焦艷梅，劉翠娥，陳威巍，福軍亮，孫麗君，吳 昊，王福生

·專題論著·

HAART后血液及精液中HIV水平的比較研究

焦艷梅，劉翠娥，陳威巍，福軍亮，孫麗君，吳 昊，王福生

目的高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療（highly active antiretroviral therapy, HAART）6個月后，對HIV感染者血漿及精漿中的HIV RNA水平進行比較研究，對外周血單個核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell, PBMC）及精液細(xì)胞中的HIV DNA水平進行比較研究。方法收集HAART 6個月后血液中HIV RNA下降到檢測不出的16例患者的精液和血液樣本，采用實時定量PCR的方法檢測其血漿及精漿中的HIV RNA水平，PBMC及精液細(xì)胞中的HIV DNA水平。結(jié)果16例患者的精漿中有15例可檢測到HIV RNA，在PBMC及精液細(xì)胞中均可檢測到HIV DNA，且二者HIV DNA水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論HAART 6個月后，大多數(shù)患者精液中仍可檢測到HIV RNA及HIV DNA。

高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療；精液；HIV；病毒載量

性傳播HIV的風(fēng)險與生殖器中的HIV RNA水平密切相關(guān)[1-2]。高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療（highly active antiretroviral therapy, HAART）可大大降低其傳播風(fēng)險[3-4]，國外的一些研究認(rèn)為約15％的患者在HAART 6個月后，血液中的HIV已經(jīng)降低到檢測不到的水平，精液中仍可檢測到HIV[5-6]。在中國，性傳播已成為目前AIDS傳播的主要途徑，HIV在中國男男同性人群中傳播率高于其他國家[7]。且研究發(fā)現(xiàn)不同人種感染及感染不同的HIV亞型，精液中HIV量存在差異[8-9]。目前關(guān)于HAART后中國HIV感染者精液中HIV的水平及特性報道較少。

精液是精液細(xì)胞和精漿的復(fù)雜混合物。HIV感染患者精漿中可檢測到HIV RNA，而HIV DNA存在于精液細(xì)胞中[10]。精液中游離的HIV有可能來自精液中感染的白細(xì)胞。HIV DNA主要有三種形式：線性非整合形式、環(huán)狀非整合形式和整合的形式。環(huán)狀的HIV DNA可進一步分為1個長末端重復(fù)序列（1-long terminal repeats, 1-LTR）和2個長末端重復(fù)序列（2-LTR）兩種形式。2-LTR HIV DNA的半衰期較短，代表正在復(fù)制的病毒。而整合的HIV DNA的半衰期較長，是潛伏HIV的重要組成部分。目前對精液中各種HIV DNA的水平報道也較少。

本研究中，入組了16例有效HAART 6個月后的中國HIV感染者，比較其血液和精液中的HIV RNA和HIV DNA水平。

1 材料與方法

1.1 對象 入組16例接受HAART 6個月的HIV感染者，均為男性。患者的平均年齡為32.8歲，治療前外周血中CD4+T淋巴細(xì)胞平均計數(shù)為268個/μl，治療6個月后外周血中CD4+T淋巴細(xì)胞平均計數(shù)為418個/μl。其中10例感染的HIV亞型為B亞型，另外6例感染的為C亞型?；颊叩囊话闱闆r見表1。收集患者同一時間點的血液和精液標(biāo)本，并于4 h內(nèi)處理。本研究方案經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有受試者均于采血前簽署知情同意書。

表1 HIV感染者一般情況Table 1 General data of patients with HIV

1.2 標(biāo)本的處理 EDTA抗凝血在室溫下1200×g離心5 min，吸取血漿，然后Ficoll密度梯度離心法分離PBMC。精液標(biāo)本在冰上放置30 min后，800～1000×g離心10 min分離精液細(xì)胞和精漿。

1.3 血漿及精漿中的HIV RNA檢測 采用德國羅氏公司的Cobas TaqMan HIV-1 HPS試劑，按照試劑盒說明，提取RNA及逆轉(zhuǎn)錄后，用實時定量PCR方法進行分析。

1.4 總的、整合型及2-LTR環(huán)狀HIV DNA定量分析 所用方法參照文獻(xiàn)[11]。針對總的HIV DNA定量引物：利用LTR及gag中一對引物，在LTR中設(shè)計探針，檢測總HIV DNA。針對整合型HIV DNA定量引物：一個引物是針對人類基因組的特異性的序列Alu，另外一個引物是針對HIV LTR特異的序列。針對2-LTR環(huán)狀HIV DNA定量引物：2-LTR環(huán)狀病毒DNA中，2個LTR連接點的基因具有特異的序列，針對此特異的序列設(shè)計引物。應(yīng)用Qiagen DNA提取試劑盒提取患者PBMC或精液細(xì)胞的DNA，25.0 μl實時定量PCR的反應(yīng)體系包括2.5 μl的DNA模板，12.5 μl的PCR反應(yīng)體系混合物，1 μmol的引物及0.2 μmol的探針。實時定量PCR反應(yīng)條件為：95 ℃ 10 min，然后95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40個循環(huán)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 11.5統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析。計量資料分別服從正態(tài)分布，2組間比較采用成組t檢驗（組間方差齊）。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 患者血漿、精漿中HIV RNA水平 有效HAART 6個月后，16例患者血漿中的病毒載量均降低到檢測不到的水平。而其中15例患者在HAART 6個月后，精漿中HIV RNA仍可檢測到。見表2。

表2 HIV RNA水平在血漿和精漿中的比較Table 2 Comparision of HIV RNA in blood plasma and seminal plasma

2.2 患者PBMC及精細(xì)胞中HIV DNA水平 有效HAART 6個月后，PBMC及精液細(xì)胞中均可檢測到總的HIV DNA（均數(shù)分別為143.17 copies /106個、230.90 copies /106個），整合的HIV DNA（均數(shù)分別為71.60 copies/106個、98.03 copies/106個）及2-LTR環(huán)狀的HIV DNA（均數(shù)分別為16.21 copies/106個、7.44 copies/106個）。且PBMC與精液細(xì)胞中總的（圖1A）、整合的（圖1B）及2-LTR環(huán)狀的（圖1C）HIV DNA差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見圖1。

圖1 HAART 6個月后總的、整合的及2-LTR環(huán)狀HIV DNA水平在PBMC及精液細(xì)胞中的比較A. PBMC及精液細(xì)胞中總的HIV DNA的比較； B. PBMC及精液細(xì)胞中整合的HIV DNA的比較；C. PBMC及精液細(xì)胞中2-LTR環(huán)狀HIV DNA的比較Figure 1 Comparision of total, integrated and 2-LTR circular HIV DNA in PBMCs and semen cells

3 討 論

全球范圍內(nèi)，性傳播尤其是男男同性傳播已成為HIV傳播的最主要的途徑。男男同性傳播HIV的風(fēng)險與精液中HIV的水平密切相關(guān)。不同人種、不同的HIV亞型及不同用藥方案，患者精液中的HIV載量都會存在差異[8-9]。關(guān)于中國HIV患者HAART 6個月后，血漿中HIV RNA降低到檢測不出時精液中HIV存在情況的報道較少。本研究中，16例患者在HAART 6個月后，血漿中均檢測不到HIV RNA的情況下，其中15例患者精漿中均仍可檢測到HIV RNA。這一比例遠(yuǎn)高于國外的報道。國外報道約7％～15％的HIV感染者，在血漿中檢測不到病毒載量的情況下，精漿中仍可檢測到HIV RNA[5-6,12]。本研究結(jié)果與國外報道不一致，可能與患者所應(yīng)用的藥物不同，種族差異及感染的HIV亞型不同等有關(guān)。有報道稱依非韋侖（efavirenz, EFV）精液穿透性差，導(dǎo)致該藥物在精液中的濃度較低，從而使該藥物在精液中抗HIV的作用減弱，是精液中HIV載量較高的原因之一[13]。本研究中患者均使用EFV，這可能是入組患者精液中HIV RNA水平較高的原因之一。另外，入組患者與既往報道患者種族不同，感染的HIV亞型也不同，這些也可能是導(dǎo)致精液中HIV量差異的原因。本實驗中檢測到的精漿中HIV RNA的水平均較高，確切原因須要進一步研究。HAART 6個月后，精液中的HIV RNA仍可檢測到，并不能說明HAART對精液中的HIV無效，而是降低的程度相對弱。精液中HIV須要達(dá)到一定的水平才能夠成功傳播HIV，在HAART 6個月后，精液中HIV RNA雖存在但是否能夠傳播HIV，是否是中國男男同性戀人群HIV傳播率較高的原因值得進一步研究。

再者，本研究發(fā)現(xiàn)在精液細(xì)胞中也可檢測到HIV DNA。精液的成分復(fù)雜，由睪丸、附睪、前列腺、精囊腺和尿道球腺等分泌物組成。目前已在男性生殖道中檢測到感染HIV的T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，一般認(rèn)為HIV DNA主要存在這些T細(xì)胞及巨噬細(xì)胞中。而對于HIV是否感染精子尚存在爭議[14-15]。有研究認(rèn)為精子對HIV感染不敏感。但到目前為止，尚無明確的證據(jù)證實這些HIV DNA到底存在于哪些細(xì)胞。

總之，我們對HAART 6個月后精液及血液中的HIV RNA及HIV DNA進行對比研究，發(fā)現(xiàn)血漿中HIV RNA降低到檢測不到的情況下，精漿中仍可檢測到HIV RNA。而PBMC及精液細(xì)胞中均可檢測到HIV DNA，并且HIV DNA的水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義。其機制須要進一步研究，并要進一步確定HAART 6個月后精液中HIV的水平是否足以導(dǎo)致性伴感染。

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（2016-11-13收稿 2016-12-15修回）

（責(zé)任編委 王永怡 本文編輯 閆晶晶）

Comparsion of HIV viral load in blood and semen after HAART

JIAO Yan-mei*, LIU Cui-e, CHEN Wei-wei, FU Jun-liang, SUN Li-jun, WU Hao, WANG Fu-sheng*
Research and Treatment Center of Infectious Diseases, 302 Military Hospital of China, Beijing 100039, China

ObjectiveAfter highly active antiretroviral therapy (HAART) 6 months, a comparative study of HIV RNA levels in plasma and seminal plasma of HIV patients was made. Also a comparative study of HIV DNA levels in peripheral blood mononuclear cells (PBMC) and seminal plasma of HIV patients was made.MethodsHAART 6 months after HIV in blood RNA decreased to undetectable in 16 patients of semen and blood samples were detected by real-time quantitative PCR in plasma and seminal plasma HIV levels of RNA, PBMC and DNA levels in sperm cell HIV.ResultsHIV RNA was detected in 15 cases of seminal plasma in 16 patients, and HIV DNA was detected in PBMC and sperm cells, and there was no significant difference between the two groups.ConclusionsHIV RNA and HIV DNA could be detected in most of the patients after 6 months of HAART.

HAART; semen; HIV; viral load

R512.91

A

1007-8134(2016)06-0333-04

10.3969/j.issn.1007-8134.2016.06.004

國家科技重大專項（2015ZX10004801-002-002）；國家自然科學(xué)基金（81471577，81572462）；北京市自然科學(xué)基金（152072）；北京市科技計劃（D141100000314004）

100039 北京，解放軍第三〇二醫(yī)院感染性疾病診療與研究中心（焦艷梅、陳威巍、福軍亮、王福生）；100069，首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院感染中心（劉翠娥、孫麗君、吳昊）

王福生，E-mail: fswang302@163.com；焦艷梅，E-mail: jiaoyanmei@sina.com

*Corresponding author. WANG Fu-sheng, E-mail: fswang302@163.com; JIAO Yan-mei, E-mail: jiaoyanmei@sina.com