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反向間接血凝試驗(yàn)(RIHA)在動(dòng)物疾病診斷中的應(yīng)用進(jìn)展

2016-01-31 06:47莊金秋梅建國(guó)謝金文沈志強(qiáng)山東省濱州市畜牧獸醫(yī)研究院山東濱州256600濱州市貝爾凱瑞生物技術(shù)有限公司山東濱州256600
中國(guó)動(dòng)物檢疫 2016年6期
關(guān)鍵詞:診斷應(yīng)用

莊金秋,梅建國(guó),王 艷,謝金文,莫 玲,沈志強(qiáng)(. 山東省濱州市畜牧獸醫(yī)研究院,山東濱州 256600;2. 濱州市貝爾凱瑞生物技術(shù)有限公司,山東濱州 256600)

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反向間接血凝試驗(yàn)(RIHA)在動(dòng)物疾病診斷中的應(yīng)用進(jìn)展

莊金秋1,2,梅建國(guó)1,2,王艷1,謝金文1,莫玲1,沈志強(qiáng)1
(1. 山東省濱州市畜牧獸醫(yī)研究院,山東濱州256600;2. 濱州市貝爾凱瑞生物技術(shù)有限公司,山東濱州256600)

摘要:反向間接血凝試驗(yàn)(RIHA)是一種簡(jiǎn)單實(shí)用的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù),已廣泛應(yīng)用于人類及動(dòng)物疾病的田間及臨床檢測(cè)。本文概述了RIHA在動(dòng)物病毒病、細(xì)菌病和寄生蟲病診斷方面的應(yīng)用進(jìn)展,以期為獸醫(yī)臨床科技工作者更好地應(yīng)用該法診斷疾病提供參考。

關(guān)鍵詞:反向間接血凝試驗(yàn);診斷;應(yīng)用

反 向 間 接 血 凝 試 驗(yàn)(reverse indirect hemagglutination test,RIHA)是以紅細(xì)胞為載體的間接凝集試驗(yàn),即用已知的抗體致敏紅細(xì)胞,然后與樣品在適宜的條件下反應(yīng)。如果樣品中含有目的抗原,則抗原和抗體會(huì)發(fā)生特異性結(jié)合,紅細(xì)胞隨反應(yīng)的發(fā)生出現(xiàn)肉眼可見的凝集現(xiàn)象。RIHA是一種簡(jiǎn)單、實(shí)用的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù),其顯著特點(diǎn)是操作簡(jiǎn)便、快速,結(jié)果準(zhǔn)確,無需特殊儀器和試劑,現(xiàn)場(chǎng)適應(yīng)性高,已廣泛應(yīng)用于人類及動(dòng)物疾病的田間及臨床檢測(cè)。本文綜述了RIHA在動(dòng)物疾病診斷中的應(yīng)用進(jìn)展,以期為獸醫(yī)臨床中致力于疾病診斷的科研工作者提供參考。

1 動(dòng)物病毒病

1.1豬病

RIHA是我國(guó)鑒定口蹄疫病毒(Foot and mouth disease virus,F(xiàn)MDV)的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn),該方法能夠快速對(duì)FMDV進(jìn)行初步鑒定。用A、O、C型口蹄疫的豚鼠高免血清致敏豬水皰病病毒(swine vesicular disease virus,SVDV)高免血清抗體球蛋白,用1%戊二醛、甲醛固定的綿羊紅細(xì)胞制備的抗體紅細(xì)胞,與不同稀釋度的待檢抗原進(jìn)行RIHA試驗(yàn),可在2~7 h內(nèi)快速區(qū)別診斷豬水皰病和口蹄疫。何永強(qiáng)等[1]通過單克隆抗體斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(McAb Dot-ELISA)和RIHA分別對(duì)豬FMDV和SVDV檢測(cè)比較。結(jié)果表明,McAb Dot-ELISA特異性強(qiáng),快速簡(jiǎn)便,比RIHA更為敏感、穩(wěn)定和直觀。RIHA雖然靈敏度較高,但個(gè)別被檢抗原可能在低稀釋度孔內(nèi)出現(xiàn)非特異性凝集。用豬瘟病毒(Clssical swine fever virus,CSFV)免疫血清提取IgG并且純化后,致敏綿羊紅細(xì)胞,建立RIHA方法,可用于檢測(cè)脾臟、淋巴結(jié)、扁桃體等病原較集中存在的組織中的CSFV抗原。不足之處在于處理組織病料的方法有差異,所以易對(duì)組織中的血細(xì)胞造成干擾,從而出現(xiàn)非特異性凝集,導(dǎo)致難以判定結(jié)果。吳平等通過單抗致敏的綿羊紅細(xì)胞建立的RIHA試驗(yàn)來檢測(cè)豬偽狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV),結(jié)果與血清中和試驗(yàn)(SN)的符合率為94.4%,并認(rèn)為RIHA可作為一種PRV的常規(guī)診斷技術(shù)。應(yīng)用豬輪狀病毒(Rotavirus,RV)IgG,致敏經(jīng)雙醛一次固定的綿羊紅細(xì)胞,可直接檢查樣品中的RV。何孔旺等認(rèn)為RIHA試驗(yàn)?zāi)茉?.5~2 h內(nèi)直接從糞便樣品中檢測(cè)出RV抗原。應(yīng)用RIHA試驗(yàn)檢側(cè)日本腦炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV),對(duì)感染鼠的腦檢測(cè)敏感性可達(dá)1:1 000以上,具有較高的特異性和檢出率,可在3 h內(nèi)得到結(jié)果。黃志鑫等采集大約、長(zhǎng)白、杜洛克和漢普夏等品種的豬血清樣品87份,應(yīng)用RIHA試驗(yàn)檢測(cè)豬源乙型肝炎病毒抗原(HBsAg),結(jié)果檢出陽性3份,陽性率為3.4%,具有較好的特異性和敏感性。

1.2羊病

國(guó)內(nèi)外已有研究人員成功建立了檢測(cè)山羊痘病毒(Coatpoxvirus,GPV)的RIHA方法,其不僅可以檢測(cè)組織病料中的GPV,而且還可以檢測(cè)感染細(xì)胞培養(yǎng)物中的GPV。用致敏的綿羊紅細(xì)胞可以診斷山羊痘,其中綿羊紅細(xì)胞的致敏方法有多種。Rao等[2]應(yīng)用戊二醛或丹寧酸進(jìn)行綿羊紅細(xì)胞致敏試驗(yàn),結(jié)果在綿羊痘的診斷中取得較好的效果。王開功等[3]、陳伯祥等[4]以兔抗山羊痘病毒IgG致敏綿羊紅細(xì)胞來檢測(cè)GPV抗原,并在貴州省疫區(qū)進(jìn)行了現(xiàn)場(chǎng)山羊痘待檢抗原檢測(cè),結(jié)果顯示RIHA方法較瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)(AGP)更敏感,表明其建立的方法可用于山羊痘的診斷和流行病學(xué)檢測(cè),是一種靈敏、操作簡(jiǎn)單、快速的檢測(cè)方法。陳燕軍用RIHA試驗(yàn)對(duì)羊傳染性膿皰病毒(Contagious ecthyma virus,CEV)進(jìn)行了研究,證實(shí)了該方法的可行性和特異性。

1.3兔病

孫智鋒等將抗兔出血癥病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV)的 AA8-1和CG4-1兩株單抗分別致敏雙醛化人紅細(xì)胞,混合后建立了單抗反向間接血凝(McAb-RIHA)方法。其敏感性較常規(guī)血凝試驗(yàn)(HA)高256倍,最小檢出量為0.214 ng/mL。此法在感染兔的心、肝、脾、肺、骨髓、血液等組織中的RHDV檢出率均為100%;在脊髓、淋巴結(jié)、肌肉等組織中的檢出率分別為62.5%、58.3%和37.5%。HA的檢出率除在肝中為100%外,其余均低于McAb-RIHA。該方法不能檢出脊髓、淋巴結(jié)和肌肉樣品中的病毒抗原。

1.4禽病

趙新柳應(yīng)用RIHA檢測(cè)雞傳染性支氣管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)。結(jié)果表明:用純度過高的抗原制備的高免血清致敏紅細(xì)胞后,檢測(cè)IBV的敏感度反而下降;而用聚乙二醇(PEG)將病料濃縮后,IBV檢出率明顯提高。畢玉霞[5]認(rèn)為RIHA可用于檢測(cè)IBV抗原,但可靠性不及SN。樊曉京等[6]應(yīng)用反向間接血凝抑制試驗(yàn)(RPHI)檢測(cè)雞傳染性法氏囊?。↖nfectious Bursal Disease,IBD)血清抗體,得到了滿意的效果。用RPHI和AGP兩種方法同時(shí)測(cè)定67份雞血清樣品,其中用AGP檢出22份陽性,檢出率為32.8%;用RPHI檢出62份陽性,檢出率為92.5%。在用AGP檢出的22份陽性血清中,用RPHI亦均檢測(cè)為陽性;而AGP檢測(cè)陰性的45份血清中,用RPHI卻檢出40份陽性。因此RPHI的檢出率比AGP高約60%。Deng等的研究報(bào)道證實(shí),用RIHA法檢測(cè)鴨瘟病毒(Duck Plague Virus),3 h后可判讀結(jié)果。該方法操作簡(jiǎn)便,不需昂貴的設(shè)備試劑,致敏細(xì)胞可長(zhǎng)期保存,只是敏感性較低,不適合少量DPV檢測(cè)。對(duì)于DPV的定性檢測(cè)來說,當(dāng)感染病鴨大量排毒而使送檢組織中存在大量病毒時(shí),RIHA方法足夠敏感,具有實(shí)用價(jià)值。徐為燕等應(yīng)用RIHA檢測(cè)鵝胚尿囊液中的鵝細(xì)小病毒(Goose parvovirus,GPV),郭玉璞等對(duì)此法做了進(jìn)一步完善。孫懷昌等將用純抗病毒單抗IgG致敏鵝或綿羊紅細(xì)胞建立了RIHA試驗(yàn),并對(duì)提純抗GPV抗原進(jìn)行了檢測(cè),結(jié)果顯示最低檢出濃度分別為34 ng/mL和26 ng/mL;在試驗(yàn)感染鵝胚尿囊液、發(fā)病雛鵝組織及糞便中的檢出率分別為100%(10/10)、81%(27/33)和91%(21/23)。結(jié)果還顯示,該方法可對(duì)番鴨細(xì)小病毒(MDPV)、雞新城疫病毒(NDV)、豬細(xì)小病毒(PPV)及犬細(xì)小病毒(CPV)進(jìn)行鑒別診斷。該方法相對(duì)簡(jiǎn)單,適用于大批量檢測(cè)GPV感染樣品。

1.5犬病

丁壯等應(yīng)用RIHA檢測(cè)犬血清,發(fā)現(xiàn)乙肝表面抗原(HBsAg)陽性率為14.67%(11/75),再用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)復(fù)檢,結(jié)果兩者的陽性符合率高達(dá)92%,陰性符合率為100%。該研究對(duì)2 431份軍犬血清進(jìn)行了流行病學(xué)調(diào)查,發(fā)現(xiàn)RIHA和ELISA的HBsAg陽性符合率為89.2%,陽性率為6.64%(157/2431)。

2 動(dòng)物細(xì)菌病

2.1鼠疫

鼠疫(Pestis)是嚙齒動(dòng)物和蚤把鼠疫桿菌(Yersinia pestis)傳給人和動(dòng)物的一種特殊的人獸共患病。王祖鄖等[7]對(duì)比鼠疫RIHA與鼠疫細(xì)菌培養(yǎng)兩種方法的檢菌結(jié)果,發(fā)現(xiàn)動(dòng)物和人被鼠疫桿菌感染后,鼠疫RIHA的陽性率(100%)明顯高于細(xì)菌培養(yǎng)(87%);對(duì)腐敗材料中鼠疫菌的檢測(cè),RIHA診斷效果明顯優(yōu)越于細(xì)菌培養(yǎng),其在細(xì)菌培養(yǎng)陰性的情況下,仍能檢出鼠疫桿菌抗原。RIHA在鼠疫診斷中,具有敏感、簡(jiǎn)便和快速的特點(diǎn),有助于及時(shí)確定疫源的存在和對(duì)疫情的判定,在實(shí)際工作中便于應(yīng)用和推廣,有望成為鼠疫實(shí)驗(yàn)室診斷標(biāo)準(zhǔn)之一。李存香等[8]同時(shí)用膠體金免疫層析法(GICA)、RIHA和細(xì)菌分離培養(yǎng)法平行檢測(cè)6株疑似鼠疫樣本,結(jié)果均為陽性。RIHA檢測(cè)只能做追溯診斷或提供間接診斷依據(jù)。它可檢查活菌、死菌,以及腐敗材料中的細(xì)菌,甚至在腐敗1年后的材料中仍可獲得陽性結(jié)果,對(duì)判定鼠疫流行和追溯疫源有一定意義。用該方法判定結(jié)果最短需2 h,還需要有一定的技術(shù)要求,否則容易出現(xiàn)非特異性凝集。

2.2細(xì)菌毒素

RIHA法能夠檢測(cè)出樣品中微量的金黃色葡萄球菌腸毒素,而不需要濃縮樣品浸液。該技術(shù)是先將金黃色葡萄球菌各型腸毒素抗血清通過化學(xué)試劑吸附或偶聯(lián)于綿羊、雞和人的紅血球表面,然后再加入被檢的含有相應(yīng)腸毒素的標(biāo)本,出現(xiàn)血細(xì)胞凝集即為陽性。該試驗(yàn)簡(jiǎn)便、快速,檢出靈敏度高,可達(dá)1 ng/mL,只需1~3 h即可判定結(jié)果。楊連華等[9]應(yīng)用RIHA技術(shù)檢測(cè)金黃色葡萄球菌腸毒素A(SEA)的檢測(cè)限為10.4 ng/mL,金黃色葡萄球菌腸毒素C(SEC)的檢測(cè)限為12.0 ng/mL。但該方法所用致敏紅細(xì)胞抗原或抗體的純度要高,且在檢測(cè)中的人為干擾因素較多,因此只能作為一種初步的定性檢測(cè)方法。袁萬哲等[10]利用黏附素單因子血清IgG致敏綿羊紅細(xì)胞,建立了定量產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌黏附素抗原的RIHA試驗(yàn)。經(jīng)交叉試驗(yàn)、抑制試驗(yàn)和敏感性試驗(yàn),證實(shí)該試驗(yàn)具有很高的特異性和敏感性,可用于生物制品中黏附素含量的定量。

王開功等[11]采用兔抗魏氏梭菌α-毒素IgG致敏馬紅細(xì)胞,建立了RIHA試驗(yàn)。該診斷試劑與魏氏梭菌標(biāo)準(zhǔn)株的培養(yǎng)上清液發(fā)生特異的凝集反應(yīng),在PBS緩沖液中不自凝,與其他致病菌培養(yǎng)上清無交叉反應(yīng)。對(duì)現(xiàn)場(chǎng)分離樣品的檢測(cè)結(jié)果表明,該方法與其生化試驗(yàn)結(jié)果的符合率為97.2%,可用于魏氏梭菌病的快速臨床診斷。馬鶴松等為快速特異診斷水貂肉毒梭菌中毒,進(jìn)行了水貂實(shí)驗(yàn)性肉毒中毒的RIHA診斷試驗(yàn)。RIHA是較理想的診斷水貂C型肉毒中毒的手段,具有快速、靈敏、特異的優(yōu)點(diǎn),不僅可在致死貂尸體上取料確診,還可將有臨床癥狀表現(xiàn)的未致死病貂處死后取料診斷。鄭慶端等應(yīng)用RIHA試驗(yàn),對(duì)人工感染豬丹毒發(fā)病豬進(jìn)行檢測(cè),獲得較好的結(jié)果。其中,耳血的檢出率為85.7 %,發(fā)病死亡豬脾臟的檢查出率為100%。

3 動(dòng)物寄生蟲病

3.1弓形蟲病

使用弓形蟲蟲體抗原或者排泄分泌抗原作為診斷抗原檢測(cè)血清抗體時(shí),由于抗原的復(fù)雜性和非特異性,檢測(cè)結(jié)果往往出現(xiàn)假陽性。為了避免這一現(xiàn)象出現(xiàn),研究者通過制備弓形蟲特異性單克隆抗體作為檢測(cè)抗體,建立了檢測(cè)血液中循環(huán)抗原(CAg)的McAb-RIHA試驗(yàn)。同時(shí),對(duì)于有免疫缺陷的弓形蟲感染者來說,循環(huán)抗原檢測(cè)是唯一有效的血清學(xué)檢測(cè)手段。郭志剛等利用單克隆抗體建立了McAb-RIHA試驗(yàn),它檢測(cè)出弓形蟲速殖子可溶性抗原的最低含量為5 μg/mL,也可檢測(cè)到弓形蟲QHO株速殖子感染綿羊和家兔2~6 d后血清中的CAg。杜重波等研制的抗弓形蟲McAb-RIHA診斷試劑,可檢測(cè)血清弓形蟲CAg,具有診斷弓形蟲急性或活動(dòng)性感染的價(jià)值,可用于弓形蟲病的早期診斷、流產(chǎn)病因?qū)W調(diào)查和流行病學(xué)調(diào)查。鞏薇等[12]認(rèn)為現(xiàn)有的RIHA診斷試劑盒主要用于大家畜的診斷,對(duì)小鼠的效果不太好,因此在今后對(duì)嚙齒類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的弓形蟲檢測(cè)時(shí)應(yīng)考慮到這一問題。

3.2旋毛蟲病

黃美芳等報(bào)道應(yīng)用McAb-RIHA檢測(cè)豬旋毛蟲病的CAg取得了成功。試測(cè)的17例旋毛蟲病人中,9例為陽性,應(yīng)用McAb-RIHA檢測(cè)CAg與病原學(xué)檢查的符合率為52.9%。

3.3血吸蟲病

李劍瑛等[13]采用McAb-RIHA雙盲法測(cè)定正常人與各種類型血吸蟲病人血清,同時(shí)進(jìn)行交叉反應(yīng)與重復(fù)性試驗(yàn)。結(jié)果顯示:用McAb-RIHA檢測(cè)正常人血清的假陽性率為2.17%;對(duì)急性、慢性及晚期血吸蟲病人檢測(cè)的陽性率分別為99.39%、84.00%、28.57%,與糞檢陽性病人的陽性符合率為84.00%。急性血吸蟲病人體內(nèi)循環(huán)抗原含量高于慢性血吸蟲病人及晚期血吸蟲病人,反應(yīng)滴度的平均幾何數(shù)均為慢性血吸蟲病人的13.3倍、晚期血吸蟲病人的36.4倍;而不同感染度的慢性血吸蟲病人體內(nèi)循環(huán)抗原的滴度與其糞中的蟲卵數(shù)量無明顯關(guān)系。這證明McAb-RIHA檢測(cè)日本血吸蟲循環(huán)抗原有較好的敏感性和特異性。

3.4伊氏錐蟲病

葉萬祥等在建立的檢側(cè)伊氏錐蟲CAg的McAb-RIHA基礎(chǔ)上,又建立了檢側(cè)伊氏錐蟲抗體的單克隆抗體-反向間接血凝抑制試臉(McAb-RIHI)。用該法檢查實(shí)驗(yàn)感染家兔的系列血清和疫區(qū)水牛血清,并與目前常規(guī)使用的間接血凝(IHA)比較,結(jié)果較滿意。

3.5豬囊尾蚴病

李瑩等[14]應(yīng)用RIHA試驗(yàn)檢測(cè)豬囊尾蚴循環(huán)抗原,探討檢出量與蟲體密度及發(fā)育程度關(guān)系,為豬囊尾蚴病的診斷研究提供依據(jù)。張達(dá)琳等[15]用鉻離子-單克隆抗體(Cr+++-McAb)鞣酸法致敏綿羊紅細(xì)胞做RIHA試驗(yàn),檢測(cè)囊蟲病患者血清中的CAg。該試驗(yàn)敏感性較好,可能是由于Cr+++和鞣酸的作用,使McAb更易吸附在血球上,使得該方法簡(jiǎn)便易行,快速穩(wěn)定,在囊蟲病的診斷和療效考核方面有一定的應(yīng)用價(jià)值。

3.6包蟲病

李豫青等[16]應(yīng)用RIHA試驗(yàn)測(cè)定包蟲病患者血清中總IgE水平取得較好結(jié)果,可為包蟲病的臨床診斷和療效考核提供依據(jù)。

4 前景與展望

RIHA試驗(yàn)既可用于檢測(cè)病原體的可溶性抗原,也可用于檢測(cè)各種蛋白質(zhì)成分。最常用的紅細(xì)胞為綿羊、家兔、雞的紅細(xì)胞及O凝型人紅細(xì)胞。新鮮紅細(xì)胞能吸附多糖類抗原,但吸附蛋白質(zhì)抗原或抗體的能力較差。致敏的新鮮紅細(xì)胞保存時(shí)間短,且易變脆、溶血和污染,只能使用2~3 d。為此,一般在致敏前先將紅細(xì)胞醛化。醛化紅細(xì)胞具有較強(qiáng)的吸附蛋白質(zhì)抗原或抗體的能力,可長(zhǎng)期保存而不溶血。RIHA所需設(shè)備簡(jiǎn)單,操作簡(jiǎn)便,只需在V型96孔微量反應(yīng)板上進(jìn)行,結(jié)果易判定,特異性和重復(fù)性良好,有很好的實(shí)用價(jià)值,在3 h內(nèi)即可做出診斷。由于RIHA具有特異性強(qiáng)、靈敏度高和便于操作等優(yōu)點(diǎn),適用于臨床診斷和對(duì)少量樣品的檢測(cè),易于在動(dòng)物疾病診斷、生物制品研制和廣大基層養(yǎng)殖中推廣應(yīng)用,具有廣泛的應(yīng)用前景。

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(責(zé)任編輯:朱迪國(guó))

Progress on the Application of Reverse Indirect Hemagglutination Test in the Diagnosis of Animal Diseases

Zhuang Jinqiu1,2,Mei Jianguo1,2,Wang Yan1,Xie Jinwen1,Mo Ling1,Shen Zhiqiang1
(1. Binzhou Animal Science & Veterinary Medicine Academy,Binzhou,Shandong 256600;2. Binzhou Bio-carrier Biotechnology Co.,Ltd.,Binzhou,Shandong 256600)

Abstract:Reverse indirect hemagglutination test(RIHA)is a simple and practical laboratory testing technology,which has been widely used in the field of human and animal diseases and clinical detection. The progress on the application of RIHA in the diagnosis of animal virus diseases,bacterial diseases and parasitic diseases was summarized, to provide reference for clinical veterinary science and technology workers.

Key words:RIHA;diagnosis;application

中圖分類號(hào):851.3

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

文章編號(hào):1005-944X(2016)06-0055-05

DOI:10.3969/j.issn.1005-944X.2016.06.017

基金項(xiàng)目:山東省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(2015GSF121027);山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系毛皮動(dòng)物創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(SDAIT-18-011-15)

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