李曉潔

（泰州職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，江蘇泰州225300）

單細(xì)胞測(cè)序在腫瘤研究中的應(yīng)用

李曉潔

（泰州職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，江蘇泰州225300）

腫瘤是一種基因疾病，其發(fā)病機(jī)制包括單核苷酸突變、拷貝數(shù)變異、插入/缺失等。人類對(duì)腫瘤經(jīng)過數(shù)十年的研究，未獲得突破性進(jìn)展。腫瘤研究的關(guān)鍵是理解基因的改變?cè)谀[瘤發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮的作用。近些年單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)的發(fā)展為探尋腫瘤發(fā)生中基因的改變提供了有力的工具。現(xiàn)通過腫瘤標(biāo)志運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)分選單個(gè)腫瘤細(xì)胞，并通過細(xì)胞測(cè)序獲得大量信息，為腫瘤的治療提出一個(gè)新方法—個(gè)體化治療。

測(cè)序；腫瘤；個(gè)體化治療；拷貝數(shù)變異

腫瘤已經(jīng)成為威脅人類生命的重要?dú)⑹郑?-5］，而且臨床數(shù)據(jù)顯示多種腫瘤的發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升趨勢(shì)［6］，此外多種腫瘤的發(fā)生呈現(xiàn)年輕化趨勢(shì)［7］。從分子生物學(xué)的角度，腫瘤被定義為由于染色體上的DNA損傷致使基因突變，導(dǎo)致細(xì)胞的生長(zhǎng)失控、缺乏分化而異常增生，常侵犯周圍的正常組織和器官，最終可散布全身。在過去的幾十年，腫瘤研究和治療沒有獲得突破性進(jìn)展［8］，其重要原因就是無法明確腫瘤發(fā)生的具體原因。腫瘤作為一種基因疾病，其發(fā)病過程中包括一系列的基因變化。Renato Dulbecco［9］指出：人類如果想更好地了解腫瘤，必須關(guān)注腫瘤細(xì)胞的基因組。2005年，美國(guó)宣布實(shí)施“腫瘤基因組計(jì)劃”，并規(guī)劃在未來13年里找出肺癌、腦癌、卵巢癌等所有困擾人類的癌癥基因。基因組測(cè)序是一項(xiàng)繁冗的工作，但是隨著2009年基因組外顯子測(cè)序技術(shù)的成熟［10］刪除對(duì)癌癥研究沒有意義的基因組序列，精簡(jiǎn)了測(cè)序工作，提升了效率。腫瘤基因組測(cè)序，首先是獲取、純化腫瘤細(xì)胞。但除皮膚癌外，腫瘤多發(fā)生在機(jī)體的深部，如胸腔、腹腔、顱腔等，即使在B超、CT等引導(dǎo)下進(jìn)行穿刺取病理組織，也會(huì)造成相對(duì)較大的創(chuàng)傷，且不適宜連續(xù)多次取組織隨時(shí)監(jiān)測(cè)疾病的發(fā)展過程。但腫瘤經(jīng)常在出現(xiàn)臨床癥狀前血液中已經(jīng)有循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cell，CTC），因此通過抽取外周靜脈血可以捕獲腫瘤細(xì)胞。此外，臨床樣本與生物學(xué)樣本有著極大的不同，臨床樣本混合多種細(xì)胞，而生物學(xué)樣本幾乎只含有單純的腫瘤細(xì)胞［11］。

1　單個(gè)腫瘤細(xì)胞的捕獲

在腫瘤標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)前，研究者多是借助顯微切割純化腫瘤細(xì)胞［12-14］，且技術(shù)逐步由手工操作提升為機(jī)械化操作。Zhuang Z等在高倍顯微鏡下利用纖細(xì)玻璃針成功分離純化遺傳性斑痣性錯(cuò)構(gòu)瘤細(xì)胞，此項(xiàng)操作對(duì)操作者要求甚高，主要是手工操作，難以廣泛使用。Lee JY等則采用在高倍顯微鏡下，采用手工與機(jī)械相結(jié)合的工藝來純化腫瘤細(xì)胞，該項(xiàng)技術(shù)在一定程度上降低了對(duì)操作者技能的依賴。1998年，美國(guó)Litta實(shí)驗(yàn)室開發(fā)激光捕獲顯微切割（LMC），其優(yōu)點(diǎn)是無接觸切割、樣品無污染、切割精確度高，但激光捕獲顯微切割不適合大規(guī)模分離單細(xì)胞。隨著腫瘤標(biāo)志物的不斷發(fā)現(xiàn)及免疫技術(shù)的發(fā)展，現(xiàn)多采用腫瘤標(biāo)志物利用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分選單個(gè)腫瘤細(xì)胞。Xiaohui Ni［15］等利用細(xì)胞研究試劑盒及DAPI、Cyto、CD45等在外周循環(huán)靜脈血中篩選肺癌細(xì)胞，選白細(xì)胞作為陰性對(duì)照，白細(xì)胞為DAPI+、Cyto-、CD45+，腫瘤細(xì)胞為DAPI+、Cyto+、CD45-。Ley等［16］利用高級(jí)流式細(xì)胞術(shù)分離出細(xì)胞表面CD13、CD 33和CD117陽性，但CD34陰性的腫瘤細(xì)胞，研究者捕獲腫瘤細(xì)胞對(duì)其進(jìn)行測(cè)序。

2　單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)的演變

1994年Vasioukhin V［17］等報(bào)告了在外周血中的DNA碎片基因分析，2006年Watt［18］等完成了人類表皮干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。2009年Tang［19］等發(fā)表了關(guān)于單細(xì)胞全轉(zhuǎn)錄組分析方法，使單細(xì)胞測(cè)序逐漸走向完善。Leary RJ［20］、Dawson SJ［21］和Murtaza M［22］等已經(jīng)將測(cè)序工作擴(kuò)展到整個(gè)基因組序列。

3　單細(xì)胞測(cè)序使治療個(gè)體化

Xiaohui Ni［15］采用單細(xì)胞測(cè)序研究了一組病理類型同為肺腺癌的患者，通過患者循環(huán)腫瘤細(xì)胞測(cè)序發(fā)現(xiàn)：其中一位表皮生長(zhǎng)因子受體的基因上存在缺失，缺失的位點(diǎn)是746位的賴氨酸至750位的丙氨酸，該位點(diǎn)是酪氨酸激酶抑制劑的靶點(diǎn)。該位點(diǎn)的缺失會(huì)導(dǎo)致蛋白酪氨酸激酶抑制劑類抗腫瘤藥物如吉非替尼、索拉菲尼、范得他尼等藥效減弱甚至無效。另外幾位患者則發(fā)現(xiàn)突變位點(diǎn)在磷脂酰肌醇-3激酶的α-催化亞基上，其545位的谷氨酰胺被賴氨酸取代，這一位點(diǎn)的突變可能參與厄洛替尼的藥物抵抗；腫瘤蛋白53（TP53）155位的蘇氨酸被異亮氨酸取代，155位位于TP53的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域具有核酸內(nèi)切酶的活性，可切除錯(cuò)配核苷酸，結(jié)合并調(diào)節(jié)核酸內(nèi)切酶修復(fù)因子XPB和XPD的活性，該區(qū)域的突變可能會(huì)導(dǎo)致堿基錯(cuò)配，TP53原有的抑制腫瘤的能力喪失；視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤（RB1）基因在320位提前終止，RB1作為細(xì)胞周期的負(fù)調(diào)控因子，與E2F結(jié)合，從而阻止細(xì)胞通過G1-S，導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯，當(dāng)該基因提前終止時(shí)，則會(huì)喪失其負(fù)調(diào)控的作用。根據(jù)測(cè)序結(jié)果當(dāng)TP53和RB1同時(shí)突變，臨床采用依托泊苷聯(lián)合順鉑進(jìn)行化療可以取得顯著的臨床效果。這一發(fā)現(xiàn)解釋了臨床上相同病理類型，但對(duì)化療藥的敏感性并不一致的現(xiàn)象。Teresa Davoli等發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)時(shí)間單倍劑量不足或者腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物不敏感可以導(dǎo)致腫瘤基因重塑［23］。此外，同一基因在不同腫瘤類型其突變也不盡相同。例如具有相似流行病學(xué)特點(diǎn)的乳腺癌和結(jié)腸癌，P53突變譜主要表現(xiàn)為：在結(jié)腸癌中G：CA：T轉(zhuǎn)換占79%，而且50%以上轉(zhuǎn)換突變發(fā)生在3～5的結(jié)構(gòu)域的CpG，，而乳腺癌僅有13%的轉(zhuǎn)換突變發(fā)生在CpG。因此根據(jù)個(gè)體腫瘤細(xì)胞測(cè)序結(jié)果，選擇個(gè)體化治療方式將是未來腫瘤治療的一個(gè)方向。

4　腫瘤基因在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中不斷變化

為觀測(cè)在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中，腫瘤細(xì)胞的基因是否在不斷發(fā)生變化，分別在化療前、一線化療藥物依托撲沙聯(lián)合順鉑化療，并出現(xiàn)一定療效后、一線化療藥物治療失敗，導(dǎo)致疾病發(fā)展，采用二線化療藥物—托泊替康化療后從外周血捕獲腫瘤細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序，并觀察基因拷貝數(shù)目變化（CNV）、單核苷酸突變（SNVs）、插入/缺失（INDELs）等。測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)：?jiǎn)魏塑账嵬蛔儭⒉迦?缺失等在不同時(shí)期循環(huán)腫瘤細(xì)胞中會(huì)發(fā)生變化。原位腫瘤、循環(huán)中腫瘤細(xì)胞、轉(zhuǎn)移位點(diǎn)腫瘤細(xì)胞三者進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)：與原位腫瘤突變的核苷酸位點(diǎn)相比，循環(huán)中的腫瘤細(xì)胞和轉(zhuǎn)移位點(diǎn)腫瘤細(xì)胞突變的核苷酸位點(diǎn)更為相似。一名肺癌腺癌發(fā)生肝轉(zhuǎn)移的病人，其中RB1發(fā)生的突變僅僅發(fā)現(xiàn)在循環(huán)中的腫瘤細(xì)胞和肝內(nèi)轉(zhuǎn)移灶的腫瘤細(xì)胞，原位腫瘤細(xì)胞并沒有發(fā)生該位點(diǎn)的突變。后經(jīng)過多次認(rèn)證證實(shí)這一結(jié)果是可靠的，但是基因拷貝變異不會(huì)發(fā)生變化。

拷貝數(shù)變異在正常人的基因組序列中也存在，其和多種基因疾病相關(guān)?？截悢?shù)變異是腫瘤基因改變的一個(gè)重要形式［24-26］。單細(xì)胞測(cè)序發(fā)現(xiàn)拷貝數(shù)變異重復(fù)性良好。相同病理類型拷貝數(shù)變異相似。例如人白細(xì)胞抗原（HLA），在6號(hào)短臂出現(xiàn)拷貝數(shù)增益與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［27］。在肺癌中檢測(cè)，同為腺癌拷貝變異相似，但不同亞型（例如腺癌和小細(xì)胞肺癌）拷貝數(shù)變異不同。目前在肺癌發(fā)現(xiàn)拷貝數(shù)的增加和腫瘤的惡性度呈現(xiàn)正相關(guān)。因此通過監(jiān)測(cè)拷貝數(shù)變異可以監(jiān)測(cè)腫瘤有無發(fā)生惡性度轉(zhuǎn)變。

5　結(jié)語

盡管通過單細(xì)胞測(cè)序在一定程度上揭示了腫瘤發(fā)生、發(fā)展的信息，但是單個(gè)腫瘤細(xì)胞的捕獲技術(shù)仍有待提高。目前在外周血捕獲單個(gè)腫瘤細(xì)胞需要結(jié)合多種方式和手段，且不適合大規(guī)模的選?。灰话?0ml血液中僅含有1-10個(gè)（CTC），樣本量過低，此外血液中含有巨核細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、未成熟的血細(xì)胞，容易被誤認(rèn)為CTC，且初步無法鑒定該細(xì)胞是來源于原位腫瘤還是轉(zhuǎn)移處的腫瘤細(xì)胞；目前單細(xì)胞測(cè)序費(fèi)用昂貴，難以應(yīng)用于臨床，因此個(gè)體化治療難以推進(jìn)。此外，與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)的拷貝數(shù)變異，經(jīng)過化療并不發(fā)生變化，如何改變拷貝數(shù)變異使得腫瘤惡性度降低目前也尚未解決。

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（責(zé)任編輯劉紅）

Progress in Sequencing Single Cancer Cell

LI Xiao-jie
（Taizhou Polytechnic College，Taizhou Jiangsu 225300，China）

As a genomic disease，cancer involves a series of changes in the genome.These genomic alterations include copy number variations（CNVs），single-nucleotide variations（SNVs），and insertions/deletions（INDELs）. Regardless of the concentrated efforts in the past decades，the key driving genomic alterations responsible for cancer are still elusive.The key of cancer research is how do the changes work.In recent years，the development of Sequencing single cancer cell provides a powerful tool to devise the changes of cancer.Cells were captured with the flow cytometry using tumor maker.genomic analyses of single cancer cell could provide more pertinent information and a new kind of method to personalized treatment of cancer.

sequencing；tumor；personalized therapy；copy number variations（CNVs）

R730.4

A

1671-0142（2016）04-0062-03

李曉潔（1981-），女，河北唐山人，講師.

2013年度江蘇省衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)教育研究立項(xiàng)課題（J201310，課題負(fù)責(zé)人：李曉潔）.