徐亞文，李健健，董興齊

HIV-1基因變異與耐藥之間的關(guān)系研究現(xiàn)況

徐亞文，李健健，董興齊

HIV-1以其高突變率、高重組率和高復(fù)制率的生物學(xué)特性，使得患者體內(nèi)的病毒成為復(fù)雜的準種，給艾滋病的診斷、治療和疫苗的研制帶來眾多難題。高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒聯(lián)合療法的使用降低了艾滋病患者的病死率，然而在高速復(fù)制、高度遺傳變異和藥物選擇壓力的作用下，日益嚴重的耐藥問題削弱了其抑制病毒復(fù)制的作用，降低了抗病毒治療的效果。本文綜述了HIV-1常見的基因變異特點與耐藥之間關(guān)系的研究進展，以期對臨床制訂抗HIV-1藥物方案、發(fā)展新的抗HIV-1策略帶來指導(dǎo)意義。

HIV-1；基因變異；耐藥

HIV是艾滋病的病原體。至今，全球的HIV感染者已超過6000萬。截至2015年5月底，我國報告現(xiàn)存活的艾滋病感染者和患者已達561 807例，死亡173 180萬例[1]。雖然，近十年艾滋病流行呈下降趨勢，特別是包括美國、加拿大和智利等國可能已經(jīng)消除了HIV的母嬰傳播，但是艾滋病依舊是影響全球健康的重大公共衛(wèi)生問題之一。HIV可以分為HIV-1型和HIV-2型兩類，全球流行的主要為HIV-1型，HIV-2型流行于非洲的局部地區(qū)。HIV-1型也是我國主要的流行毒株，本文就HIV-1基因變異的特點及其與耐藥之間的關(guān)系研究現(xiàn)狀綜述如下。

1 HIV-1基因的分子特性及其高度變異的生物學(xué)特性

1.1 HIV-1基因的分子特性 HIV-1屬于RNA逆轉(zhuǎn)錄病毒科中的慢性病毒亞科，其成熟的病毒粒子含2個基因組，每個基因組全長約9.8 kb，包括3個結(jié)構(gòu)基因、6個調(diào)節(jié)基因和兩側(cè)長末端重復(fù)序列（long terminal repeat, LTR）。HIV-1的基因排列為LTR-gag-pol-vif-vpr-tat-rev-vpu-env-nef-LTR，其中vif、vpr、tat、rev、vpu、nef為調(diào)節(jié)基因，pol基因編碼病毒復(fù)制所需要的蛋白酶（p31、p51、p66），gag和env基因分別編碼病毒的核心蛋白（p17、p24、p55）和病毒包膜蛋白（gp41、gp120、gp160）[2-3]。HIV-1基因組具有高度的變異性，其變異包括核苷酸的替換（轉(zhuǎn)換和顛換）、缺失、插入和重組等，且變異具有不均一性。

1.2 HIV-1高度變異的生物學(xué)特性 HIV-1是具有高突變率、高重組率和高復(fù)制率的逆轉(zhuǎn)錄病毒。逆轉(zhuǎn)錄病毒的共同特征是病毒RNA基因組要逆轉(zhuǎn)錄為DNA分子。HIV有2條相同的正鏈RNA在5′端通過氫鍵互相連接在一起形成二聚體，通過逆轉(zhuǎn)錄酶（reversetranscriptase, RT）逆轉(zhuǎn)錄后生成cDNA，與人體細胞基因組結(jié)合實現(xiàn)病毒的復(fù)制。由于HIV-1在復(fù)制過程中RT的忠實性較差，缺乏3′→5′端外切核酸的校讀功能，基因轉(zhuǎn)錄在人體免疫或抗HIV-1藥物壓力下容易產(chǎn)生錯亂導(dǎo)致基因突變。 HIV-1基因組由將近10 000個核苷酸組成，每天至少有104～105個子代HIV-1出現(xiàn)位點的突變，同時在DNA合成過程中，幾乎基因組的全部區(qū)域都可能出現(xiàn)重組。因而在HIV-1感染的各個階段，HIV-1的持續(xù)高速復(fù)制及復(fù)制過程中的高突變率和重組率使得患者體內(nèi)的病毒成為復(fù)雜的準種[1,4]，給艾滋病的診斷、治療和疫苗的研制帶來眾多難題。

2 HIV-1基因變異與疾病之間的關(guān)系

2.1 HIV-1 pol基因區(qū)變異與疾病之間的關(guān)系 pol基因是HIV-1中最保守的區(qū)域，編碼病毒的蛋白酶（protease, PR）、RT及整合酶（integrase, IN），是目前抗HIV治療的主要靶點。當(dāng)強大的藥物壓力使毒株的pol基因發(fā)生突變時，大量耐藥株出現(xiàn)。臨床試驗表明由于突變，大約30％的HIV-1感染者不能有效激活抗逆轉(zhuǎn)錄藥物的活性[5]?；虻亩鄻有阅軌蛴绊懲N抗病毒藥物交叉耐藥的程度，導(dǎo)致病毒學(xué)的治療失敗，進而決定臨床治療效果、疾病進展及免疫學(xué)效應(yīng)。研究表明：運用一線藥物治療失敗的患者，調(diào)整使用相應(yīng)類別二線藥物時更有可能產(chǎn)生交叉耐藥[6]，提示一旦出現(xiàn)耐藥問題，調(diào)整用藥方案后應(yīng)更加嚴密觀察藥物的有效性，及時發(fā)現(xiàn)交叉耐藥的發(fā)生，以減緩患者疾病進程，降低病死率。另外，在抗病毒療程方面，抗病毒治療早期基因突變最頻繁，故應(yīng)注意在治療早期對患者進行服藥依從性教育及耐藥監(jiān)測[7]。

目前，已經(jīng)確定的與艾滋病抗病毒藥物耐藥有關(guān)的HIV基因突變有200多個。其中RT區(qū)中與核苷類反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑（nucleoside analogue reverse transcriptase inhibitors, NRTIs）耐藥相關(guān)的突變包含核苷類似物的耐藥相關(guān)突變、胸苷相關(guān)突變、非核苷類似物的耐藥相關(guān)突變、多核苷耐藥性突變和附屬突變共5類50多個；與非核苷類反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑（non-nucleoside analogue reverse transcriptase inhibitors, NNRTIs）耐藥相關(guān)的突變包含主要的原發(fā)突變、主要的繼發(fā)突變、非多態(tài)性次要突變和多態(tài)性附屬突變共4類40多個。PR區(qū)中與PR抑制劑有關(guān)的突變包含主要突變、附屬突變、PR裂開部位突變共3類60多個；與IN抑制劑耐藥相關(guān)的IN基因突變共30多個[6,8-9]。主要突變位點與藥物治療的關(guān)系詳見表1。

表1 主要耐藥基因相關(guān)突變Table 1 The correlating mutations of main resistance genes

小部分HIV-1感染者在接受抗病毒治療以后，在機體免疫壓力和藥物壓力的作用下，可出現(xiàn)表中的突變點，導(dǎo)致該種類藥物臨床治療失敗。而大部分患者在接受治療以后，其耐藥基因卻沒有發(fā)生改變，這與患者的依從性以及毒株特點存在很大關(guān)系。在耐藥基因檢測應(yīng)用于臨床的實際操作中，很多位點突變要結(jié)合實驗操作本身，有的突變并不是本身體內(nèi)病毒發(fā)生的突變，而是在體外實驗過程中的誤差導(dǎo)致的錯誤突變，結(jié)果造成最終的耐藥情況誤差，以致于臨床用藥方案使用錯誤。因此，雖然我們已經(jīng)將HIV-1耐藥基因型檢測應(yīng)用于臨床疾病，但是在實際操作過程中，還需要根據(jù)該患者的其他表征結(jié)合基因型耐藥結(jié)果來判斷是否應(yīng)當(dāng)更換藥物，基因型畢竟不是表型，基因變異和表型變異之間還是存在一定差異，要靈活應(yīng)用耐藥基因型檢測。

2.2 HIV-1 gag區(qū)變異與疾病之間的關(guān)系 gag基因編碼蛋白是構(gòu)成病毒顆粒的主要成分，在病毒的組裝、出芽、成熟以及保持病毒的傳染性和病毒結(jié)構(gòu)的完整性中發(fā)揮重要的作用，在成熟HIV病毒顆粒的包裝和病毒顆粒從細胞膜上的釋放等環(huán)節(jié)中也非常重要。Gag蛋白上存在大量的細胞毒性T淋巴細胞（cytotoxic lymphocyte, CTL）表位，在免疫選擇壓力作用下gag的基因序列不斷發(fā)生變異，這種變異在一定程度上反映HIV-1逃避機體免疫壓力的能力及其適應(yīng)度的變化[10]。近年來的一些研究分析了我國HIV-1毒株gag基因區(qū)的變異特征，但這些研究主要通過分析所獲得的序列與早期共享序列在已知表位中的分布情況或根據(jù)基因內(nèi)不同片段的遺傳變異狀況來研究gag基因的變異，而沒有全面分析Gag蛋白中不同氨基酸位點的變異特征。有研究發(fā)現(xiàn)在Gag蛋白全長氨基酸序列中存在10個多態(tài)性增加的氨基酸位點。研究表明， 我國人群中主要的HLA-I類等位基因為HLA-A02、HLA-A11和HLA-A24；HLA-B13、HLA-B15和HLA-B40；HLA-Cw01、HLA-Cw03、HLA-Cw07和HLA-Cw06[11]。通過對Los Alamos HIV免疫數(shù)據(jù)庫搜索已鑒定的CTL表位，發(fā)現(xiàn)其中有8個位點在我國人群主要HLA呈遞的CTL表位內(nèi)，這很可能是在CTL的正向選擇壓力作用下，病毒為逃避宿主體內(nèi)的免疫壓力而發(fā)生有利于病毒進化的突變。剩余第114和第376位點迄今尚無相應(yīng)的CTL表位報道。因此，這2個位點是否存在仍未發(fā)現(xiàn)的新CTL表位有待通過免疫學(xué)實驗證實。另外，該區(qū)段被廣泛用于HIV-1分子流行病學(xué)和HIV-1疫苗的研究中[12]。Gag蛋白第153～172位氨基酸的位置為主要同源區(qū)，該區(qū)段對病毒樣顆粒的形成至關(guān)重要，此區(qū)段的氨基酸變異將影響HIV-1的復(fù)制[13]。研究表明，HLA-B13在HIV-1感染早期可抑制病毒復(fù)制，控制病毒血癥，延遲HIV-1感染后的進展，其部分作用機制是HLA-B13相關(guān)抗原表位逃逸突變?nèi)纾篻ag-K436R、gag-I147L通過降低gag的適應(yīng)度及減弱nef的免疫規(guī)避功能兩種方法以降低HIV-1的產(chǎn)生能力[14]。

2.3 HIV-1 env區(qū)變異與疾病之間的關(guān)系 HIV-1env基因所編碼的前體分子gp160經(jīng)蛋白酶剪切加工后，成為成熟的外膜蛋白gp120和跨膜蛋白gp41，介導(dǎo)病毒入侵靶細胞。其中g(shù)p120是HIV-1基因組中變異率最高的片段，具有5個可變區(qū)（V1～V5）和5個恒定區(qū)（C1～C5），主要參與HIV-1對靶細胞的吸附及病毒從宿主細胞出芽釋放的生物學(xué)過程。研究顯示gp120的變異主要存在于V1～V5區(qū)，其中V3區(qū)氨基酸的改變可影響病毒與細胞的親和性及gp120的抗原性，并與中和抗體的產(chǎn)生有關(guān)[15-16]。若V3環(huán)11和25位同時被精氨酸（R）和谷氨酰胺（Q）所替代，HIV-1將以CXCR4作為輔助受體進入細胞，呈T細胞嗜性，體內(nèi)主要是X4單嗜性病毒；若未被同時取代，則以CCR5作為輔助受體進入細胞，呈巨噬細胞嗜性，體內(nèi)主要是R5單嗜性毒株。當(dāng)HIV-1為T細胞嗜性時，相對巨噬細胞嗜性會加快艾滋病病程發(fā)展，X4毒株的出現(xiàn)伴隨感染由無癥狀轉(zhuǎn)變?yōu)橛邪Y狀，標志著進展為艾滋病癥狀期[17]。HIV-1 gp41分為3個結(jié)構(gòu)功能區(qū)域：膜外區(qū)、跨膜區(qū)和膜內(nèi)區(qū)。膜內(nèi)區(qū)突變、缺失不但可能損害病毒的復(fù)制、感染和致細胞病變能力，而且可以影響gp160的加工及env的裝配和穩(wěn)定性，減弱env的細胞表面內(nèi)化、病毒顆粒脫殼及與基質(zhì)蛋白的相互作用[18]。另外，兩性霉素B甲酯通過抑制病毒的進入及病毒顆粒的產(chǎn)生等方式減緩HIV-1復(fù)制，但是gp41膜內(nèi)區(qū)發(fā)生突變后可以產(chǎn)生新的蛋白酶分裂位點，導(dǎo)致HIV-1對兩性霉素B甲酯產(chǎn)生抗性[19]。

2.4 HIV-1其他調(diào)節(jié)基因變異與疾病之間的關(guān)系 作為HIV-1的調(diào)節(jié)蛋白之一，Vif以細胞依賴方式在新生病毒的組裝、釋放或者成熟階段增加病毒自身的感染性。有研究顯示Vif V7A及F39V取代可能分別與延緩和加速疾病進展有關(guān)，是獨立于APOBEC3G表達水平之外影響疾病進程的病毒學(xué)因素，但尚須深入研究證實[20]。

tat通過轉(zhuǎn)錄反應(yīng)因子與部分細胞因子作用形成蛋白-RNA復(fù)合物，活化轉(zhuǎn)錄啟動因子，加強RNA多聚酶Ⅱ的活性，從而增強病毒的轉(zhuǎn)錄能力。tat的高表達促進病毒的復(fù)制，相反tat基因缺失或突變則可使病毒復(fù)制不完全。Tat區(qū)多個位置的氨基酸變異可以影響病毒的復(fù)制能力，其中50位點K被R/Q取代，41位點K被A取代，28位點K被R/Q取代，22位點C被G取代等基因突變會較大程度的損害病毒的復(fù)制能力，而65位點H被D取代，58位點T被A取代都將增強病毒的復(fù)制能力[21]。

Nef可通過加強病毒顆粒侵襲力、激活CD4+T淋巴細胞及防止受感染細胞凋亡等多種途徑提高HIV的復(fù)制能力，Nef表位缺失可幫助HIV-1逃逸，影響機體針對HIV-1病毒的免疫反應(yīng)[22]。故推測Nef蛋白不同位點的突變將影響HIV-1的各項生物學(xué)特性，如：病毒致病性、復(fù)制能力、免疫細胞激活、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面，從而干預(yù)病毒與宿主間相互作用，影響HIV感染后的疾病進程。

研究顯示，vpr基因參與反轉(zhuǎn)錄過程的保真性調(diào)節(jié)，促進整合前復(fù)合物的核運輸，影響細胞周期過程，誘導(dǎo)細胞凋亡，并對HIV-1長末端重復(fù)序列及宿主基因具有調(diào)節(jié)作用，參與RNA剪接。HIV-1 患者有vpr R85P、Q86G、A89G或E55A變異位點較無變異位點患者而言，CD4+T淋巴細胞計數(shù)值更低，考慮此變異可能與疾病進展迅速相關(guān)[23]。

3 總結(jié)與展望

作為我國艾滋病的重災(zāi)區(qū)，云南省地處西南邊陲，毗鄰越南、老撾、緬甸三個艾滋病高發(fā)國家，艾滋病輸入性病例較多，加之云南省抗病毒治療推行時間早，大大增加了HIV-1基因變異及基因重組的幾率，故云南省涵蓋了我國幾乎所有的基因突變位點及基因型。未來，須進一步做好艾滋病跨境傳播的管理，動態(tài)監(jiān)測HIV-1基因變異特點，準確調(diào)整抗病毒治療方案以減少HIV傳播性耐藥的發(fā)生。與此同時，深入研究了解HIV-1的各個基因段變異的規(guī)律及其與宿主免疫應(yīng)答的特征、產(chǎn)生的功能性變化，分析HIV-1變異與機體免疫系統(tǒng)及不同疾病狀態(tài)之間的關(guān)系，才能發(fā)現(xiàn)新型的抗病毒藥物的靶點以控制病毒的復(fù)制, 指導(dǎo)臨床醫(yī)生為患者做出更好的治療藥物選擇，最大程度避免耐藥發(fā)生，以降低疾病經(jīng)濟負擔(dān)。

[1]中國疾病預(yù)防控制中心性病艾滋病預(yù)防控制中心. 2015年8月全國艾滋病性病疫情及主要防治工作進展［J］. 中國艾滋病性病，2015，21(10):835.

[2]李玉笑，杜耀民，汪傳喜，等. 廣州地區(qū)獻血人群HIV-1 gag基因序列分析［J］. 廣東醫(yī)學(xué)，2012，33(7):926-928.

[3]Li X, Feng Y, Yang Y, et al. Recombinant form (CRFO1-AE/ B) detected among men who have sex with men in Jilin province, China［J］. AIDS Res Hum Retroviruses, 2014, 30(7):701-705.

[4]李彥媚，趙紅心，周海衛(wèi)，等. AIDS患者高效一線抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療失敗后HIV耐藥基因型分析［J］. 中華實驗和臨床感染病雜志（電子版），2013，7(1):82-87.

[5]Hamilton CL, Eyzaguirre LM, Amarakoon II, et al. Analysis of protease and recerse transcriptase genes of HIV for antiretroviral drug resistance in Jamaican adults［J］. AIDS Res Hum Retroviruses, 2012, 28(8):923-927.

[6]楊翕然，楊翠先，楊紹敏，等. 臨滄市2012年高效抗反轉(zhuǎn)錄病毒治療失敗的AIDS患者耐藥基因變異分析［J］. 傳染病信息，2014，27(3):164-166.

[7]華近. 浙江省臺州地區(qū)耐藥HIV-1感染的分子流行病學(xué)研究［D］. 上海：復(fù)旦大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，2014.

[8]Dinesha TR, Gomathi S, Boobalan J, et al. Genotypic HIV-1 drug resistance among patients failing tenofovir-based first-line HAART in South India［J/OL］. AIDS Res Hum Retroviruses, 2016 [2016-11-14]. http://online.liebertpub.com/doi/10.1089/ aid.2016.0110.

[9]Wensing AM, Calvez V, Günthard HF, et al. 2015 update of the drug resistance mutations in HIV-1［J］. Top Antivir Med, 2015, 23(4):132-141.

[10]Song H, Pavlicek JW, Cai F, et al. Impact of immune escape mutations on HIV-1 fitness in the context of the cognate transmitted/founder genome［J］. Retrovirology, 2012 [2016-11-14]. http://retrovirology.biomedcentral.com/articl es/10.1186/1742-4690-9-89.

[11]趙穩(wěn). HIV-1抗原特異性CTL免疫應(yīng)答影響因素的研究［D］.廣州：廣州醫(yī)學(xué)院，2010.

[12]Song H, Hora B, Bhattacharya T, et al. Reversion and T cell escape mutations compensate the fitness loss of a CD8+T cell escape mutant in their cognate transmitted/founder virus［J］. PLoS One, 2014, 9(7):e102734.

[13]孫冬瑩，邵冰，張春蕾，等. 哈爾濱市男男同性戀HIV-1感染者gag區(qū)基因分析［J/CD］. 中華實驗和臨床感染病雜志（電子版），2015，9(1):14-18.

[14]Shahid A, Olvera A, Anmole G, et al. Consequences of HLAB*13-Associated escape mutations on HIV-1 replication and nef function［J］. J Virol, 2015, 89(22):11557-11571.

[15]饒嫚，蔡衛(wèi)平，魏紹靜，等. 廣東省不同亞型AIDS病人HIV-1gp120V3環(huán)基因變異及其利用輔助受體的情況［J］. 中國艾滋病性病，2015，21(5):354-357.

[16]Edo-Matas D, Rachiger A, Setiawan LC, et al. The evolution of human immunodeficiency virus type-1(HIV-1) envelope molecular properties and coreceptor use at all stages of infection in an HIV-1 donor-recipient pair［J］. Virology, 2012, 422(1):70-80.

[17]劉婷，邵冰，李文靜，等. 哈爾濱市男男同性戀HIV-1感染者env基因V3環(huán)序列分析[J/CD]. 中華實驗和臨床感染病雜志（電子版），2013，7(4):566-570.

[18]Shin Y, Yoon CH, Yang HJ, et al. Functional characteristics of the natural polymorphisms of HIV-1 gp41 in HIV-1 isolates from enfuvirtide-na?ve Korean patients［J］. Arch Virol, 2016, 161(6):1547-1557.

[19]Waheed AA, Ablan SD, Sowder RC, et al. Effect of mutations in the human immunodeficiency virus type 1 protease on cleavage of the gp41 cytoplasmic tail［J］. J Virol, 2010, 84(6):3121-3126.

[20]Mori H, Kojima Y, Kawahata T, et al. Acluster of rapid disease progressors upon primary HIV-1 infection shared a novel variant with mutations in the p6gag/poland pol/vif genes［J］. AIDS, 2015, 29(13):1717-1719.

[21]文小寧，尚紅，韓曉旭，等. HIV-AIDS患者基因變異與疾病關(guān)系的研究［J］. 中國公共衛(wèi)生，2004 20(4):390-391.

[22]Meribe SC, Hasan Z, Mahiti M, et al. Association between a naturally arising polymorphism within a functional region of HIV-1 Nef and disease progression in chronic HIV-1 infection［J］. Arch Virol, 2015, 160(8):2033-2041.

[23]曹穎. HIV-1感染者vpr基因多態(tài)性及臨床意義研究［D］. 北京：北京協(xié)和醫(yī)院，2013.

（2016-11-08收稿 2016-12-02修回）

（責(zé)任編委 王永怡 本文編輯 趙雅琳）

Current status of relationship between gene variation and drug resistance of HIV-1

XU Ya-wen, LI Jian-jian, DONG Xing-qi*
Dali University, Dali, Yunnan 671000, China

The biological characteristics of HIV-1 such as high rate of mutation, recombination and replication make the virus become the complicated quasispecies in AIDS, which brings a lot of problems to the diagnosis, treatment even the development of the vaccine. Although the use of highly active antiretroviral therapy(HAART) has greatly reduced the mortality of AIDS, the growing problem of drug resistance has greatly weakened the role of HAART in inhibiting viral replication and the antiviral treatment effect in the result of the high-speed replication, high genetic variation and drug selection pressure. This review focuses on summarizing research progress about the features of gene variation and the relationship between the drug resistance among HIV-1, so as to guide the clinician to make anti-HIV-1 drug programs and new anti-HIV-1 strategies.

HIV-1; gene variation; drug resistance

R373.51； R962

A

1007-8134(2016)06-0350-04

10.3969/j.issn.1007-8134.2016.06.008

云南省科技計劃項目（2016BC005）

671000，大理大學(xué)（徐亞文）；650301 昆明，云南省傳染病?？漆t(yī)院（李健健、董興齊）

董興齊，E-mail: dongxq8001@126.com

*Corresponding author, E-mail: dongxq8001@126.com