汪海濤，楊 波，盧學(xué)春，胡 博，楊紅旗，羅龍龍，林 潔，李素霞，范 輝，喬春霞，王 巍，郎曉玲，耿 晶，黎 燕，吳曉雄，呂 明，朱宏麗

（1.中國人民解放軍總醫(yī)院老年血液科，北京 100853；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所免疫學(xué)研究室，北京 100850；3.中國人民解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院血液科，北京 100048；4.北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院胸外科，北京 100142）

氨磷汀對人巨核細(xì)胞白血病Dami細(xì)胞增殖及分化的影響

汪海濤1，2，3，楊 波1，盧學(xué)春1，胡 博2，4，楊紅旗1，羅龍龍2，林 潔1，李素霞1，范 輝1，喬春霞2，王 巍2，郎曉玲2，耿 晶2，黎 燕2，吳曉雄3，呂 明2，朱宏麗1

（1.中國人民解放軍總醫(yī)院老年血液科，北京 100853；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所免疫學(xué)研究室，北京 100850；3.中國人民解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院血液科，北京 100048；4.北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院胸外科，北京 100142）

目的探討氨磷?。ㄒ懒蛄姿幔珹mf）對人巨核細(xì)胞白血病Dami細(xì)胞分化的影響。方法Amf 0.01 ～5.0 mmol·L-1分別處理Dami細(xì)胞12 d，每天光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，計數(shù)Dami細(xì)胞數(shù)量，繪制增殖曲線；第12天，計數(shù)直徑>20 μm細(xì)胞數(shù)量，透射電鏡觀察Dami細(xì)胞血小板分界膜系統(tǒng)的形成，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞DNA倍體化及細(xì)胞表面抗原CD33，CD34和CD41a的變化。結(jié)果Amf 0.1 ～1.0 mmol·L-1促進(jìn)Dami細(xì)胞分化；Amf>1.0 mmol·L-1時抑制Dami細(xì)胞增殖，Amf 1.0 mmol·L-1作用12 d后光鏡下觀察到細(xì)胞體積增大，直徑>20 μm細(xì)胞比例增加24.6%（P<0.01）；透射電鏡觀察可見細(xì)胞出現(xiàn)血小板分界膜系統(tǒng)；流式細(xì)胞儀發(fā)現(xiàn)，髓系細(xì)胞分化抗原CD33表達(dá)減少13.6%；巨核細(xì)胞相關(guān)分化抗原CD41a表達(dá)增加11.9%（P< 0.05）；DNA倍體分析發(fā)現(xiàn)，實驗組4N和8N細(xì)胞分別增至31.56%和8.83%（P<0.01），并出現(xiàn)16N的超多倍體細(xì)胞（3.43%）。結(jié)論Amf>1.0 mmol·L-1時抑制Dami細(xì)胞增殖，0.1 ～1.0 mmol·L-1時誘導(dǎo)Dami細(xì)胞向成熟巨核細(xì)胞分化。

氨磷??；Dami細(xì)胞；細(xì)胞分化；CD41a；DNA倍體化

氨磷?。ㄒ懒蛄姿幔琣mifostine，Amf），化學(xué)名2-（3-氨基丙胺基）-乙硫醇磷酸酯，于20世紀(jì)60年代由美國Walter Reed陸軍研究所研發(fā)，用于核輻射損傷的防護(hù)。作為一種前體藥物，Amf只有在細(xì)胞膜堿性磷酸酶作用下脫去磷酸基，生成游離硫醇后才有活性［1］。目前，Amf也用于減輕放化療過程中腎、骨髓、黏膜、耳及神經(jīng)系統(tǒng)毒性［2-4］。

臨床研究發(fā)現(xiàn)，Amf對血細(xì)胞減少性疾病，如骨髓增生異常綜合征（myelodysplastic syndrome，MDS）和免疫性血小板減少癥（immune thrombocytopenia，ITP）有一定療效，2種均有巨核細(xì)胞的病態(tài)造血或分化成熟障礙，Amf治療后患者血小板有不同水平的升高［5-8］。這種作用并不能用Amf經(jīng)典的堿性磷酸酶途徑解釋，我們設(shè)想Amf可能通過促進(jìn)巨核細(xì)胞的分化成熟，從而對MDS和ITP等存在巨核細(xì)胞分化障礙的疾病起到治療作用。

為了驗證Amf對Dami細(xì)胞的分化作用，本研究先用不同濃度Amf誘導(dǎo)Dami細(xì)胞，得到Amf促進(jìn)Dami細(xì)胞分化的合適濃度，然后從細(xì)胞形態(tài)學(xué)，分化抗原和DNA倍體化3個方面驗證了Amf對Dami細(xì)胞分化的作用。

1 材料與方法

1.1藥物、細(xì)胞、試劑和儀器

Amf，純度>99%，大連卓悅美羅藥業(yè)有限公司，4℃避光保存，每次使用時配制成液體。Dami細(xì)胞來源于美國ATCC公司，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所免疫學(xué)研究室凍存。RPMI 1640培養(yǎng)基，美國Hyclone公司；5%戊二醛，美國Sigma公司；小鼠抗人CD41a-PE抗體（批號：340931）和碘化丙啶（propidium iodide，PI）（批號：P4170），美國Santa Cruz公司；小鼠抗人CD33-PC5(批號:53199)、小鼠抗人CD34-PE抗體(批號:3569)，美國CST公司。3111型CO2培養(yǎng)箱，美國Thermo公司；CK40型倒置熒光顯微鏡，日本Olympus公司；5417R型高速離心機(jī)，德國Eppendorf公司；流式細(xì)胞儀，美國BD公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)及增殖檢測

Dami細(xì)胞在含10%加熱滅活的胎牛血清和雙抗的RPMI 1640培養(yǎng)基中呈懸浮生長，37℃，含5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)。將細(xì)胞濃度調(diào)整為5×108L-1，于6孔板中培養(yǎng)，分別調(diào)整Amf濃度為0.01，0.1，1.0和5.0 mmol·L-1，每2 d傳代1次，每天計Dami細(xì)胞數(shù)，連續(xù)12 d，繪制增殖曲線。

1.3光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)

Amf 1.0 mmol·L-1誘導(dǎo)Dami細(xì)胞0，4，8和12 d，于倒置顯微鏡下觀察，隨機(jī)取3個視野，記錄細(xì)胞直徑>20 μm的細(xì)胞數(shù)量，并照相記錄。

1.4透射電鏡觀察細(xì)胞血小板分界膜系統(tǒng)形成

血小板分界膜系統(tǒng)由巨核細(xì)胞膜深度凹陷形成，是分割形成血小板的前提條件，也是巨核細(xì)胞成熟的標(biāo)志。在Amf 1.0 mmol·L-1誘導(dǎo)Dami細(xì)胞第12天，取2×106細(xì)胞，5%戊二醛固定，磷酸鹽緩沖液100 mmol·L-1（pH=7.2）洗1遍，四氧化鋨固定后溶于環(huán)氧樹脂膠，切片后進(jìn)行醋酸鈾和檸檬酸鉛染色，透射電鏡觀察。

1.5流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞CD33，CD34和CD41a的表達(dá)

在Amf 1.0 mmol·L-1誘導(dǎo)的第12天，收集約1× 106細(xì)胞于EP管，4℃預(yù)冷的PBS洗1遍，分別加入100 μL小鼠抗人CD41a/CD33/CD34抗體，槍尖吹勻，37℃避光孵育30 min；PBS洗3遍，流式細(xì)胞儀檢測。

其次，政策的系統(tǒng)性和配套性增強(qiáng)。任何一個政策都不是孤立存在的，縱觀四十年來養(yǎng)老服務(wù)政策的出臺，發(fā)現(xiàn)養(yǎng)老服務(wù)政策的系統(tǒng)性越來越強(qiáng)，通常是圍繞一個主題的政策會有一系列的《意見》《通知》作為支撐和配套，形成一個文件群，以文件的形式將宏觀導(dǎo)向、發(fā)展思路、具體規(guī)定和實際做法制度化，既保證了政策的連貫性和延續(xù)性，也推動了宏觀政策的具體實施和落地見效，增強(qiáng)了政策制度的針對性、協(xié)調(diào)性、系統(tǒng)性。

1.6流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞DNA倍體化

在Amf 1.0 mmol·L-1誘導(dǎo)的第0，4，8和12天分別收集2×106細(xì)胞，-20℃預(yù)冷的PBS洗1遍，加入75%乙醇2 mL，-20℃固定24 h；PBS洗1遍，加RNA酶1 g·L-1100 μL，37℃避光30 min，加入PI染液0.1 g·L-1100 μL，室溫避光5 min，流式細(xì)胞儀檢測，Cell quest pro軟件分析細(xì)胞倍體化。

1.7統(tǒng)計學(xué)分析

使用SPSS13.0軟件包分析，計量資料用x±s表示，兩組之間均數(shù)比較采用t檢驗，等級資料用Wilcoxon檢驗，P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1氨磷汀對Dami細(xì)胞增殖的影響

增殖曲線結(jié)果顯示（圖1），和正常對照組相比，Amf濃度<0.01 mmol·L-1時，Dami細(xì)胞增殖不受影響；而>1.0 mmol·L-1時，Dami細(xì)胞增殖受到抑制（P<0.05）。

Fig.1 Effect of amifostine（Amf）on proliferation of Dami cells determined by cell counting.x±s，n=3.*P< 0.05，compared with normal control group.

2.2氨磷汀對Dami細(xì)胞形態(tài)的影響

Fig.2 Effect of Amf 1.0 mmol·L-1on morphology of Dami cells（A）and proportion of Dami cells with diameter>20 μm（B）.See Fig.1 for the treatment.x±s，n=3. **P<0.01，compared with normal control group.

Dami細(xì)胞向巨核細(xì)胞分化過程中，細(xì)胞體積逐漸增大，并>20 μm［9］。顯微鏡下隨機(jī)選取3個視野，計數(shù)直徑>20 μm細(xì)胞的比例（圖2），和正常對照組相比，Amf 1.0 mmol·L-1誘導(dǎo)12 d后，直徑>20 μm的Dami細(xì)胞比例由0.2%增加至24.8%（P<0.01）。后續(xù)實驗選用Amf 1.0 mmol·L-1誘導(dǎo)Dami細(xì)胞分化。

2.3氨磷汀對血小板分界膜系統(tǒng)形成的影響

透射電鏡觀察血小板分界膜系統(tǒng)（圖3），結(jié)果顯示，與正常對照細(xì)胞相比，在Amf 1.0 mmol·L-1處理第12天，電鏡觀察見Dami細(xì)胞胞體明顯增大，直徑可達(dá)約100 μm，細(xì)胞邊緣不規(guī)則，呈海綿狀。提示Amf能促進(jìn)Dami細(xì)胞向成熟巨核細(xì)胞分化。

Fig.3 Effect of Amf 1.0 mmol·L-1for 12 d on platelet demarcation membrane system in Dami cells by transmission electron microscopy.Arrows indicate the platelet demarcation membrane system.

2.4氨磷汀對Dami細(xì)胞CD33，CD34和CD41a表達(dá)的影響

Fig.4 Effect of Amf 1.0 mmol·L-1for 12 d on expression of CD33（A），CD34（A）and CD41a（B）on Dami cell surface by flow cytometric analysis.C was the semi-quantitative result of A and B.x±s，n=3.*P<0.05，compared with normal control group.

流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果（圖4）顯示，兩組Dami細(xì)胞表面CD34表達(dá)均很弱，<0.1%，未作比較。與正常對照細(xì)胞相比，Amf 1.0 mmol·L-1誘導(dǎo)第12天，Dami細(xì)胞表面髓系抗原CD33的表達(dá)減少13.6%（P< 0.05），而巨核細(xì)胞成熟相關(guān)抗原CD41a的表達(dá)增加11.9%（P<0.05）。

2.5氨磷汀對Dami細(xì)胞DNA倍體化的影響

細(xì)胞DNA倍體分布檢測結(jié)果（圖5）表明，在Amf 1.0 mmol·L-1誘導(dǎo)的第0天（正常對照組）以2N和4N為主，分別占62.46%和15.63%，而8N和16N細(xì)胞的比例分別占0.21%和0.02%。隨著時間延長（第4，8和12天），多倍體細(xì)胞逐漸增加；在誘導(dǎo)第12天，與正常對照組相比，4N和8N細(xì)胞比例分別增加至31.56%和8.83%，并出現(xiàn)16N細(xì)胞，占3.43%（P<0.01）。

Fig.5 Effect of Amf 1.0 mmol·L-1for indicated number of days on DNA ploidy in Dami cells.B was the semiquantitative result of A.x±s，n=3.*P<0.05，**P<0.01，compared with normal control（0 d）group.

3 討論

本研究單獨應(yīng)用Amf誘導(dǎo)Dami細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)Amf具有促進(jìn)Dami細(xì)胞分化的作用。有關(guān)Amf促進(jìn)巨核細(xì)胞分化作用最早由Kashiwakura等［10］報道，他們用Amf聯(lián)合血小板生成素（thrombopoietin，TPO）在體外誘導(dǎo)胎盤及臍帶血CD34+細(xì)胞向巨核細(xì)胞分化，發(fā)現(xiàn)和TPO組相比，巨核系祖細(xì)胞數(shù)量分別增加70倍和83倍。但他們采用Amf聯(lián)合TPO誘導(dǎo)細(xì)胞分化，不能直接說明Amf具有促進(jìn)細(xì)胞分化的作用。

本研究Dami細(xì)胞直徑約在10 ～15 μm，處于原始巨核細(xì)胞階段，在Amf處理第4天，開始出現(xiàn)4N細(xì)胞，同時細(xì)胞體積增大至>20 μm。在處理第12天，直徑>20 μm細(xì)胞比例達(dá)24.8%，倍體在>4N細(xì)胞占43.8%，且透射電鏡觀察到血小板分界膜系統(tǒng)出現(xiàn)，說明Amf具有誘導(dǎo)Dami細(xì)胞向成熟巨核細(xì)胞分化的作用。成熟巨核細(xì)胞由造血干細(xì)胞經(jīng)巨核/紅系祖細(xì)胞、巨核系祖細(xì)胞、原始巨核細(xì)胞、幼巨核細(xì)胞和顆粒型巨核細(xì)胞等階段分化而來。巨核細(xì)胞的成熟過程伴隨著細(xì)胞體積及染色體倍體的增加。據(jù)報道，原始巨核細(xì)胞染色體倍體為2N，平均直徑約在20 μm，而幼稚巨核細(xì)胞階段開始出現(xiàn)多倍體，最多達(dá)8N，細(xì)胞直徑增大至約30 μm；成熟巨核細(xì)胞（顆粒型或產(chǎn)板型）倍體通常>32N，細(xì)胞體積巨大，>40 μm，且出現(xiàn)血小板分界膜系統(tǒng)［9，11］。本研究Dami細(xì)胞經(jīng)過Amf 1.0 mmol·L-1處理12 d后，細(xì)胞體積增大，倍體增加，并出現(xiàn)血小板分界膜系統(tǒng)，與文獻(xiàn)［9，11］報道相符。

人紅系和巨核系有著共同的祖細(xì)胞，即巨/紅系祖細(xì)胞，表型為Lin-CD34+CD33+D38+IL3Rα-CD45RA-［12］，當(dāng)分化為成熟巨核細(xì)胞時，細(xì)胞表面CD33和CD34的表達(dá)降低，而CD41a，CD42b，CD45和CDw32等表達(dá)升高［11，13］。其中，CD41a是巨核細(xì)胞分化成熟的特征性分子標(biāo)志，在巨核細(xì)胞分化過程中始終表達(dá)，其表達(dá)強(qiáng)度和巨核細(xì)胞分化成熟程度相關(guān)［14］。本研究分別在Amf誘導(dǎo)的第0，4，8和12天，通過流式細(xì)胞儀檢測Dami細(xì)胞表面CD41a表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)隨著Amf處理時間延長，Dami細(xì)胞表面CD41a表達(dá)強(qiáng)度逐漸增加，而CD33表達(dá)強(qiáng)度逐漸降低，符合巨核細(xì)胞的分化規(guī)律。

本研究結(jié)果表明，Amf具有誘導(dǎo)Dami細(xì)胞分化的作用，但Amf促進(jìn)Dami細(xì)胞分化的分子機(jī)制尚不清楚。下一步將通過基因芯片技術(shù)檢測Amf處理前后Dami細(xì)胞基因表達(dá)譜差異，進(jìn)一步研究Amf誘導(dǎo)Dami細(xì)胞分化的機(jī)制，為臨床應(yīng)用Amf治療血小板生成障礙性疾病提供理論依據(jù)。

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Effect of amifostine on proliferation and differentiation of human megakaryocyte Dami cells

WANG Hai-tao1，2，3，YANG Bo1，LU Xue-chun1，HU Bo2，4，YANG Hong-qi1，LUO Long-long2，LIN Jie1，LI Su-xia1，F(xiàn)AN Hui1，QIAO Chun-xia2，WANG Wei2，LANG Xiao-ling2，GENG Jing2，LI Yan2，WU Xiao-xiong3，LYU Ming2，ZHU Hong-li1
（1.Department of Geriatric Hematology，Chinese PLA General Hospital，Beijing 100853，China；2.Laboratory of Immunology，Institute of Basic Medical Sciences，Academy of Military Medical Sciences，Beijing 100850，China；3.Department of Hematology，the First Affiliated Hospital of Chinese PLA General Hospital，Beijing 100048，China；4.Department of Thoracic Surgery，Peking University Cancer Hospital&Institute，Beijing 100142，China）

OBJECTIVE To investigate the effect of amifostine（Amf）on the differentiation of human megakaryocyte cell line-Dami.METHODS Dami cells were treated with Amf 0.01-5.0 mmol·L-1for 12 d. Dami cells were counted every day for the growth curve：only cells with a diameter>20 μm.The platelet demarcation membrane system was observed by transmission electron microscopy.The expression of CD33，CD34，CD41a and DNA ploidy was detected by flow cytometry.RESULTS Amf 0.1-1.0 mmol·L-1promoted the differentiation of Dami cells，but inhibited their proliferation at a concentration>1.0 mmol·L-1. When these cells were treated with Amf 1.0 mmol·L-1for 12 d，the platelet demarcation membrane system was observed，the percentage of cells with a diameter>20 μm was increased by 24.6%（P< 0.01），the expression of CD41a was increased by 11.9%，while the expression of CD33 was decreased by 13.6%（P<0.05）.Polyploidy cells（16N）were observed，and 4N，8N and 16N cells were increased to 31.56%，8.83%and 3.43%，respectively（P<0.05）.CONCLUSION Amf 0.1-1.0 mmol·L-1can promote the differentiation of Dami cells，but inhibit their proliferation at a high concentration（>1.0 mmol·L-1）.

amifostine；Dami cells；cell differentiation；CD41a；DNA ploidy

s：ZHU Hong-li，E-mail：bjzhl202_cn@sina.com，Tel：（010）66876267；LYU Ming，E-mail：lm62033@ 163.com，Tel：（010）66931325；

R979.6，R973

A

1000-3002-（2016）07-0723-05

10.3867/j.issn.1000-3002.2016.07.003

Foundation item：The project supported by National Natural Science Foundation of China（81273597）；Innovation and Nursery Foundation of Chinese PLA General Hospital（15KMM28）；and Military Health Care Foundation（13BJ247）

2016-04-12接受日期：2016-06-22）

（本文編輯：賀云霞）

國家自然科學(xué)基金項目（81273597）；解放軍總醫(yī)院科技創(chuàng)新苗圃基金（15KMM28）；全軍保健基金（13BJ247）

汪海濤，男，碩士，主要從事血液病的基礎(chǔ)與臨床研究，E-mail：ws_ht@126.com；朱宏麗，女，主任醫(yī)師，主要從事老年血液病的基礎(chǔ)與臨床研究。

朱宏麗，E-mail：bjzhl202_cn@sina.com，Tel：（010）66876267；呂 明，Tel：（010）66931325，E-mail：lm62033@163.com