2016-03-19]

(編輯 許四平)

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.12.032

①本文受河南省科技攻關計劃項目(No.142102110039)、河南省教育廳科學技術研究重點項目(No.14A230005)、河南科技大學博士科研啟動基金(No.09001733)、河南科技大學高級別項目培育基金項目(No.2015GJB030)和河南科技大學創(chuàng)新團隊資助。

賈艷艷(1983年-)，女，博士，副教授，主要從事分子病原學與免疫學方面的研究，E-mail:jiayanyan0120@163.com。

Q789

A

1000-484X(2016)12-1866-04