張強，姚慧媛，來漢麟，汪海晴, 阮亮，胡純秋，劉開永

(安徽醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院，合肥 230601)

哺乳期磺胺間甲氧嘧啶暴露對仔鼠骨骼肌蛋白質(zhì)代謝及mTOR信號通路的影響

張強，姚慧媛，來漢麟，汪海晴, 阮亮，胡純秋，劉開永*

(安徽醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院，合肥 230601)

為了研究哺乳期磺胺間甲氧嘧啶(SMM)暴露對仔鼠骨骼肌蛋白質(zhì)代謝及mTOR信號通路的影響，以0、10、50、200 mg/(kg·d)劑量對哺乳期ICR小鼠灌胃給藥直至出生后21 d；第22天斷乳時剖殺部分仔鼠，采集腓腸肌，BCA法測定其腓腸肌總蛋白含量，氨基酸分析儀測定其游離氨基酸水平，RT-PCR法檢測其mTOR信號通路關鍵基因表達水平；另一部分仔鼠以性別分籠喂養(yǎng)至出生后63 d，并每周稱重1次。與對照組比較，結(jié)果表明仔鼠體重無統(tǒng)計學差異(P>0.05)；中劑量組仔鼠腓腸肌谷氨酸(Glu), 甘氨酸(Gly), 丙氨酸(Ala),瓜氨酸(Cit)，蛋氨酸(Met)，組氨酸(His)和鵝肌肽(Ans)含量顯著升高(P< 0.05)；高劑量組的Cit和Ans含量也顯著升高(P< 0.05)，而低劑量組的Cit含量顯著降低(P< 0.01)；仔鼠腓腸肌Mtor,Pi3k3ca,Pi3k3cb,Akt1,Eif4ebp1和Rps6kb1等基因表達無統(tǒng)計學差異(P> 0.05)；腓腸肌總蛋白含量無統(tǒng)計學差異(P > 0.05)。哺乳期SMM暴露對仔鼠骨骼肌氨基酸代謝有一定的改變作用；對mTOR信號通路并未產(chǎn)生顯著影響,為臨床上探討生命早期SMM暴露是否引起代謝性疾病問題提供了毒理學風險評估依據(jù)。

哺乳期；磺胺間甲氧嘧啶；骨骼?。籱TOR

磺胺間甲氧嘧啶(Sulfamonomethoxine, SMM)是長效磺胺類藥物(SAs)中的一員，是我國生產(chǎn)量和使用量最大的獸藥之一[1]。SAs(包含SMM)在城市污水、蔬菜、牛奶、動物性食品等中都有檢出，甚至部分食品中超標[2-4]。長期低劑量攝入SAs會導致機體造血系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、甲狀腺組織等功能異常[5]。

有文獻報導表明哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是調(diào)節(jié)肌肉質(zhì)量的關鍵信號分子,骨骼肌對運動產(chǎn)生的適應性重塑有賴于mTOR信號通路[6-7]。體內(nèi)和體外試驗均表明：氨基酸和胰島素能夠獨立地通過mTOR途徑而調(diào)控蛋白質(zhì)合成[8]。胰島素通過PI3K/Akt/mTOR途徑激活mTOR，進而激活其下游效應器；氨基酸則可能直接激活mTOR的效應分子或通過間接途徑對mTOR通路起作用，從而調(diào)控蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄起始[9]。近年來，動物模型和人群研究表明，生命早期抗生素暴露可能增加其成年肥胖、糖尿病等風險[10]。本課題組前期研究表明哺乳期母鼠接觸SMM升高了子代小鼠的胰島素水平[11]。但是哺乳期SMM暴露是否通過調(diào)控PI3K/Akt/mTOR通路影響仔鼠骨骼肌蛋白質(zhì)的代謝尚未見報導。所以本研究擬觀察哺乳期小鼠SMM暴露是否調(diào)控mTOR信號通路分子基因表達，影響仔鼠骨骼肌蛋白質(zhì)代謝。為其毒理學風險評估提供數(shù)據(jù)依據(jù)。

1 材料與方法：

1.1 儀器和試劑

1.1.1 儀器 A300氨基酸分析儀，德國MembraPure公司；LightCycler480 PCR儀，Roch公司；TU1901紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；酶標儀(美國Thermo MultiSkan3型)。

1.1.2 試劑 SMM原料藥(有效成分含量為99.8%)，安徽華澳生物技術有限公司；氨基酸分析儀 A、B、C、D、E、F、W鋰鹽流動相，茚三酮，德國MembraPure公司；磺基水楊酸(分析純)，天津博迪化工股份有限公司。RNA提取試劑盒LS1000，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒A3500，qPCR試劑盒A6001，美國promega公司；BCA總蛋白測定試劑盒，上海碧云天生物技術有限公司。

1.2 動物來源與處理 SPF級ICR小鼠(8周齡),北京維通利華實驗動物技術有限公司(許可證號：SCXK(京)2012-0001)，雄鼠15只，雌鼠30只；雄鼠體重(30±2)g，雌鼠體重(25±2)g。試驗前適應性喂養(yǎng)1周，溫度23～25 ℃，濕度45%～55%，晝夜均衡，自由飲食。晚8點，24只雌鼠按雌∶雄=2∶1合籠，次日早7點查到陰栓者確定受孕，孕鼠正常喂養(yǎng)直到自然分娩，分娩后，每窩隨機保留雄、雌仔鼠各5只，再將母鼠隨機分入對照組(Control)、低劑量SMM處理組(Low)、中劑量SMM處理組(Middle)、高劑量SMM處理組(High)，分娩后第1天開始，母鼠每天分別灌胃給予生理鹽水和10、50、200 mg/kg SMM(溶于生理鹽水)，染毒至仔鼠出生后第21天(PND21)。第22天時，每組麻醉處死10只仔鼠(5雄5雌)，取其腓腸肌。剩余仔鼠雌、雄分籠正常喂養(yǎng)至PND63。仔鼠每周稱體重1次直至PND63。

1.3 氨基酸的測定

1.3.1 組織前處理方法 稱取0.10 g腓腸肌組織(精確到0.001 g)于1.5 mL離心管中加入0.5 mL 0.01 mol/L HCl水溶液和0.5 mL 0.01 mol/L HCl水溶液，勻漿。4 ℃，5000 r/m離心5 min，取上清0.5 mL，加0.4 mL磺基水楊酸(去蛋白作用)，靜置15 min。4 ℃，10000 r/m離心10 min，取上清，過0.22 μL濾膜，上氨基酸分析儀A300檢測。

1.3.2 氨基酸分析條件 采用柱后茚三酮衍生法分析氨基酸，進樣20 μL。流動相采用鋰鹽體系，分配時間為：A 25 min, B 10 min, C 30 min, D 5 min, E 55 min, F 25 min。

1.4 PI3K/Akt/mTOR通路相關基因的檢測

1.4.1 總RNA提取 腓腸肌組織勻漿后，按照RNA提取試劑盒(Promega)說明書提取仔鼠腓腸肌組織總mRNA。用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。將所有總RNA定量至0.2 μg/μL，分裝樣品，保持于-80 ℃冰箱。

1.4.2 逆轉(zhuǎn)錄 按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行逆轉(zhuǎn)錄反應。(1)反應體系(20 μL體系)：總RNA 5 μL，4.75 μL的無核酸酶水，反轉(zhuǎn)錄10×緩沖液2 μL，MgCl2(25 mM) 4 μL，dNTP混合物(10 mM)2 μL，AMV 反轉(zhuǎn)錄酶0.75 μL，重組的RNasin核糖核酸酶抑制劑 0.5 μL，Oligo(dT)15引物 1 μL。(2)反應條件：70 ℃溫育10min，42 ℃孵育60 min，再95 ℃孵育5 min以終止逆轉(zhuǎn)錄反應。將合成的cDNA保持于-20 ℃冰箱，用于RT-PCR分析。

1.4.3 實時定量PCR (1)配置反應體系中(20 μL體系)：2 μL cDNA，10 μL GoTaq qPCR Master mix，上下游引物(10 μM)各1 μL，無核酸酶水6 μL。(2)反應條件：95 ℃預變性10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 20 s，循環(huán)45次。末次循環(huán)后進行溶解曲線分析。引物使用PubMed在線Primer3軟件設計，由上海生工公司成，各基因引物序列見表1。以磷酸甘油醛脫氧酶基因(Gapdh)作內(nèi)參基因。

表1 各基因引物序列和基因片段長度

續(xù)表1

1.5 總蛋白的提取及測定 取30 mg腓腸肌放入1.5 mL離心管中，加入預冷的RIPA裂解液300 μL，PMSF 3 μL，冰上勻漿，裂解30 min后，4 ℃，15000 g離心15 min，取上清。用BCA法測定總蛋白含量，其原理與步驟見參考文獻[12]。1.6 統(tǒng)計分析 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(x ±SD)表示。所有行為參數(shù)采用單因素方差分析，各組間兩兩比較采用最小顯著差法檢驗，P<0.05視為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 哺乳期SMM暴露對仔鼠體重的影響 雄性和雌性仔鼠在各時期各劑量組間體重差異均無統(tǒng)計學意義，但是與對照組相比，各劑量組有降低趨勢(圖1)。

圖1 哺乳期SMM暴露對仔鼠體重的影響

2.2 哺乳期SMM暴露對斷乳時仔鼠腓腸肌組織游離氨基酸譜的影響 仔鼠斷乳時的腓腸肌組織共檢測出23種游離氨基酸：P-絲氨酸(P-Ser),絲氨酸(Ser), 天冬氨酸(Asn), 谷氨酸(Glu), 甘氨酸(Gly), 丙氨酸(Ala), 瓜氨酸(Cit), 纈氨酸(Val), 蛋氨酸(Met), 異亮氨酸(Ile), 亮氨酸(Leu), 酪氨酸(Tyr), 苯丙氨酸(Phe), H-半胱氨酸(H-Cysteine), 組氨酸(His), 色氨酸(Trp), 肌肽(Car),鵝肌肽(Ans), 羥賴氨酸(Hylys), 鳥氨酸(Orn),賴氨酸(Lys), 精氨酸(Arg),脯氨酸( Pro)。由表2可見，與對照組比較，中劑量組必需氨基酸(EAA)和非必須氨基酸(NEAA)有增高趨勢，高劑量組芳香族氨基酸(AAA)有降低趨勢。與對照組比較，中劑量組的Glu, Gly, Ala, Cit, Met, His, Ans含量顯著升高(P<0.05)，高劑量組的Cit和Ans含量也是顯著升高的(P<0.05)，而低劑量組的Cit含量是顯著降低的(P<0.01)。

表2 哺乳期SMM暴露斷乳時仔鼠腓腸肌游離氨基酸譜

續(xù)表2

與對照組相比，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001

2.3 哺乳期SMM暴露對仔鼠腓腸肌mTOR信號通路相關基因表達的影響 如圖2所示，哺乳期SMM暴露對斷乳時仔鼠腓腸肌mTOR上下游基因的表達情況。由圖可知，Mtor,Pi3k3ca,Pi3k3cb,Akt1,Eif4ebp1和Rps6kb1各劑量組間表達量無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，但是Pi3k3ca,Pi3k3cb和Rps6kb1表達量高劑量組與對照組比較有增高的趨勢；Eif4ebp1表達量低、中劑量組與對照組比較有增高趨勢。

2.4 哺乳期SMM暴露對仔鼠腓腸肌總蛋白含量的影響 斷乳時，各劑量組之間的總蛋白含量沒有顯著差異(P>0.05)，如圖3所示。

3 討論與小結(jié)

在眾多的與蛋白質(zhì)合成相關的信號通路里，mTOR信號通路是公認蛋白合成的主要通路。mTOR在翻譯調(diào)控中占有中心的地位，調(diào)節(jié)蛋白翻譯的起始，主要通過其下游的p70S6K、4E-BP1的活性來控制肌肉的生長[13]。已有研究表明胎盤組織中胰島素可以通過PI3K/AKT/mTOR信號通路對p70S6K進行調(diào)節(jié)，進而可以影響胎兒體重[14]。前期研究表明哺乳期SMM暴露影響子代仔鼠體內(nèi)胰島素水平，而骨骼肌是胰島素發(fā)揮效應的主要靶器官之一，負責餐后 2/3 以上的血糖利用。目前，未發(fā)現(xiàn)該抗生素通過mTOR上下游關鍵信號通路調(diào)節(jié)動物骨骼肌營養(yǎng)代謝、生長發(fā)育或其它相關的研究報告。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)哺乳期SMM暴露引起的仔鼠骨骼肌mTOR信號通路的基因表達沒有統(tǒng)計學差異，同時小鼠的體重也沒有明顯變化，但是mTOR下游信號p70S6K在高劑量組具有上升趨勢。推測mTOR信號通路在仔鼠骨骼肌中基因表達水平?jīng)]有統(tǒng)計學差異，可能與其暴露劑量、暴露時間和仔鼠間接暴露有關。有研究報導，小鼠連續(xù)7周暴露于抗生素也沒有引起小鼠體重增加的改變[15]，與本研究結(jié)果一致。又有研究表明SD成年大鼠連續(xù)以270 mg/kg的劑量內(nèi)服SMM 5周后，大鼠血清甲狀腺素降低，甲狀腺腫大[16]，而以上研究的服用劑量或時間都超過本次試驗。前期研究發(fā)現(xiàn)哺乳期SMM暴露，高劑量組仔鼠血清中的SMM濃度和N4-乙酰化磺胺間甲氧嘧啶(ACSMM)的濃度分別為1.97±0.81 μg/mL 和0.77±0.29 μg/mL[17]，該濃度誘導仔鼠體內(nèi)升高的胰島素水平不足以激活mTOR信號顯著增強。所以同時腓腸肌中的總蛋白含量也沒有發(fā)生變化。

圖2 哺乳期SMM暴露對斷乳時仔鼠腓腸肌mTOR信號通路基因表達的影響。

圖3 哺乳期SMM暴露對仔鼠腓腸肌總蛋白含量的影響。

支鏈氨基酸(BCAA)尤其是Leu能夠刺激肌肉的蛋白質(zhì)合成，在mTOR介導的蛋白質(zhì)合成途徑中發(fā)揮重要作用，雖然研究結(jié)果說明了哺乳期SMM暴露對骨骼肌組織中的氨基酸代謝有一定的改變作用，但是BCAA和Leu的含量沒有統(tǒng)計學差異，這與mTOR的基因表達結(jié)果一致。有報導稱，Gly激活AKT/mTOR信號通路,促進蛋白質(zhì)的合成,是其促進腸上皮細胞增殖及仔豬生長的機理之一[18]。本次研究雖然說明哺乳期SMM暴露導致仔鼠骨骼肌中Gly含量升高，但是mTOR信號通路沒有變化，可能與其他氨基酸的變化有關。如Glu，Glu是構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸之一，但是過量Glu可以引起神經(jīng)元的變性與壞死，其機制有待進一步研究。

大量動物和人群研究表明，抗生素的暴露會引起腸道菌群功能紊亂，尤其是生命早期暴露會對宿主造成長期影響包括肥胖和糖尿病，甚至影響宿主行為和腦功能[19-20]。綜上所述，哺乳期SMM暴露雖然對仔鼠骨骼肌中氨基酸代謝有一定的影響，但不足以引起骨骼肌中mTOR信號通路發(fā)生明顯變化，也未引起小鼠體重的變化。為臨床上探討生命早期SMM暴露是否引起健康問題如肥胖和哺乳期暴露SMM的毒理學風險評估提供科學依據(jù)。同時也為進一步探討SMM誘導mTOR信號通路變化的條件和分子機制提供指導依據(jù)。

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(編輯：陳希)

Effects of Lactational Exposure to Sulfamonomethoxinon Keletal Muscle Protein Metabolism and mTOR Signaling Pathway in Mice Offspring

ZHANG Qiang,YAO Hui-yuan, LAI Han-lin, WANG Hai-qing,RUAN Liang, HU Chun-qiu, LIU Kai-yong*

(SchoolofPublicHealth,AnhuiMedicalUniversity,Hefei230601，China)

The aim of this study was to explore the effects of lactating mice exposed to sulfamonomethoxine (SMM) on skeletal muscle protein metabolism and the mTOR signaling pathway in offspring muscle.The lactating mice were gavaged with 0, 10, 50, 200 mg/(kg·d) SMM for 21 d. On postnatal day(PND) 22, some of the offspring were sacrificed and the gastrocnemius muscles were collected. And then the other offspring were separated with gender, raised normally until PND 63, weighted once every week.The composition of free amino acids in muscle was analyzed by the automatic amino acid analyzer, the key gene expressions of mTOR pathwaywere quantitatively determined using real-time polymerase chain; Finally, the contents of total protein were determined by bicinchoninic acid method in muscle.Compared with controls, the exposure to SMM on body weight of the offspring made no significant difference during the experimental period (P>0.05). And at PND 22, the concentrations of Glu, Gly, Ala, Cit, Met, His and Ans were increased significantly in middle dose group (P<0.05), the ones of Cit and Ans were increased significantly at the high dose (P<0.05), but the one of Cit was notably decreased in the low dose group (P<0.01). The expressionsofMtor,Pi3k3ca,Pi3k3cb,Akt1,Eif4ebp1 andRps6kb1 were not changed significantly (P>0.05). Moreover, the content of total protein in muscle were not changed in the treated groups.Together, lactating exposure to SMM altered the free amino acid profilingin offspring skeletal muscle, but the mTOR signaling pathway was not obviouslyaffected, all of whichwill provide a scientific basis for toxiclogic risk assessment ofcausing metabolic problems when in early lifeexposure to SMM.

lactation; sulfamonomethoxine; skeletal muscle; mTOR

國家自然科學基金項目(81202209)；安徽省高等學校優(yōu)秀青年人才基金(2012SQRL075ZD)；安徽醫(yī)科大學中青年學術骨干資助基金(2012051)

2015-11-22

A

1002-1280 (2016) 01-0036-07

S859.795